CC BY
12MEDICAL SCIENCES
ВЛИЯНИЕ АФОБАЗОЛА И РЕГУЛЯТОРОВ ЭКСПРЕССИИ ENOS НА ПОКАЗАТЕЛИ СИСТЕМЫ ПОЛ - АОС И СОДЕРЖАНИЕ ОКСИДА АЗОТА ПРИ НИКЕЛЕВОЙ ИНТОКСИКАЦИИ В
ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Дзугкоев С.Г.
Институт биомедицинских исследований - филиал Федерального государственного бюджетного учреждения науки Федерального научного центра «Владикавказский научный центр Российской академии наук» (ИБМИВНЦРАН), РСО-Алания, РФ, д.м.н., зав. отделом патобиохимии
Можаева И.В.,
ИБМИ ВНЦ РАН, РСО-Алания, РФ, м.н.с. отдела патобиохимии
Маргиева О.И.
ИБМИ ВНЦ РАН, РСО-Алания, РФ, м.н.с. отдела патобиохимии
Тедтоева А.И.
Государственное бюджетное учреждение здравоохранения "Родильный дом №1" Министерства
здравоохранения Республики Северная Осетия-Алания, главный врач
Дзугкоева Ф.С.
ИБМИ ВНЦ РАН, РСО-Алания, РФ, д.м.н., проф., вед.н.с. отдела патобиохимии
THE INFLUENCE OF AFOBAZOLE AND REGULATORS OF ENOS EXPRESSION ON THE INDICATORS OF THE SYSTEM OF LPO - AOS AND THE CONTENT OF NITRIC OXIDE IN NICKEL INTOXICATION IN THE EXPERIMENT
Dzugkoev S.G.
Institute for Biomedical Research - a branch of the Federal State budget institution Science of Federal Scientific Center "Vladikavkaz Scientific Center" (IBR VSC RAS), North Ossetia-Alania, Russia, Doctor of Medical
Sciences, Head. department patobiochemistry
Mozhaeva I. V.
IBR VSC RAS, North Ossetia-Alania, Russia, Junior Researcher departmentpatobiochemistry
Margieva O.I.
IBR VSC RAS, North Ossetia-Alania, Russia, Junior Researcher department patobiochemistry
Tedtoeva A.I.
State budget health care institution "Maternity Hospital №1" the Ministry of Health of the Republic of
North Ossetia-Alania, chief medical officer Dzugkoeva F.S.
IBR VSC RAS, North Ossetia-Alania, Russia, prof., Doctor of Medical Sciences, Leading Researcher department patobiochemistry
АННОТАЦИЯ
Исследования проведены на крысах-самцах линии Вистар одной возрастной группы: контрольных, с никелевой интоксикацией без лечения и на фоне лечения препаратами, обладающими антиоксидантными свойствами и способностью восстановления метаболизма N0. Данные показали, что никелевая интоксикация у крыс вызывает системный окислительный стресс, при котором имеет место снижение содержания NOx. Установлено, что угнетение NO-образующей функции эндотелия и снижение содержания NO обусловлено дефицитом Ьаргинина и повышением содержания в крови ингибитора eNOS. Эти данные показаны при введении подопытным крысам L-аргинина и L-NAME на фоне никелевой интоксикации. Селективный анксиолитик - афобазол оказывает антиоксидантное действие, стимулирует NO-продуцирующую функцию эндотелия и образование NOx. Наибольшая его эффективность отмечается при комбинации афо-базола с L-аргинином. ABSTRACT
The studies were conducted on male rats Wistar one age group control, with nickel intoxication without treatment and during treatment with drugs that have antioxidant properties and ability to restore NO metabolism. The data showed that the nickel toxicity in rats causes systemic oxidative stress, which occurs during reduction of NOx. It was found that the inhibition of NO-forming endothelial function and reduction of NO caused by a deficiency
L-arginina and increase eNOS inhibitor content in the blood. These data are representative of experimental rats when administered L-arginine and L-NAME on the background of nickel toxicity. A selective anxiolytic - afobazol has an antioxidant effect and stimulates NO-producing endothelial function and NOx formation. The highest efficacy observed when the combination afobazole with L-arginine.
Ключевые слова: перекисное окисление липидов, никелевая интоксикация, оксид азота, афобазол, L-аргинин, L-NAME.
Keywords: lipid peroxidation, nickel intoxication, nitric oxide, afobazol, L-arginine, L-NAME.
Изучение особенностей влияния на человека ионов тяжелых металлов, поступающих из объектов производственной и окружающей среды, на сегодняшний день в нашем регионе является актуальной проблемой. г. Владикавказ располагает богатой инфраструктурой металлургического производства, поэтому промышленные предприятия и транспорт, добыча и сжигание твердого и жидкого топлива, электронная и полупроводниковая промышленность, работа горно-обогатительных комплексов, мусоросжигающих установок сопровождаются выбросами токсичных металлов и их соединений, интенсивно загрязняющих экосистему [1,2]. Никель, как представитель тяжелых металлов, входящий в VIII группу периодической системы Д.И. Менделеева, является эубиотиком, участвует в метаболических процессах, оказывая влияние на активность ферментов: ацетил-КоА-синтетазу, кар-боксилазу, фосфоглюкомутазу и др. Вместе с тем, избыточное поступление никеля в организм вызывает патологические изменения в органах дыхания, аутоиммунной системе и почках. По данным ВОЗ (2005) и международной классификации канцерогенных веществ никель является одним из опасных загрязнителей окружающей среды, обладает канцерогенными, мутагенными и аллергическими свойствами [3,4]. Основное влияние на человека происходит в виде аэрозолей, образующихся на воздухе, которые оседают на волосяном и кожном покровах и быстро всасываются в кровь. Липофильность тяжелых металлов создает возможность их проникновения через клеточные мембраны, взаимодействуя с SH-группами белков мембран и субклеточных ор-ганелл. При этом поражаются практически все органы и, в основном, экскреторный орган - почки. В динамике воздействия могут вызывать функциональные и морфологические изменения, приводящие к нефропатии, нарушениям со стороны сердечно-сосудистой и дыхательной систем [5]. На молекулярном уровне никель способен инициировать процессы свободно-радикального окисления (СРО), повышая уровень активных метаболитов кислорода (АМК), угнетая антиокислительную защиту (АОЗ) клеток [6,7,8,9]. Перекисное окисление липидов (ПОЛ) особенно характерно для клеток мозга, печени и почек [9]. В условиях окислительного стресса нарушается метаболизм N0, так как активные формы кислорода (АФК) взаимодействуют с N0, образуя пероксинитрит - сильный окислитель. С другой стороны, повышается содержание в крови ингибитора эндотелиальной N0-синтазы (N0S-3) - АДМА, имеет место дефицит ее субстрата - Ь-аргинина. Причиной дефицита Ь-аргинина является негативное влияние окисленных ЛНП на его транспорт в гладкомышечную клетку
(ГМК) сосудистой стенки. Все эти биохимические изменения приводят к снижению уровня активности и экспрессии N0S-3. Фактором риска в условиях системного окислительного стресса является эндотелиальная дисфункция, вследствие уменьшения концентрации N0-вазодилатирующего фактора, снижения уровня его биодоступности из-за наличия в крови модифицированных производных ЛНП. Процессы пероксидации сопровождаются деформацией мембранного липопротеинового комплекса, повышением проницаемости для протонов и воды, ингибированием мембраносвязанных ферментов.
Вышеизложенное определяет необходимость разработки нового, патогенетически обоснованного, способа терапии с применением препаратов, обладающих антиоксидантными свойствами и способностью восстановления метаболизма N0. Таким препаратом может оказаться селективный анксио-литик афобазол, синтезированный в ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН. Он обладает способностью позитивно модулировать продукцию N0, ингибируя индуцибельную изоформу - iN0S и стимулируя eN0S, оказывая при этом антиокси-дантное действие [10].
Цель исследования: изучить влияние регуляторов экспрессии eN0S и афобазола, а также их комбинации на состояние системы ПОЛ-АОС и N0-образующей функции эндотелия у крыс с никелевой интоксикацией.
Материалы и методы исследования. Исследования проведены на крысах-самцах линии Ви-стар одной возрастной группы. Содержание крыс в виварии и проведение экспериментов соответствовали «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных», разработанным и утвержденным МЗ СССР (1977), а также принципам Хельсинкской декларации (2000).
Никелевую интоксикацию моделировали парентеральным введением хлорида никеля в дозе 0,5 мг/ кг веса животного в течение 1 месяца. Подопытные крысы были разбиты на следующие группы: 1) контрольная группа - интактные крысы; 2) крысы с никелевой интоксикацией без лечения; 3) крысы с никелевой интоксикацией, получавшие в течение 30 дней афобазол в дозе 10 мг/кг; 4) крысы с никелевой интоксикацией + Ь-аргинин; 5) крысы с никелевой интоксикацией + Ь-ЫАМЕ; 4) крысы с никелевой интоксикацией, получавшие в течение 30 дней Ь-аргинин + афобазол; 5) крысы с никелевой интоксикацией, получавшие в течение 30 дней Ь-NAME+афобазол. По окончании эксперимента в ге-молизате эритроцитов и гомогенатах внутренних органов определяли концентрацию МДА [11] и активность СОД [12]. В сыворотке крови определяли:
активность каталазы [13], концентрацию церуло-плазмина [14] и суммарных метаболитов N0 [15].
Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Microsoft Excel 2006. Результаты представлены в виде среднего значения (Mean) и ошибки среднего (SEM). Статистическую достоверность различий между двумя группами животных проверяли с помощью t-критерия Стью-дента. Уровнем статистической значимости считали р<0,05. Проведен корреляционный анализ.
Результаты и обсуждение. Никель, широко применяемый в народном хозяйстве металл, по данным литературы обладает негативным действием. Для установления этого факта мы проводили исследования на крысах контрольных, с никелевой интоксикацией без лечения и на фоне терапии L-аргинином и его комбинации с афобазолом, афоба-зол с L-NAME, контролем для которого служит влияние только L-NAME.
Данные показали, что через месяц введения хлорида никеля, развился окислительный стресс, который приобрел органо-системный характер. Повысилась концентрация МДА в эритроцитах и го-могенатах внутренних органов: почек, печени, миокарда. Одновременно происходило снижение активности СОД в эритроцитах. В противоположность этому активность каталазы и концентрация церулоплазмина в сыворотке крови повысились. Отмеченное нами снижение активности СОД может быть связано с тем, что в структуре активного центра данного фермента имеются чувствительные к модификации кислородными радикалами остатки гистидина, аргинина, ионы меди. Вероятно, в условиях интоксикации хлоридом никеля, пероксид водорода вызывает частичную инактивацию СОД, вследствие чего наблюдается снижение активности данного фермента в группах экспериментальных животных без лечения. Увеличение активности каталазы свидетельствует об усиленном образовании пероксида водорода, что и является компенсаторной реакцией. Разнонаправленные изменения активности ферментов АОС -СОД и каталазы можно объяснить тем, что в молекуле каталазы присутствует 4 группы гема, поэтому каталаза оказывается наиболее устойчивой к активным метаболитам кислорода и может принимать участие в антиокислительной защите клетки. Что касается концентрации суммарных метаболитов NO, то они достоверно снизились. На фоне лечения L-аргинином происходило снижение концентрации МДА и достоверное возрастание активности СОД, а повышенная активность каталазы и концентрации церулоплазмина снизились, но статистически не достоверно. Данные продемонстрировали нарастание концентрации суммарных метаболитов N0 на фоне лечения L-аргинином. Применение ингибитора экспрессии eNOS - L-NAME в дозе 25 мг/кг у крыс с никелевой интоксикацией вызвало усиление окислительного стресса, повышение концентрации МДА в эритроцитах и гомогенатах внутренних органов, по сравнению с данными, полученными под влиянием хлорида никеля. Происходило еще более
значительное снижение активности СОД эритроцитов и повышение активности каталазы и концентрации ЦП. В этих условиях снижалось и содержание NOx. Все выше описанное можно объяснить влиянием Ь-ЫАМЕ на молекулярную структуру eNOS -происходит разобщение оксидазного и редук-тазного доменов фермента и продукция АФК вместо образования N0.
В других вариантах исследований использовали лечение регуляторами экспрессии eN0S: Ь-аргинином и Ь-ЫАМЕ в комбинации с афобазолом. Данные показали, что комбинированное лечение афобазолом с Ь-аргинином снижает интенсивность ПОЛ и содержание МДА в эритроцитах и гомоге-натах внутренних органов, а также корригирует взаимоотношения между ферментами АОЗ и способствует повышению концентрации суммарных метаболитов N0, уровень которых достигает контрольных значений. Афобазол на фоне Ь-ЫАМЕ также угнетает интенсивность ПОЛ вследствие повышения активности СОД и снижения активности каталазы и концентрации ЦП. При этом повышается концентрация суммарных метаболитов N0x, хотя уровень их не достигает контрольных значений и остается ниже уровня лечения афобазолом с Ь-аргинином. Т.о., полученные нами данные демонстрируют антиоксидантные и мембранотроп-ные свойства афобазола на фоне никелевой интоксикации и участие в этих механизмах влияния регуляторов экспрессии eN0S. Изучаемые вещества -афобазол и Ь-аргинин, положительно влияли на функциональную активность сосудистого эндотелия, что проявлялось усилением продукции оксида азота, эффект которого на ГМК сосудистой стенки реализуется через активацию растворимой гуа-нилатциклазы и повышения содержания цГМФ, что приводит к снижению внутриклеточного содержания Са2+ и вазодилатации [16]. Наибольшая эффективность афобазола и его комбинации с регулятором экспрессии eN0S на концентрацию N0 при никелевой интоксикации, подтверждают предположения авторов [17,18,19] о способности данного препарата индуцировать экспрессию eN0S, нормализовать концентрацию N0 и улучшать кровообращение в ишемизированных органах. Выявление защитного действия афобазола на интенсивность ПОЛ - АОС, метаболизм N0 при эн-дотелиальной дисфункции у крыс с никелевой интоксикацией согласуется с исследованиями, показавшими способность данного препарата стимулировать пролиферативные процессы в миокарде, способствуя уменьшению площади ишемического повреждения [20].
Заключение. Коррекция патологических эффектов, вызванных хлоридом никеля, и нормализация метаболизма N0 на фоне лечения Ь-аргинином, афобазолом и комбинации афобазола с Ь-аргинином, приводит к снижению интенсивности свободно-радикального окисления в эритроцитах, гомогенатах внутренних органов, повышению активности СОД и концентрации стабильных суммарных метаболитов оксида азота в крови и, возможно, уровня экспрессии N0-продуцирующего
фермента (eNOS) клеток сосудистого эндотелия. В условиях ингибирования экспрессии eNOS L-NAME, афобазол проявляет антиоксидантные и мембранотропные эффекты, хотя его эффективность бывает менее значимой.
Литература
1. Гильденскиольд P.C., Новиков Ю.В., Ха-мидулин P.C., Винокур И.Л. Тяжелые металлы в окружающей среде и их влияние на организм // Гигиена и санитария. -1992. -№5-6. - С.6-9.
2. Строчкова Л.С., Юрова А.В., Жаворонкова
A.В. Влияние никеля на организм животных и человека // Успехи современной биологии. - 1987. - Т. 103. - Вып. 1. - С. 142-157.
3. Aberer W. Berufsdermatogische Relevanz der Nickel /Sensibilisierung // Allergologie. -1992, BD. 15, №3. - p.104.
4. Борисенкова Р.В., Гвоздева Л.Л., Луценко Л.А. Канцерогенная опасность никеля и его соединений // Медицина труда и промышленная экология. - 2001. - №1. - С.27-31.
5. Антошина Л.И. Естественное содержание никеля в моче у лиц, не контактирующих с ним. // Сбор. Научных трудов, Липецк. - 2000.- С.98.
6. Васильева О.В., Мобицкий О.Б., Клебанов Г.К. и др. Действие антиоксидантов на кинетику цепного окисления липидов в липосомах // Биологические мембраны.-1998.-т.15, №2. - С.177-189
7. Казимирко В.К., Мальцев В.И., Бутылин
B.Ю., Горобец Н.И. Свободно-радикальное окисление и антиоксидантная терапии. // К.: Морион, 2004. - С. 160.
8. Павловская Н.А., Кирьяков В.А., Савельев
C.И. Свинец, ртуть, никель: ранняя диагностика токсического действия на организм. // Под редакцией академии РАМН профессора А.И.Потапова. Липецк. - 2002, отечественная книга.
9. Ушакова В.Н. Контроль ПОЛ.// Издательство Новосибирского университета, 1993г.
10. Дзугкоев С.Г., Дзугкоева Ф.С., Можаева И.В., Маргиева О.И., Карчаидзе Н.М. Механизмы влияния афобазола на NO-продуцирующую функцию эндотелия и показатели окислительного
81
стресса у крыс с экспериментальным сахарным диабетом // Экспериментальная и клиническая фармакология. - Т.79.-№5. - С.15-19.
11. Asakawa T., Matsushita S. Coloring conditions of thiobarbituricacid test, for detecting lipid hydroperoxides. Lipids;-1980;15: 137-140.
12. Сирота Т.В. Новый подход в исследовании аутоокисления адреналина и использование его для измерения активности супероксиддисмутазы // Вопросы медицинской химии. - 1999. - № 3.- С.263-272.
13. Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г. Метод определения активности каталазы. Лабораторное дело. - 1988. - №1. - С. 16-19.
14. Камышников В.С. Клинико-биохим. лабо-рат. диагностика. 2003. №2. - С.71-77.
15. Метельская В.А., Гуманова Н.Г. Клин. лаб. диагностика; 2005; 6: 15-18.
16. Северин Е.С. Биохимия - М.: ГЕОТАР-МЕД. 4 издание (исправлен.); 2007; 779С.
17. Дзугкоев С.Г., Можаева И.В., Гиголаева Л.В., Тедтоева А.И., Маргиева О.И., Дзугкоева Ф.С. Изменение биохимических показателей крови на фоне регуляторов экспрессии эндотелиальной NO-синтазы при кобальтовой интоксикации. Патологическая физиология и экспериментальная терапия. -2014. - № 4. - С. 66-70.
18. Крыжановский С.А., Сорокина А.В., Сто-лярук В.Н., Вититнова М.Б., и др. Изучение анти-ишемического действия «Афобазола» в условиях экспериментального инфаркта миокарда. Бюллетень экспер. биологии и медицины. 2010. - №150(9).
- С. 284-86.
19. Середенин С.Б., Воронин М.В. Нейроре-цепторные механизмы действия афобазола. Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2009.
- № 72(1). -С. 3-11.
20. Дзугкоева Ф.С., Можаева И.В., Дзугкоев С.Г., Маргиева О.И., Тедтоева А.И. Биохимические и гемодинамические показатели дисфункции эндотелия при никелевой интоксикации в эксперименте // Фундаментальные и прикладные исследования: проблемы и результаты. - 2015. - № 19. - С. 25-30.
