CC BY
26
УДК 579.842.23:612.017.4:577.1
ВЛИЯНИЕ 2-МЕРКАПТОЭТАНОЛА НА ТОКСИЧНОСТЬ ПРЕПАРАТОВ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ ИЗ КУЛЬТУР YERSINIA PESTIS EV76, ВЫРАЩЕННЫХ ПРИ 28 И 37 °С
© 2007 г. В.П. Зюзина, Г.В. Демидова, Е.П. Соколова, Р.В. Писанов, И.А. Беспалова, Т.Н. Бородина,
Б.И. Анисимов, В.И. Тынянова, Б.Н. Мишанькин
The effect of 2-mercaptoethanol (2-ME) on the toxicity of lipopolysaccharides (LPS) isolated from Yersinia pestis EV76 cultivated at 28° and 37°C was studied. Conditions optimal for demonstrating 2-ME effect on the toxicity of Yersinia pestis LPS were selected. It was found that 2-ME did not change toxicity of LPS28 preparation of plague microbe. On the contrary, LPS37 preparation, nontoxic for experimental animals, after treatment with 2-ME was found to be lethal to white mice at doses comparable to those used for LPS28. The LPS37 preparation remained nontoxic for guinea-pigs (lethal dose > 4 mg per guinea-pig).
В настоящее время известно, что липополисахарид (ЛПС) Yersinia pestis по химической структуре и биологическим свойствам может быть представлен двумя формами - токсически активной и неактивной. Регулятором вариаций химического строения ЛПС является температура выращивания бактерий [1 - 4]. При 28 °С ЛПС чумного микроба (ЛПС28) имеет токсически активную композицию и в соответствии с химическим строением полимеров обладает средней степенью токсичности для биопробных животных. При повышении температуры культивирования до 37 °С наблюдаются существенные изменения как в количественном и качественном составе сахаров, входящих в структурные блоки ЛПС, так и жирных кислот липида А.
Модификация химического состава, которую претерпевает ЛПС у клеток Y. pestis, выращенных при 37 °С (ЛПС37), приводит к снижению его токсичности и цитокин-продуцирующей активности [1, 2].
Известно также, что проявление полного токсического эффекта зависит не только от определенного химического строения ЛПС, но и от конформации его агрегатов в растворе [5].
Модуляторами токсических свойств ЛПС в условиях макроорганизма являются белки и липопротеи-ны, которые, соединяясь с ЛПС, усиливают или же блокируют его активность [6 - 9]. Ранее в серии работ мы установили, что токсичность ЛПС28 и ЛПС37 Y. pestis EV76 может быть усилена в условиях in vitro двумя способами - посредством образования комплекса со специфическим белком Y. pestis - «мышиным» токсином (МТ) и обработкой ЛПС биологически активным веществом - гликолипидом (БАВ), присутствующим в организме млекопитающих. В обоих случаях усиление токсичности связано с конформа-ционной перестройкой ЛПС [10 - 12].
В литературе описан способ модуляции биологической активности бактериальных ЛПС в условиях in vitro с использованием 2-меркаптоэтанола (2-МЭ) [13, 14]. При изучении иммуносупрессивной активности S- и R-форм ЛПС сальмонелл исследователи обнаружили, что R-ЛПС, не обладающий иммуносупрессив-ными свойствами, приобретает их после обработки 2-МЭ. Молекулярный механизм действия 2-МЭ на ЛПС не выяснен.
Поскольку ЛПС Y. pestis относится к R-хемотипу, обладает средней токсичностью (ЛПС28) или же вообще не токсичен (ЛПС37) для биопробных животных, представляло интерес изучить влияние 2-МЭ на проявление токсических свойств ЛПС28 и ЛПС37 чумного микроба, что и явилось целью настоящей работы.
Условия эксперимента
ЛПС выделяли из бактерий вакцинного штамма Y. pestis EV76 линии НИИЭГ (получен из музея живых культур Ростовского научно-исследовательского противочумного института), выращенных при 28 и 37 °С на агаре LB (Difco, США) в течение 48 ч. Бактериальную массу инактивировали мертиолятом натрия, ЛПС выделяли по методу Westphal, модифицированному И.А. Беспаловой [15]. Препараты ЛПС содержали » 5-6 нг белка на 1 мг ЛПС (метод Lowry в модификации Dulley и Grive [16]). Электрофорез в 12%-ом полиакриламидном геле с 0,1 % додецилсульфата натрия подтвердил принадлежность ЛПС к R-хемотипу.
Гель-фильтрацию препаратов ЛПС проводили с использованием комплекта оборудования фирмы Gilson (Франция) для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), аналитическое разделение - на колонке Bio-Gel TSK-40 (Bio-Rad, США) с пределом фракционирования от 2 до 700 кДа. В качестве элюирующего раствора использовали 20 мМ трис-ИО-буфер с 50 мМ NaCl, pH 7,4. Выявление разделяющихся компонентов осуществляли спектро-фотометрически детектором Uvicord 2238 SII (LKB, Швеция) при длине волны 254 нм.
Принцип обработки ЛПС 2-МЭ заимствован из [14]. Применительно к ЛПС чумного микроба условия постановки опыта были подобраны экспериментально. Предварительно выяснено, что 2-МЭ (Serva, Германия), введенный внутрибрюшинно в количестве 3 мкл для белых мышей и 5 мкл для морских свинок (в 1 мкл содержится 12,8 мМ 2-МЭ), не токсичен для биопробных животных. При оптимизации условий постановки опытов переменными величинами являлись: концентрация 2-МЭ в смеси, время контакта ЛПС с 2-МЭ и температура инкубации смеси. Экспериментально установлено, что влияние 2-МЭ на ток-
сические свойства ЛПС проявляется при следующих условиях: на 1 мг ЛПС приходится от 1 до 5 мкл 2-МЭ; время инкубации ЛПС с 2-МЭ равняется 30 мин при 37 °С либо 18 - 24 ч при 4 °С. Критерием влияния 2-МЭ на ЛПС служила токсичность препаратов ЛПС до и после обработки их 2-МЭ.
Летальную токсичность препаратов ЛПС У. рвьИ^' ЕУ76 определяли титрованием на беспородных белых мышах и морских свинках, ЛПС вводили внутри-брюшинно, ЬБ50 ЛПС выражали в мкг/белую мышь или мкг/морскую свинку [17].
Результаты и обсуждение
Результаты экспериментов по определению влияния 2-МЭ на токсичность препаратов ЛПС28 и ЛПС37 У. ЕУ 76 представлены в табл. 1. Обработка ЛПС28 чумного микроба 2-МЭ не изменяет его токсичности для биопробных животных. Значения ЬБ50 ЛПС28 до и после воздействия 2-МЭ были одинаковыми и составляли 530-550 мкг/белую мышь и 1100 мкг/морскую свинку.
Иная закономерность выявлена при работе с препаратом ЛПС37. Обработка ЛПС37 2-МЭ способствовала переводу его из токсически неактивной в токсически активную форму. После воздействия 2-МЭ на ЛПС37 он становился токсичным для белых мышей и вызывал их гибель при дозах, сопоставимых с дозами
препаратов ЛПС, выделенных из 28°-х культур У. рв'Ш. ЬБ50 препаратов ЛПС37 после обработки их 2-МЭ была равна 765 мкг/белую мышь.
Обращает на себя внимание тот факт, что препараты ЛПС37, обработанные 2-МЭ, обладают избирательной токсичностью по отношению к виду животного, взятого в эксперимент. Если ЛПС37 после его обработки 2-МЭ становился токсичным для белых мышей в дозах, сравнимых с ЛПС28, то у морских свинок он вызывал гибель ~ 10 % животных только при максимальной из проверенных доз - 4000 мкг/морскую свинку, что в 4 раза превышало ЬБ50 ЛПС28 (табл. 1). Столь высокие дозы ЛПС37, вызывающие гибель животных, не позволяют говорить о токсичности препарата ЛПС37 для морских свинок, но свидетельствуют о тенденции к ее проявлению после обработки 2-МЭ.
Ранее мы отмечали, что механизм действия 2-МЭ на бактериальные ЛПС неизучен. Для того чтобы приблизиться к пониманию химической природы этого процесса, мы решили выяснить, образует ли 2-МЭ прочные химические связи с ЛПС У. рвьИ^'.
С этой целью препарат ЛПС37 соединяли с 2-МЭ в соотношении: на 1 мг ЛПС37 - 5 мкл 2-МЭ, и инкубировали в описанных ранее условиях (30 мин при 37 °С). Затем аликвоту смеси отбирали для оценки токсичности для белых мышей, а оставшуюся часть диализовали
Таблица 1
Влияние 2-МЭ на токсичность ЛПС28 и ЛПС37 У. рв&Ь ЕУ76 для экспериментальных животных
Препарат LD50, мкг /белую мышь LD50, мкг/морскую свинку
ЛПС* ЛПС с 2-МЭ ЛПС ЛПС с 2-МЭ
ЛПС28 530 (353-707) 550 (300-800) 1100(830-1450) 1150 (800 - 1500)
ЛПС37 Нетоксичен в дозе 3000 765 (530-1000) Нетоксичен в дозе 4000 Минимальная токсичная доза 4000
* - на 1 мг ЛПС добавляли 1 мкл 2-МЭ.
против 500 объемов физиологического раствора (0,85 % №С1) в течение 24 и 72 ч при 4 °С на магнитной мешалке. Сравнение токсичности ЛПС37 после диализа показало, что ЛПС37 был токсичным для белых мышей в присутствии 2-МЭ до диализа, в течение 24 ч после диализа токсичность снижалась; через 72 ч препарат ЛПС37 утрачивал полностью токсические свойства (табл. 2). Следовательно, 2-МЭ в процессе диали-
за удаляется из смеси, диффундируя через полупроницаемую мембрану, что свидетельствует об отсутствии прочных химических связей между 2-МЭ и ЛПС. Можно предположить, что модифицирующее действие 2-МЭ на ЛПС выражается в транзиторных перестройках конформации агрегатов ЛПС в растворе под действием 2-МЭ.
Таблица 2
Токсичность ЛПС37 с 2-МЭ до и после диализа*
Препарат Число павших белых мышей / зараженных белых мышей
ЛПС37 0/10
ЛПС37 с 2-МЭ 7/10
ЛПС37 с 2-МЭ после диализа в течение 24 ч 2/10
ЛПС37 с 2-МЭ после диализа в течение 72 ч 0/10
* - представлены результаты одного из опытов. Доза ЛПС37 составляла 1 мг/белую мышь. На 1 мг ЛПС37 приходилось 5 мкл 2-МЭ.
Сравнительный анализ методом гель-фильтрации препаратов ЛПС37, обработанных и не обработанных 2-МЭ, подтвердил предположение об их конформаци-онных различиях. На рисунке видно, что профили
элюции препаратов ЛПС37 и ЛПС37 с 2-МЭ существенно отличаются друг от друга как по количественным, так и по качественным параметрам. Исходный препарат ЛПС37 элюируется двумя пиками - основ-
ным и дополнительным. Основной объем ЛПС элюи-руется в виде одного пика с двумя вершинами на 10-й и 11-й мин. Дополнительный пик, который по площади соответствует 1/12 части главного пика, элюируется на 6-й мин. Препарат ЛПС37 с 2-МЭ характеризуется выраженной гетерогенностью и количественным увеличением мицеллярных форм ЛПС различных размеров. На рисунке отчетливо видно, что ЛПС37 с 2-МЭ элюи-руется не двумя, как исходный препарат, а четырьмя пиками. Время выхода первого и второго пиков совпадает со временем выхода исходного препарата ЛПС37 -6-я и 10-11-я мин. При этом основной пик сохраняет две вершины. Дополнительные третий и четвертый пики появляются на 13-й и 16-й мин элюции. При одинаковой количественной нагрузке препаратов ЛПС37 и ЛПС37 с 2-МЭ площадь основных пиков и общая площадь элюции препарата ЛПС37 с 2-МЭ в 2,3 раза больше, чем у исходного препарата ЛПС37.
Полученные данные свидетельствуют о том, что под влиянием 2-МЭ уменьшается плотность упаковки мицеллярных агрегатов ЛПС в растворе и происходит их частичная дезагрегация. Подобные изменения конформации ЛПС наблюдались под воздействием БАВ и МТ [10 - 12]. Однако профили элюции препаратов ЛПС под влиянием 2-МЭ и указанных веществ отличаются друг от друга, различны также и вызываемые ими изменения в проявлении токсических свойств ЛПС. Так, если БАВ и МТ усиливают токсичность ЛПС28 и способствуют проявлению токсических свойств ЛПС37, то в случае с 2-МЭ эффект усиления токсичности отмечается только у ЛПС37 и достоверно выражен только для одного из видов биопробных животных - белых мышей.
Выявленная связь между конформационными перестройками полимеров ЛПС и их функциональной активностью согласуется с ныне известным механизмом действия ЛПС на макроорганизм [18 - 21]. По современным представлениям токсический потенциал ЛПС реализуется опосредованно через индукцию ци-токинов и других медиаторов клеток иммунной системы макроорганизмов.
В цепи последовательных молекулярно-рецептор-ных взаимодействий центральным звеном (триггер-ной точкой) является этап соединения (колокализа-ции) тройного комплекса ЛПС + ЬБР + СБ14 с рецепторами фагоцитарных клеток, которые способны к передаче трансмембранных сигналов - ТЬЯ4 и/или СЯ3. Процесс колокализации осуществляется с участием ЛПС, от конформации которого зависит стери-ческое соответствие комплекса центрам связывания ТЬЯ4 и/или СЯ3 рецепторов [18].
При полном (или частичном) их соответствии «запуск» цитокинового ответа осуществляется, а в случае их несоответствия активации фагоцитарных клеток не происходит. Вышеизложенное позволяет предположить, что вариации токсичности ЛПС Y. pestis, выявленные нами экспериментально, отражают степень стереохими-ческого соответствия конформации ЛПС центрам связывания ТЬЯ4 и/или СЯ3 рецепторов.
Как мы отмечали ранее, химическое строение ЛПС28 и ЛПС37 различно и, следовательно, пространственная конфигурация их мономеров также различна. Под влиянием МТ и БАВ в пределах химического
50
40
.10
20--
Vka
to 2(1 If) ■'«'■» 1 о 20 30
Профили элюции препаратов ЛПС37 Y. pestis EV76 с 2-МЭ при гель-фильтрации на колонке Bio-Gel TSK40 (подвижная фаза: 20 мМ Трис-HCl с 50 мМ NaCl, pH 7,4): а - ЛПС37 (40 мкг); б - ЛПС 37 с 2-МЭ (40 мкг ЛПС 1,5 мкл 2-МЭ)
строения каждого из мономеров изменяется конформа-ция ЛПС28 и ЛПС37, в результате чего, видимо, достигается максимально возможное стерическое соответствие ЛПС28 и ЛПС37 рецепторам фагоцитарных клеток макроорганизма. Влияние 2-МЭ на ЛПС Y. pestis менее выражено по сравнению с МТ и БАВ и ограничено конформационными перестройками только ЛПС37. Интересен факт избирательной чувствительности животных к ЛПС37, обработанному 2-МЭ. Препараты ЛПС, имеющие одну и ту же химическую структуру и, соответственно, конформацию мономеров, токсичны для белых мышей, но не токсичны для морских свинок. Предположительно объяснить это можно различиями в химическом строении центров связывания рецепторов TLR4 и/или CR3 у этих видов животных.
Возможно, отсутствие стереохимического соответствия ЛПС Y. pestis рецепторам, способным передавать трансмембранный сигнал фагоцитарным клеткам, может быть одной из причин резистентности некоторых видов животных к чумной инфекции. Для выяснения этих вопросов требуются специальные исследования.
Литература
1. Kawahara K. et al. // Infect. Immun. 2002. Vol. 70. № 8.
P. 4092 - 4098.
2. Гремякова Т.А. Структурно-функциональная вариабель-
ность антигенов Yersinia pestis и методология конструирования противочумных иммунопрофилактических препаратов: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. Оболенск, 2003.
3. Knirel Y.A. et al. // Biochemistry. 2005. Vol. 44. P. 1731 -
1743.
4. Knirel Y.A. et al. // J. Endotoxin Research. 2006. Vol. 12.
№ 6. P. 3 - 9.
5. Schromm A. et al. // J. Immunol. 1998. Vol. 161. P. 5464 -
5471.
6. Аполлонин А. В. и др. // Журн. микробиол., эпидемиол. и
иммунобиол. 1990. № 11. С. 100 - 106.
7. Bauer M.E. Welch R.A. // Infect. Immun. 1997. Vol. 65. №
6. P. 2218 -2224.
8. Li J., Clinkenbeard K.D. // Infect. Immun. 1999. Vol. 67.
№ 6. P. 2920 - 2927.
9. Wright S.D. et al. // Science. 1990. Vol. 249. № 4975. P. 1431. 1433.
10. Тынянова В.И. и др. // Биотехнология. 2003. № 6. С. 20-
24.
11. СоколоваЕ. П. и др. // Биотехнология. 2000. № 5. С. 25 -
30.
12. Тынянова В.И. и др. // Биотехнология. 1996. № 6. С. 26 -
30.
13. Моложаева О.С. и др. // Мжробюл. журн. 1997. Т. 59.
№ 2. С. 73 - 78.
14. Борисова Е.В. // Журн. микробиол. 1998. № 6. С. 20 - 23.
15. Беспалова И.А. Иммунохимическая и биологическая
характеристика модифицированных производных ли-пополисахарида чумного микроба: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. Ростов н/Д, 1995.
16. Dulley J., Grieve P. // Anal. Biochem. 1975. Vol. 64. P. 136 -
141.
17. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в
микробиологических исследованиях. М., 1962.
18. Авдеева М.Г., Шубич М.Г. // Биохимия. 2003. № 6. С. 3 -
10.
19. Beutler B. // Current Opinion in Microbiology. 2000. № 3.
P. 23 - 28.
20. Ройт А., Бростофор Дж., Мейл Д. Иммунология. М.,
2000.
21. Athman R., Philpott D. // Current Opinion in Microbiology.
2004. № 7. P. 25 - 32.
24 ноября 2006 г
Научно-исследовательский противочумный институт, г. Ростов-на-Дону
