CC BY
27
УДК 579.842.23:612.017.4:577.1
ИССЛЕДОВАНИЕ ЦИТОКИНИНДУЦИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ YERSINIA PESTIS EV76
Проведено сравнительное исследование цитокининдуцирующей активности различных форм липополисахаридов Y. pestis EV76 моноцитами человека линии U-937. Использовали препараты ЛПС, выделенные из 28- и 37 °С-х культур Y. pestis EV76, а также их модифицированные варианты — комплексы ЛПС с «мышиным» токсином (МТ) чумного микроба, обладающие повышенной токсичностью для биопробных животных. Все изученные варианты ЛПС Y. pestis EV76 способны активировать TLR4 моноцитов человека и индуцировать синтез TNF-a и IFN-y. Цитокиновый ответ при рестимуляции моноцитов отличается от ответа при первичном воздействии ЛПС чумного микроба и существенно зависел от хемотипа ЛПС E. coli, которым проводили первичную стимуляцию TLR4. Стимуляция TLR4 моноцитов человека исходными и модифицированными формами ЛПС чумного микроба сопровождалась изменениями активности сигнальных путей — down-регуляцией синтеза TNF-a и down/ир-регуляцией синтеза IFN-y. Исключение составлял токсически активный комплекс ЛПС37-МТ, который при всех условиях постановки эксперимента индуцировал определённый уровень синтеза как TNF-a, так и IFN-y.
МОНОЦИТАМИ ЧЕЛОВЕКА
© 2012 г. Е.П. Соколова, В.П. Зюзина, Г.В. Демидова, И.А. Беспалова, И.А. Иванова, Т.Н. Бородина, Л.П. Алексеева, В.И. Тынянова
Ростовский научно-исследовательский противочумный институт, ул. М. Горького, 117/40, г. Ростов н/Д, 344002, plague@aaanet.ru.
Rostov Research Antiplague Institute, M. Gorkiy St., 117/40, Rostov-on-Don, 344002, plague@aaanet.ru.
Ключевые слова: Yersinia pestis EV 76, липополисахарид, токсичность, модифицированные формы, моноциты, рестимуляция, цитокины.
Comparative study of cytokine-inducing activity of different forms of lipopolysaccharides (LPS) from Y. pestis EV76 strain was carried out using human monocytes of U-937 line. Experiments were performed with LPS preparations isolated from Y. pestis EV76 cultures, grown at 28 and 37 °C, as well as with their modified variants - LPS complexes with "murine" toxin (MT) of plague microbe, characterized by high toxicity for experimental animals. All Y. pestis EV76 LPS variants tested were capable to activate TLR4 of human monocytes and induce TNF-a and IFN-y synthesis. The cytokine response on monocyte restimulation differed from the response on primary stimulation by LPS of plague microbe and was highly dependent on the LPS chemotype ofE. coli used for primary stimulation of TLR4. The stimulation of TLR4 of human monocytes by initial and modified LPS forms from Y. pestis was accompanied by alterations in activity of signal pathways — namely, in down-regulation of TNF-a synthesis and down/up-regulation of IFN-y synthesis. This was true with the exception of the toxically active LPS37-MT complex, which under all experimental conditions induced a certain level of both TNF-a and IFN-y synthesis.
Keywords: Yersinia pestis EV 76 strain, lipopolysaccharide, toxicity, modified forms, monocytes, restimulation, cytokines.
Как известно, активация клеток неспецифической системы защиты макроорганизма бактериальными липополисахаридами (ЛПС) индуцирует синтез про-воспалительных цитокинов различных классов. Передача трансмембранных сигналов при этом осуществляется паттерн-распознающими Toll-подобными рецепторами - TLR4 и TLR2. Центральная роль во взаимодействии TLR с ЛПС как S-, так и R-хемотипов принадлежит TLR4, который является специфическим рецептором для бактериальных ЛПС. При этом высокоаффинная связь TLR4 с R- и S-формами ЛПС обеспечивается различными акцессорными молекулами [1]. Уникальность TLR4 состоит в том, что он имеет 2 пути передачи сигнала: MyD88-зависимый через NF-kB (экспрессия генов провоспалительных цитокинов) и TRIF-зависимый (МуЭ88-независимый), который индуцирует синтез интерферонов I и II типов. Оба пути взаимосвязаны через адапторные молекулы TIR-домена TLR4 [2]. При этом индукция двух сигнальных путей селективна и непосредственно зависит от химической структуры и конформации липида А [3]. Кроме того, активация TLR4 может сопровождаться синергизацией иных Toll-подобных рецепторов - TLR2, TLR4, TLR9, функциональная активность которых взаимозависима и взаиморегулируема [4]. ЛПС чумного микроба относится к R-хемотипу и отличается внутривидовым разнообразием химической структуры. Его синтез регулируется температурой. Вариации химического строения ЛПС Yersinia pestis достаточно полно изучены. При низких температурах выращивания клеток (28 °С) состав липи-да А гетерогенен и представлен смесью три-, тетра-, пента- и гексаацильных форм с количественным преобладанием последних. Одновременное присутствие в смеси различных по токсичности молекул ЛПС28 отражается на его биологических свойствах: препараты обладают средней степенью токсичности для биопробных животных и цитокининдуцирующей способностью [5, 6]. По данным S. Montminy et al. [7], в реализации трансмембранного сигнала иммунокомпетентными клетками принимает участие рецептор TLR4 [7]. ЛПС, выделенный из бактерий Y. pestis, выращенных при 37 °С, отличается по химическому составу сахаров и жирных кислот от ЛПС28. Липид А ЛПС37 более гомогенен и содержит преимущественно три- и тетраациль-ные молекулы [8]. Модификация, которую претерпевает ЛПС37, приводит к изменению его биологической активности. Препарат обладает слабой цитокининдуци-рующей активностью и нетоксичен для белых мышей и морских свинок [9, 10].
Помимо температурозависимых вариаций химической структуры, биологические свойства ЛПС чумно-
го микроба определяются также конформацией его полимеров. Ранее в серии специально выполненных экспериментов мы установили, что модуляторами конформационных изменений, которые усиливают токсичность ЛПС28 и ЛПС37 Y. pestis в условиях in vitro, могут быть как фактор, присутствующий в макроорганизме, - биологически активный гликоли-пид [11], так и собственный специфический белок Y. pestis - «мышиный» токсин (МТ) [12, 13]. Вопрос о том, на какие из Toll-подобных рецепторов действуют конформационно измененные формы ЛПС Y. pestis и пути их активации, не исследовался. Один из методических подходов к детекции TLR заключается в повторном воздействии ЛПС на известный рецептор, предварительно активированный специфическим для него лигандом. В зависимости от степени идентичности химической структуры лигандов, которые использованы для первичной и повторной активации TLR, цитокиновый ответ клетки может быть супрессирован или же, напротив, усилен. Рестимуляция данного рецептора одним и тем же ЛПС приводит, как правило, к подавлению его функциональной активности. При частичной комплементарности ЛПС к TLR возможны вариации уровня синтеза цитокинов и их качественного состава [14]. В основе этих процессов лежат ре-гуляторные изменения проводящих сигнальных путей TLR на различных уровнях, начиная с формирования внешней структуры рецептора, связывающего лиганд, до цитоплазматических регуляторных молекул мРНК цитокиновых генов. Описанный выше подход - рес-тимуляция известного TLR препаратами ЛПС Y. pestis различного химического строения и конформации -был использован в настоящей работе.
Цель исследования заключалась в сравнении воздействия разных по форме ЛПС Y. pestis EV76 на синтез фактора некроза опухоли (TNF-a) и гамма-интерферона (IFN-y) моноцитами человека.
Материалы и методы
Бактерии Y. pestis EV76 выращивали при 28 и 37 °С на агаре LB (Difco, США) в течение 48 ч. ЛПС из них выделяли по методу Westphal, модифицированному И.А. Беспаловой [13]. МТ из Y. pestis EV76 выделен и очищен по оригинальной методике В.И. Марченкова [12], LD50 МТ=5,6 (4,0^7,9) мкг/мышь. Модифицированный ЛПС получали соединением его с МТ с последующей инкубацией при 37 °С в течение 30 мин, при этом образовывался комплекс, обладающий повышенной токсичностью для биопробных животных [1]. В работе также использовали препараты S-ЛПС Escherichia coli 055:В5 (Fluka, Israel) и R-ЛПС E. coli J 5 Rc
mutant (Sigma, Germany). Навески препаратов ЛПС растворяли в дистиллированной воде, выдерживали в течение 24 ч при 4 °С.
Цитокининдуцирующие свойства ЛПС изучали на моноцитах человека линии U-937. Моноциты (1х106 клеток в лунке) культивировали в 96-луночном планшете в среде PRMI 1640, содержащей 8 % эмбриональной телячьей сыворотки (FCS) и 100 мкг/мл ген-тамицина. Количественно-временные параметры активации и рестимуляции моноцитов человека были определены экспериментально. В реакциях как прямой, так и повторной активации использована доза препаратов ЛПС, равная 5 мкг на лунку. Время между первым возбуждением рецептора (активация TLR4 с помощью ЛПС E. coli) и повторным (ЛПС Y. pestis) составляло 30 мин. Учет количества синтезированных цитокинов проводили через 4 ч после рестимуляции моноцитов. Для первичной активации TLR4 использовали специфические для него лиганды - S-ЛПС и R-ЛПС E. coli. Рестимуляцию TLR4 проводили исходными вариантами ЛПС28 и ЛПС37 и модифицированными с помощью МТ формами - ЛПС28-МТ и ЛПС37-МТ. Препарат МТ (50 нг) цитокининдуци-рующей активностью не обладал. Количественные изменения синтеза цитокинов двух типов - TNF-a и IFN-y - служили критерием оценки рестимуляции моноцитарных клеток. Продукцию цитокинов TNF-a и IFN-y определяли методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческих тест-систем («Вектор-Бест», Новосибирск). Доверительный интервал рассчитан по Стьюденту-Фишеру (p=0,95).
Результаты и обсуждение
В результате проведенных экспериментов установили, что ЛПС28 Y. pestis EV76 - сильный индуктор синтеза цитокинов. Под его влиянием активировались одновременно 2 пути передачи сигналов - MyD88-зависимый и MyD88-независимый. При этом синтез IFN-y приблизительно в 2 раза превышал интенсивность синтеза TNF-a (90±9,4 и 50±7,0 пг/мл соответственно). ЛПС37 также активировал оба сигнальных пути одновременно, однако цитокининдуцирующая способность его выражена слабо (TNF-a - 12,5±3,6 пг/мл и IFN-y - 14,0±3,6). Модифицированные формы ЛПС28-МТ подавляли синтез обоих цитокинов (TNF-a -10,0±3,0 и IFN-y - 12,0±3,3 пг/мл). Под влиянием ЛПС37-МТ синтез IFN-y также супрессировался (3,0±1,7 пг/мл), однако количество синтезированного TNF-a достоверно не уменьшалось (10,0±3,1 пг/мл).
При рестимуляции первичное воздействие на моноциты проводилось S-ЛПС E. coli и R-ЛПС E. coli. Как оказалось, для S-ЛПС E. coli характерно доминирование одного пути синтеза цитокинов - MyD88-зависимого. В условиях наших экспериментов активация моноцитов S-ЛПС E. coli сопровождалась интенсивным синтезом TNF-a (48±7,0 пг/мл), в то время как IFN-y регистрировался в следовых количествах (приблизительно 2±1,4 г/мл, в пределах чувствительности метода). Рестимуляция моноцитов препаратами ЛПС Y. pestis EV76 всех вариантов (на фоне S-ЛПС E. coli) приводила к полному (ЛПС37, ЛПС37-МТ, ЛПС28-МТ) или частичному (ЛПС28) подавлению синтеза TNF-a. При этом супрессия MyD88-зависимого пути коррели-
ровала с повышением активности 2-го пути синтеза цитокинов - IFN-y. Воздействие исходных форм ЛПС28 и ЛПС37 Y. pestis EV76 вызывало приблизительно одинаковое накопление IFN-y (20±4,4 и 22±4,6 пг/мл). Интенсивность синтеза IFN-y под влиянием модифицированных форм ЛПС была выражена слабее (ЛПС28-МТ - 3,0±1,2 пг/мл, ЛПС37-МТ -15,0±3,8). Однако переключение сигнальных путей от TNF-a к INF-y вызывали как исходные, так и модифицированные формы ЛПС, и различия между ними были лишь количественные. R-ЛПС E. coli в отличие от S-ЛПС E. coli в наших экспериментах активировал одновременно 2 пути синтеза цитокинов - MyD88-зависимый и MyD88-независимый. Количество синтезированного TNF-a (30,0±4,9 пг/мл) при активации этим хемотипом ЛПС E. coli было приблизительно в 2 раза больше по сравнению с IFN-y (15,0±3,8 пг/мл), что свидетельствует о регуляторном сдвиге передаваемого сигнала в сторону МуЭ88-зависимого направления. Рестимуляция моноцитов ЛПС28 блокировала оба пути передачи сигналов, и синтез TNF-a и IFN-y полностью отсутствовал. Под влиянием ЛПС28-МТ отмечалась незначительная экспрессия IFN-y (3,0±1,2 пг/мл). Напротив, ЛПС37 резко усиливал активацию MyD88-независимого пути, и количество синтезированного IFN-y увеличивалось приблизительно в 3 раза по сравнению с контролем (46,0±6,8 пг/мл). Синтез же TNF-a был незначителен (3,0±1,2 пг/мл). ЛПС37-МТ частично подавлял синтез TFN-a, но не оказывал влияния на синтез INF-y (12,0±3,4 и 15,0±3,8 пг/мл).
Таким образом, в результате проведенной работы выяснено, что исходные и модифицированные формы ЛПС Y. pestis EV76 способны активировать TLR4 моноцитов человека, о чём свидетельствует синтез 2 типов цитокинов - TNF-a и IFN-y. При этом ЛПС28 проявляет высокую цитокининдуцирующую активность, в то время как нетоксичный ЛПС37 и токсичные формы ЛПС28-МТ, ЛПС37-МТ являются слабыми индукторами синтеза TNF-a и IFN-y.
Цитокиновый ответ при рестимуляции моноцитов отличался от прямого воздействия препаратов ЛПС чумного микроба и существенно зависел от того, какая из форм ЛПС E. coli (R- или S-) была использована для первичной активации TLR4. Общая закономерность для всех вариантов ЛПС Y. pestis EV76 на фоне S-ЛПС E. coli заключается в полном или частичном (ЛПС28) подавлении синтеза TNF-a, что согласуется с данными других исследователей [13]. В этих же условиях под влиянием всех исходных и модифицированных форм ЛПС чумного микроба наблюдается увеличение синтеза IFN-y. При этом IFN-y-индуцирующая активность модифицированных вариантов ЛПС менее выражена по сравнению с исходными формами. Прямая корреляция между супрессией синтеза TNF-a и активацией IFN-y предполагает регу-ляторное переключение MyD88-зависимого сигнального пути на MyD88-независимый.
Иной характер цитокинового ответа наблюдается при первичной активации моноцитов R-ЛПС E. coli. Так, ЛПС28 и ЛПС28-МТ полностью ингибируют синтез как TNF-a, так и IFN-y. В этих же условиях ЛПС37 Y. pestis EV76 на фоне супрессии синтеза TNF-a активирует MyD88-независимый путь передачи сигнала и
способствует накоплению IFN-y в значительных количествах. Модифицированная форма ЛПС37-МТ частично супрессирует TNF-a, но не оказывает влияния на синтез IFN-y.
В целом регуляторные изменения активности сигнальных путей - МуЭ88-зависимого и MyD88-независимого - под влиянием изученных форм ЛПС Y. pestis EV76 можно охарактеризовать как down-регуляцию синтеза TNF-a и down-Zup-регуляцию синтеза IFN-y. Следует отметить, что токсически активная форма ЛПС37-МТ в зависимости от условий постановки эксперимента может частично супрессиро-вать синтез TNF-a, активировать IFN-y или же вообще не оказывать влияния на активность их сигнальных путей. При этом никогда не наблюдается полной ин-гибиции синтеза цитокинов, т.е. ЛПС37-МТ всегда поддерживает синтез TNF-a и IFN-y на определённом уровне. Видимо, молекулярные механизмы регуляции MyD88-зависимого и MyD88-независимого сигнальных путей под влиянием конформационно-изменён-ной формы ЛПС37-МТ отличаются от известных схем их взаимодействия [2, 14]. Выяснение этих вопросов может быть предметом специальных исследований.
Литература
1. R-form LPS, the master key to the activation of TLR4/MD-2-positive cells / M. Huber [et al.] // Eur. J. Immunol. 2006. Vol. 36, № 3. P. 701 - 711.
2. Uematsu S., Akira S. Toll-like receptors and tipe I interferons // J. Biol. Chem. 2007. Vol. 282, № 21. P. 1519 - 1532.
3. Differential induction of the Toll-like receptor 4-MyD88-dependent and -independent signaling pathways by endonoxins / S.M. Zughaier [et al.] // Infect. Immun. 2005. Vol. 73, № 5. P. 2940 - 2950.
4. Napolitani G., Rinaldi A., Bertoni F. Selected Toll-like receptor agonist combinations synergistically trigger a T helper type 1-polarizing program in dendritic cells // Nat. Immunol. 2005. Vol. 6, № 8. P. 769 - 776.
5. Modification of the structure and activity of lipid A in Yersinia pestis lipopolysaccharide by growth temperature / K. Kawaha-ra [et al.] // Infect. Immun. 2002. Vol. 70, № 8. P. 4092 - 4098.
6. Characterization of late acyltransferase genes of Yersinia pestis and their role in temperature-dependent lipid A variation / R. Rebeil [et al.] // J. Bacteriol. 2006. Vol. 188. P. 1381 - 1388.
7. Virulenct factors of Yersinia pestis are overcove by a strong lipopolysfccyaride response / S. Montminy [et al.] // Nature Immun. 2006. Vol. 7, № 10. P. 1066 - 1073.
8. Temperature dependent variations and intraspecies diversity of the structure of the lipopolysaccharides of Yersinia pestis / Y.A. Knirel [et al.] // Biochemistry. 2005. № 44. P. 1731 - 1743.
9. Токсичность препаратов липополисахаридов из культуры Yersinia pestis EV76, выращенной при 28° и 37 °С / В.И. Тынянова [и др.] // Биотехнология. 2003. № 6. С.10 - 16.
10. Immunomodulatory properties of Yersinia pestis lipopo-lysaccharides on human macrophages / M. Matsuura [et al.] // Clin Vaccine Immunol. 2010. Vol. 17, № 1. P. 49 - 55.
11. Гликолипид - биоактиватор токсических субстанций чумного микроба / В.И. Тынянова [и др.] // Биотехнология. 1999. № 2. С. 28 - 33.
12. Комплексы «мышиного» токсина чумного микроба с модифицированными формами липополисахарида Yersinia pestis и с липополисахаридами других бактерий / Е.П. Соколова [и др.] // Биотехнология. 2001. № 4. С. 53 - 58.
13. Соколова Е.П. Механизмы активации токсических субстанций чумного микроба : автореф. дис. ... канд. биол. наук. Ростов н/Д, 2002. 20 с.
14. Differential effects of CpG-DNA in Toll-like receptor-2/-4/-9 tolerance and cross-tolerance / A. Dalpke [et al.] // Immunology. 2005. № 116. P. 203-212.
Поступила в редакцию_11 июля 2011 г.
