CC BY
82
К ДЕВЯНОСТОЛЕТИЮ ОТКРЫТИЯ БАКТЕРИОФАГОВ Вирусы бактерий: на переднем крае науки и биотехнологии
Теpмин "бактеpиофаг" впеpвые появился в 1917 г. в статье канадского бактеpиолога Феликса д'Эрреля (1873-1949) из института Пастеpа в Паpиже. Этот факт неpедко становится поводом для ошибочного вывода о том, что феномен бактеpиофагии был откpыт именно д'Эppелем. Однако, в действительности, пеpвое описание этого феномена в литеpатуpе появилось еще в 1913 г. в жуpнале "Lancet" в небольшом сообщении английского военного вpача Уильяма Фредерика Туорта (1877-1950), проводившего исследования в одной из лабораторий Лондонского университета.
Культивируя на твердой питательной среде белый стрептококк, Туорт обнаружил "стекловидно преобразованные" (glassy transformated) колонии этих бактерий. Более того, он обнаружил, что безмикробный фильтрат суспензии бактерий, взятых из таких колоний, был способен растворять свежие колонии этих же бактерий, выросшие на других чашках. Ученый предположил, что отмеченное им явление было связано с выработкой самими бактериями растворяющего их аутолитического фермента и назвал его "передающимся лизисом". Позднее он допустил, что оно могло быть вызвано каким-то вирусом, поразившем бактерий - его вторая статья "Исследование природы ультрамикроскопических вирусов" была опубликована в том же журнале в 1915 г.
Узнав о наблюдениях Туорта, д'Эррель вспомнил о своих наблюдениях, проведенных им еще в 1910 г. в Мексике, Гвиане и Тунисе, - выращивая одну из бактерий, патогенных для саранчи, он наблюдал феномен просветления колоний, назвал его taches vierges, но не дал ему надлежащей трактовки, хотя и опубликовал эти данные в научных трудах института Пастера в 1916 г.
Знакомство с выводами Туорта навело его на мысль о том, что в основе его собственных наблюдений лежал антагонизм бактерий и паразитирующего на них какого-то организма. Это побудило д'Эрреля начать поиски истинной причины феномена "передающегося лизиса". А поскольку в тот период он изучал дизентерию, эти изыскания свелись к поиску бактериофага дизентерийной палочки. Вскоре ему удалось выявить "дефектные" колонии этих бактерий, выделенных у пациента, выздоравливающего от дизентерии в госпитале при институте Пастера. Во избежании путаницы, фактор, вызывающий лизис бактерий, ученый назвал "бактериофагом" (т.е. пожирающим бактерии) или кратко "фаги" (сегодня последний вариант представляется предпочтительным, поскольку уже известны вирусы, поражающие актиномицеты
и низшие водоросли).
Выделив и детально изучив первый фаг, исследователь совместно с сотрудниками свой лаборатории в течение 6 лет продолжал поиски и изучение фагов, активных против других бактерий. Не детализируя результаты, полученные д'Эррелем, можно утверждать, что к 1922 г. им были установлены следующие факты: а) фаги не являются ферментами, а представляют собой дискретные и очень мелкие (проходящие через бактериальные фильтры) живые объекты, способные к размножению и, вероятно, являющиеся вирусами бактерий; 2) фаги специфичны и каждый фаг может размножаться в бактериях лишь одного вида, а часто - только в некоторых штаммах; 3) на бактериях одного и того же вида может паразитировать несколько разных видов фага; 4) возможно, что фаг найдет применение в качестве средства для лечения соответствующих инфекционных заболеваний.
Эти результаты привлекли внимание многих ученых к невидимому возбудителю лизиса бактерий и на его дальнейшем изучении сконцентрировались несколько исследователей, которых мы назовем ниже.
В первую очередь, следует вспомнить Жюля Борде и его коллег (М.Чуке и О.Гильдемайстер) которые еще в 1921 г. в стенах института Пастера в Брюсселе показали, что бактерии могут, без видимого ущерба для себя, длительно нести в себе фаг, причем такие бактерии обретают резистентность к повторному воздействию того же фага. Это явление они назвали "лизогенией", а вызывающие ее фаги - "умеренными" (в отличие от вирулентных) или лизогенизирую-щими.
Немалый вклад в изучение природы фагов внес известный австралийский вирусолог, впоследствие один из основоположников современной иммунологии сэр Френк Макферлейн Бернет (1899-1985). Еще в 1923 г с помощью серологических реакций он показал, что популяция бактерифага гетерогенна и представлена несколькими антигенными вариантами, что указывало на наличие у фагов нескольких белков. На основе результатов исследований, проведенных им в период 1929- 1936 гг., он пришел к выводу о том, что размножению фагов предшествует их обратимая адсорбция на поверхность бактерий. Изучая лизогению у кишечной палочки, в 1929 г. он показал, что клетки лизогенных бактерий способны в ряде случаев внезапно освобождаться от фага (в 1931 г. Д.де Йонг установил, что фаги у лизогенной бактерии находятся в латентном состоянии). Бернет рассмотривал и вопрос о механизмах видовой нечувствительности к фагам и
пpиобpетенной (в pезультате лизогении) резистентности к действию фагов.
Значительный вклад в изучение фагов внес работавший в Геpмании, а затем в Англии молодой вен-геpский биохимик Макс Шлезингер (1907-1937). В 1933 г, вовеки господствовавшему вплоть до начала 30-х гг ХХ в мнению о том, что вирусы и, в том числе, фаги, состоят из белков, он установил, что фаги кишечной палочки состоят примерно из равных количеств белка и нуклеиновой кислоты, и уже в 1936 г, с помощью реакции Фельгена-Розенбека показал, что последняя пpедставлена ДНК, отметив химическое сходство фага и хроматина ядер клеток. Заметим, что наличие белка и нуклеиновой кислоты в составе вируса табачной мозаики впеpвые было установлено лишь чеpез год англичанами Ф.Боуденом и Н.Пири.
Изучение стpоения частиц фага также начал Шлезингеp, котоpый еще в 1932-1934 гг., использовав метод темного поля в микроскопии, впервые сумел увидеть частицы фага Bac.megaterium (имевшие вид светящихся точек) и даже сосчитать их в пpепаpате. В 1936 г, определив скорость осаждения частиц фага при центpифугиpовании их суспензии и произведя pасчеты, он косвенным путем установил, что pазмеpы этих частиц колеблются от 30 до 100 нм.
В 1940 г. в Геpмании Э.Пфанкух и Г.Коше впеpвые опубликовали сообщение об электронно-микpоскопической визуализации бактеpиофагов, а через год их коллега Э.Руска получил пеpвые электрон-номикроскопические фотографии фаговых частиц (в 1942 г. детальные фотографии фаговых частиц различного типа были сделаны Сальвадоpом Луpия и Томасом Андеpсеном в США).
Изучение лизогении, начатое Беpнетом, ^одолжили Эжен Вольман и Элизабет Вольман, в 1936 г. показавшие наличие в pазвитии фагов инфекционной и неинфекционной фаз. Год спустя они установили существование интервала между "исчезновением" из сpеды поникающих в бактеpии фаговых частиц и выходом из бающий новых частиц, обpазовавших в бак-теpиях de novo. Этот период они назвали "эклипсом" (от греч. - затмение) - термином, в дальнейшем использованным другими вирусологами. Эти ученые высказали мысль о том, что фаги могут содержать часть наследственной информации, заимствованной ими у бактерий.
В конце 30-х гг. интенсивные исследования фагов из Германии и Франции "переместились" в США, что, во многом, связано с работой Макса Дельбрюка (19061981) - немецкого специалиста по квантовой физике, заинтересовавшегося генетикой. В 1938 г. он сосредоточился на изучении биологии фагов в Калифорнийском технологическом институте в Пасадене - крупном научном центре, биологическим отделом в котором последовательно руководили такие ученые как Томас Морган и Лайнус Полинг (в тот период один из сотрудников Полинга - Эмори Эллис, занимаясь изучением размножения вирусов, в качестве модели выбрал фаг). По инициативе Дельбрюка к 1940 г. в
США сложилась группа исследователей (С.Лурия, Э.Эллис, А.Херши, Т. Андерсен и др.), известная в научных кругах как "фаговая".
Исследования, проведенные "фаговой" группой, оказались весьма плодотворными и позволили выяснить детали цикла развития фагов и динамику их популяций. Кроме того, используя фаг в 1943 г. Лурия и Дельбрюк разработали тест, позволивший доказать мутационную основу изменчивости бактерий. Более того, разрабатывая генетические аспекты бактериофагии, эти ученые, по существу, заложили основы молекулярной биологии. Однако, истинное значение этих работ было оценено лишь спустя четверть века, и Дельбрюк, Херши и Лурия в 1969 г. были удостоены Нобелевской премии "за открытие цикла репродукции вирусов и развитие генетики бактерий и вирусов".
После того, как в 1944 г. бактериологи из Рокфеллеровского института в Нью-Йорке Освальд Эйвери, Колин Мак-Леод и Маклин Мак -Карти, повторив опыты Ф.Гриффитса по трансформации пневмококков (1928), установили, что веществом, ответственным за трансформацию бактерий, оказалась ДНК, стало ясно, что именно ДНК является хранителем и переносчиком генетической информации. Это еще больше консолидировало усилия ученых по развитию генетики бактерий и фагов (все известные тогда фаги являлись ДНК-содержащими).
В 1946 г. американцы Джошуа Ледерберг и Эдвард Тейтум открыли процесс конъюгации бактерий, с помощью которой вскоре была построена первая генетическая карта кишечной палочки. Далее, в 1951 г. Ледерберг и Н.Циндер обнаружили, что умеренные фаги способны переносить отдельные участки хромосомы одной бактерии в другую, изменяя, таким образом, свойства последней. Такой перенос ученые назвали "трансдукцией". Работа американских ученых, внесшая немалый вклад в формирование представлений о процессах генетической рекомбинации у бактерий и структуре их генетического аппарата, получила высокую оценку - Ледерберг и Тейтем (совместно с Д.Бид-лом) в 1958 г. стали лауреатами Нобелевской премии.
В 1951 г. Эстер Ледерберг выделила из кишечной палочки новый фаг, названный ею фагом-лямбда. Оказалось, что трансдукция, осуществляемая этим фагом, всегда сопровождается переносом из бактерии в бактерию гена, ответственного за синтез фермента гала-тозидазы. Такая трансдукция получила название "специфической".
И, наконец, в 1952 г. в лаборатории Колд-Спринг-Харбор Альфред Херши и Марта Чейз, используя радиоактивные изотопы серы (для маркировки белков фага) и фосфора (им метили фаговую ДНК), установили, что в инфицированных фагом бактериях обнаруживается только фаговая ДНК, но не белки. Это означало, что заражение бактерии фагом происходит исключительно за счет проникновения в нее только фаговой ДНК.
Стоит упомянуть и то, что генетические исследования с фагами кишечной палочки в конце 50-х гг. ХХ
в. проводил и известный американский генетик Сеймур Бензер, который на основе своих наблюдений в 1957 г. ввел в генетику используемый ныне термин "цистрон".
В 1959 г. Роберт Синхеймер установил, что геном фага фХ174 представлен однонитчатой кольцевидной ДНК, а вскоре были обнаружены РНК-содержащие фаги.
Тем временем, работы по изучению фагов возобновились в послевоенной Франции, в институте Пас-тера. Исследования Э. и Э.Вольманов, в 1943 г. погибших в нацистском концлагере, продолжил Андре Львов (1902-1994). Уже к 1950 г. он доказал, что лизоген-ные бактерии могут длительно делиться, не продуцируя свободный фаг, но сохраняя способность нести в своем геноме гены фага и передавать их по наследству - их потомство сохраняет способность в определенных условиях вновь начать продукцию свободного фага. Львов пришел к выводу о том, что фаги сохраняются в бактериях в латентном состоянии и, скорее всего, представлены только их генами, которые связаны с хромосомой бактерии. Эту форму фага он назвал "профагом" (позднее этот термин преформировался в "провирус").
Дальнейшее развитие этих исследований привело Львова его колле - Франсуа Жакоба, Жака Моно и Эл-лие Вольмана к мысли о возможности использования трансдукции для изучения механизма регуляции активности генов бактерий. И, надо признать, что использование методики встраивания ДНК лямбда-фага в хромосому кишечной палочки и индукции лямбда-репрессора в немалой степени способствовало открытию упомянутого механизма, за которое французские ученые Львов, Жакоб и Моно в 1965 г. получили Нобелевскую премию.
Ими было установлено, что умеренный фаг подавляет активность своего генома, синтезируя особый белок - репрессор. Последний, связывая специфический участок в ДНК фага, мешает ферменту РНКполи-меразе начать транскрипцию. Такой неактивный геном фага (профаг) может встраиваться в бактериальную хромосому или оставаться в свободном состоянии, в виде плазмиды. Бактерия же, несущая профаг, становится лизогенной. И, хотя лизогеннное состояние довольно стабильно, но если число молекул реп-рессора станет ниже "порогового", немедленно возобновится транскрипция генома фага и его репродукция, приводящая к лизису бактерий. В то же время, некоторые фаги, однажды заразив бактерию, становятся ее постоянными обитателями, но не образуют профага. Они постоянно образуются в клетке и, покрываясь капсидом, выходят из нее через специфическую пору, не причиняя бактерии особого вреда.
Таким образом, менее, чем за полвека после первого сообщения Туорта, было доказано следующее: 1) фаги обладают собственным наследственным материалом, представленным не только двухнитчатой ДНК, но и другими типами генома; 2) будучи живыми, фаги могут изменять свою наследственность (мутиро-
вать) и эволюционировать; 3) фаги могут обмениваться генетическим материалом с бактериями, в которых они размножаются и 4) фаги могут переносить генетическую информацию из одной бактерии в другие и изменять наследственный материал бактерий.
За этот период использование фагов оказало заметное влияние на практическую медицину в отношение как диагностики, так и терапии бактериальных инфекций.
Применение фагов в лабораторно-микробиологи-ческой практике в свое время обеспечило ощутимое расширение возможностей этиологической диагностики бактериальных инфекций и ее техническое упрощение - простота методики фаготипирования бактерий позволила широко использовать ее в клинико-диагностических и эпидемиологических исследований. С другой стороны, признак фаголизабельности бактерий настолько устойчив, что до сих пор включается во все определители бактерий и применяется для таксономических целей.
На возможность применения фагов для лечения бактериальных инфекций указывал еще д'Эррель, который на протяжении более 15 лет потратил много усилий на их применение для лечения раневых и, особенно, кишечных инфекций, и обобщил свои собственные многолетние наблюдения, проведенные ряде стран Юго-Восточной Азии и Африки, в книге "Явление излечения инфекционных заболеваний", изданной в 1938 г. в Париже. Некоторое время фаги довольно успешно использовались в лечении бактериальных инфекций и другими врачами, но после открытия пенициллина этот метод в большинстве стран был оставлен (их применение с лечебной целью не прекращалось лишь в бывшем СССР).
Интерес к фаготерапии возродился после появления тревожных признаков постепенного, но неуклонного снижения эффективности антибиотикотерапии бактериальных инфекций и возрастания смертности от инфекций, не поддающихся лечению антибиотиками.
Однако сегодня отношение к методу фаготерапии и, даже, фагопрофилактики остается не однозначным, а перспективы его применения для лечения и профилактики бактериальных инфекций оцениваются довольно сдержанно. Одни исследователи, признавая за этим методом право на применение при инфекционных заболеваниях, не поддающихся антибиотико-терапии, отмечают его существенные недостатки, но другие ученые полагают, что этот метод все же имеет немалые шансы на расширение сферы клинического применения.
Какими будут итоги этой дискуссии, покажет время.
Если вирусы растений и животных были открыты приблизительно в одно и то же время (на рубеже XIX и XX веков), то бактериофаги - вирусы бактерий были открыты почти на 20 лет позже. Однако изучение именно фагов впервые позволило понять тонкие механизмы репродукции вирусов вообще и понять, как
этот процесс оказывает воздействие на организм. Более того, оказалось, что значение фагов в природе исключительно велико - они выполняют функцию одного из важных факторов эволюции бактерий, а значит, косвенно, и их хозяев - т.е. практически всех многоклеточных организмов.
В ходе работ с фагами был открыт ряд закономерностей, весьма важных для общей и частной микробиологии и инфекционной патологии, вызванной бактериями. Методические подходы, использовавшиеся в работе с фагами уже в начале 50-х гг. прошлого века позволили обнаружить в бактериях внехромосомные ДНК-элементы, ответственные за передачу бактериям резистентности к антибиотикам, названные в 1952 г. Ледербегом "плазмидами". Оказалось, что плазмиды, как и фаги, играют важную роль в природе, обеспечивая "горизонтальный" перенос генетической информации, происходивший как на ранних, так и на поздних (и современном) этапах эволюции.
Исследование роли фагов в патогенезе инфекционных заболеваний показало существование болезней, тяжесть течения которых прямо связана с фагами. Все дело в том, что умеренные фаги, проникнув в высокопатогенные бактерии, способны захватить и включать в свой геном те участки бактериальной хромосомы, в которых компактно расположены гены, детерминирующие экспрессию факторов патогеннос-ти или токсигенности этих бактерий. Перенося эти участки в менее патогенные бактерии того же вида, фаги "превращают" их в высокопатогенные возбудители. Примерами таких "профаговых" заболеваний могут быть дифтерия, скарлатина, коклюш, некоторые формы дизентерии, холеры, и возможно, даже менингит.
Теоретическое значение исследований по фагам имело исключительную ценность и для других областей биологии и медицины. Так, концепция об интеграции профага в клеточный геном оказалась чрезвычайно плодотворной при трактовке молекулярных механизмов вирусного канцерогенеза и подтверждении основных положений вирусно-генетической концепции злокачественных опухолей.
И, наконец, исследование фагов и плазмид привело к формированию теоретических основ и практических подходов, нашедших применение в генной ин-
женерии и биотехнологии. Достаточно привести лишь два примера, демонстрирующих объективность этого положения.
Так, в начале 60-х гг. ХХ в. было открыты механизмы контроля клеткой специфической модификации и рестрикции фага, от которых зависит, встроится ли фаговая ДНК в нового хозяина или будет экспрессироваться, инициируя литическую активность фага. Это открытие, создавшее прямую предпосылку для развития техники рекомбинаций ДНК, в 1978 г принесло ее автору - Вернеру Арберу - Нобелевскую премию по физиологии и медицине.
Вторым примером может послужить тот факт, что в экспериментах, проведенных в 1972 г. в Стенфор-дском университете Полом Бергом и его коллегами, в качестве первого "вектора", переносящего клеточные гены, способные встраиваться в генетический аппарат клетки-реципиента, была использована именно ДНК фага лямбда. Как известно, эта работа привела к воссозданию первой рекомбинантной ДНК, содержавшей фрагменты ДНК вируса SV40, кишечной палочки и ее бактериофага. Сегодня 1972 год, когда была осуществлена эта разработка, автор которой в 1980 г. был удостоен Нобелевской премии по химии, считается датой рождения генной инженерии.
Заметим, что благодаря использованию фага как вектора, в 1989 г. группе американских ученых удалось "вслепую" проклонировать в кишечной палочке вирусные белки, выделенные из крови больного, и на их основе создать первую иммунологическую тест-систему для диагностики вирусного гепатита С.
И, завершая этот небольшой очерк о фагах, необходимо подчеркнуть, что если даже утилитарное значение их применения в диагностической и терапевтической медицине уже исчерпано и сегодня не имеет особых перспектив дальнейшего развития, то сами фаги, по крайней мере, в обозримом будущем, наверняка, не утратат своего значения в качестве исключительно ценного инструмента при проведении широкого круга научных исследований в области биомедицины и средства для решения новых задач генной инженерии и биотехнологии.
М.К.Мамедов Международная Экоэнергетическая Академия, г.Баку
