CC BY
79
Вирулентность и антибиотикорезистентность изолятов Klebsiella pneumoniae у новорожденных с локализованными и генерализованными формами клебсиеллезной инфекции
Х.С. Хаертынов1, В.А. Анохин1, А.А. Ризванов2, Ю.Н. Давидюк2, С.В. Халиуллина1, С.А. Любин3, Ф.М. Казакова4, М.А. Сатрутдинов4, М.Г. Фаттахов5
1ФГБОУ ВО «Казанский государственный медицинский университет» Минздрава РФ, г Казань, Россия; 2ФГАОУВО Казанский (Приволжский) федеральный университет Министерства образования РФ, г Казань, Россия; 3ГАУЗ Городская детская больница № 1, г Казань, Россия;
4ГАУЗ Детская республиканская клиническая больница, г Казань, Россия; 5ГАУЗ Республиканская клиническая больница, г Казань, Россия
Virulence and Antibiotic Resistance of Isolates of Klebsiella Pneumoniae in Newborns With Localized and Generalized Forms of Infection
Kh.S. Khaertynov1, V.A. Anohin1, A.A. Rizvanov2, Yu.N. Davidyuk2, S.V. Khaliullina1, S.A. Lyubin3, F.M. Kazakova4, M.A. Satrutdinov4, M.G. Fattahov5
1Kazan State Medical University, Kazan, Russia; 2Kazan (Privolzhsky) Federal University, Kazan, Russia; 3City Children's Hospital No. 1, Kazan, Russia; 4Children's Republican Clinical Hospital, Kazan, Russia; 5Republican Clinical Hospital, Kazan, Russia
Цель: изучение влияния вирулентности и чувствительности к антибиотикам K. pneumoniae на течение и исход локализованных и генерализованных форм инфекции у новорожденных.
Проведено исследование 25 изолятов K. pneumoniae, выделенных из крови (12 изолятов) и кала (13 изолятов) детей с различными формами неонатальной инфекции. Первую группу составили 12 детей с бактериологически доказанным неона-тальным сепсисом, из крови которых была выделена K. pneumoniae. Во вторую группу вошли 13 детей с локализованной бактериальной инфекцией, протекавшей в форме пневмонии, у которых K. pneumoniae была выделена из кала. Методом по-лимеразной цепной реакции проведено определение факторов вирулентности изолятов K. pneumoniae — rmpA, аэробактина и колибактина. Определение чувствительности K. pneumoniae к антибиотикам проводилось методом Kirby—Bauer. Для выявления способности K. pneumoniae продуцировать р-лактамазы расширенного спектра действия (БЛРС) был использован метод двойных дисков.
Результаты. В первой группе у 8 из 12 детей изоляты K. pneumoniae продуцировали БЛРС. Бактерии были чувствительны к меропенему, амикацину, в 4 случаях — к ципрофлоксацину. У одного ребенка отмечалась устойчивость бактерий к меро-пенему. Остальные 4 изолята были чувствительны к цефалоспоринам 3-го поколения, защищенным аминопенициллинам, амикацину, меропенему и ципрофлоксацину. Ген rmpA был выявлен в изолятах K. pneumoniae у 6 детей. Исследование этих колоний K. pneumoniae дало во всех случаях положительный результат на «стринг-тест». У 3 изолятов выявлены гены сиде-рофоров, аэробактина и колибактина. Аэробактин и колибактин продуцировали только штаммы, несущие ген rmpA. Во второй группе детей БЛРС продуцировали 3 изолята K. pneumoniae (23%). Ген rmpA был обнаружен в 8 из 13 случаев, гены аэробактина и колибактина — в 11 и 7 соответственно. «Стринг-тест» был положительным в 8 случаях, это были только rmpA-позитивные бактерии. Сидерофоры выявлялись как у rmpA-позитивных, так у rmpA-негативных изолятов. У 2 детей микробы продуцировали БЛРС и были rmpA-позитивными. В одном случае изоляты не имели ни характерных факторов вирулентности, ни БЛРС.
Заключение. Риск развития локализованных и генерализованных форм неонатальной клебсиеллезной инфекции в значительной мере определяется микробиологическими особенностями микроорганизма, его резистентностью и вирулентностью. Мы наблюдали клинические варианты заболевания, вызванные K. pneumoniae, обладающие одновременно двумя свойствами — высокой агрессивностью и устойчивостью к антибактериальной терапии.
Ключевые слова: дети, неонатальный сепсис, Klebsiella pneumoniae, вирулентность, антибиотикорезистентность.
Для цитирования: Хаертынов Х.С., Анохин В.А., Ризванов А.А., Давидюк Ю.Н., Халиуллина С.В., Любин С.А., Казакова Ф.М., Сатрутдинов М.А., Фаттахов М.Г. Вирулентность и антибиотикорезистентность изолятов Klebsiella pneumoniae у новорожденных с локализованными и генерализованными формами клебсиеллезной инфекции. Рос вестн перинатол и педиатр 2018; 63:(5): 139-146. DOI: 10.21508/1027-4065-2018-63-5-139-146
Objective. To study the effect of virulence and antibiotic sensitivity of K. pneumoniae on the course and outcome of localized and generalized forms of infection in newborns.
The authors studied 25 samples of K. pneumoniae isolated from the blood (12 isolates) and feces (13 isolates) of the children with various forms of neonatal infection. Group 1 consisted of 12 children with bacteriologically proven neonatal sepsis, K. pneumoniae was isolated of their blood. Group 2 included 13 children with localized bacterial infection in the form of pneumonia, K. pneumoniae was isolated from their feces. The PCR method was used to determine the virulence factors of the isolates of K. pneumoniae-rmpA, aerobactin and colibactin. The sensitivity of K. pneumoniae to antibiotics was determined by the Kirby-Bauer method. The double disk method was used to determine the ability of K. pneumoniae to produce extended-spectrum p-lactamases (ESBL). Results. In Group 1 the isolates of K. pneumoniae produced ESBL in 8 children out of 12. The bacteria were sensitive to meropenem, amikacin and ciprofloxacin in 4 cases. One child demonstrated resistance to meropenem. The remaining 4 isolates were sensitive
to the third-generation cephalosporins protected by aminopenicillins, amikacin, meropenem and ciprofloxacin. The rmpA gene was determined in the K. pneumoniae isolates in 6 children. The "string-test" of these colonies of K. pneumoniae in all cases gave a positive result. The genes of siderophores, aerobactin and colibactin were found in 3 isolates. Aerobactin and colibactin produced only rmpA-bearing strains.
3 isolates (23%) of K. pneumoniae produced ESBL in Group 2. In 8 out of 13 cases there was rmpA—gene and genes of aerobactin and colibactin in 11 and 7 cases accordingly. The "string-test" was positive in 8 cases, and there were only rmpA-positive bacteria. Siderophores were detected both in rmpA-positive and rmpA-negative isolates. The microbes produced BLBR and were rmpA-posi-tive in 2 children. In one case, the isolates had neither the characteristic virulence factors, nor BLBR.
Conclusion. The risk of developing localized and generalized forms of neonatal klebsiella infection is largely determined by microbiological features of the microorganism, its resistance and virulence. We observed clinical variants of the disease caused by K. pneumoniae, which simultaneously had two properties: high aggressiveness and resistance to antibiotic therapy.
Key words: children, neonatal sepsis, Klebsiella pneumoniae, virulence, antibiotic resistance
For citation: Khaertynov Kh.S., Anohin V.A., Rizvanov A.A., Davidyuk Yu.N., Khaliullina S.V., Lyubin S.A., Kazakova F.M., Satrutdinov M.A., Fattahov M.G.Virulence and Antibiotic Resistance of Isolates of Klebsiella Pneumoniae in Newborns With Localized and Generalized Forms of Infection. Ros Vestn Perinatol i Pediatr2018; 63:(5): 140-146 (in Russ). DOI: 10.21508/1027-4065-2018-63-5-140-146
Неонатальный сепсис — актуальная инфекционная патология новорожденных, характеризующаяся как тяжестью клинических проявлений, так и высокой летальностью [1, 2]. Как известно, недоношенность и незрелость факторов врожденного и адаптивного иммунитета являются основными причинами сепсиса у новорожденных. Однако существенное влияние на течение и исход заболевания оказывают микробиологические и генетические особенности возбудителя — его вирулентность и антибиотикорезистентность. С антибиотикорези-стентностью в первую очередь ассоциируется неэффективность антибактериальной терапии, а отсюда — и риск неблагоприятного исхода [1, 3].
В этом контексте особый интерес представляет группа так называемых супербактерий, включающая ванкомицинрезистентные штаммы Enterococcus fae-cium, метициллинрезистентные Staphylococcus aureus (MRSA), штаммы Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumani, Pseudomonas aeruguinosa и Enterobacter species, продуцирующие ß-лактамазы расширенного
© Коллектив авторов, 2018
Адрес для корреспонденции: Хаертынов Халит Саубанович — к.м.н., доц. кафедры детских инфекций КГМУ , ORCID: 0000-0002-9013-4402 Анохин Владимир Алексеевич — д.м.н., проф., зав. кафедрой детских инфекций КГМУ , ORCID: 0000-0003-1050-9081
Халиуллина Светлана Викторовна — д.м.н., доц. кафедры детских инфекций КГМУ
420012 Казань, ул. Бутлерова, д. 49
Ризванов Альберт Анатольевич — д.б.н., проф. кафедры генетики Института фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского) Федерального университета, ORCID: 0000-0002-9427-5739 Давидюк Юрий Николаевич — ст. научн. сотр. Open Lab «Генные и клеточные технологии» Института фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского) Федерального университета, ORCID: 00000003-1537-3099
420021 Казань, ул. Парижской коммуны, д. 9
Любин Сергей Анатольевич — зав. отделением реанимации новорожденных городской детской больницы № 1, ORCID: 0000-0002-1322-2601 420034 Казань, ул. Декабристов, д. 125а
Казакова Фатима Мусаевна — зав. отделением патологии новорожденных Детской республиканской клинической больницы
Сатрутдинов Марат Альбертович — зав. отделением реанимации новорожденных Детской республиканской клинической больницы 420138 Казань, ул. Оренбургский тракт, д. 140
Фаттахов Марат Гыльмыханович — зав. отделением реанимации новорожденных Перинатального Центра Республиканской клинической больницы 420064 Казань, ул. Оренбургский тракт, д. 138
спектра действия (БЛРС) [3]. Аббревиатура ES-KAPE (по первым буквам видов перечисленных выше бактерий), омофоничная английскому Escape, впрямую указывает на проблемы современной антибиотикотерапии.
K. pneumoniae — признанная причина неонаталь-ного сепсиса [4, 5]. Частота клебсиеллезного сепсиса в структуре неонатального сепсиса в развитых странах колеблется от 4 до 9%, а в развивающихся равна уже 16—28% [6]. При этом наличие у клебсиелл БЛРС — один из важных (и очень часто необходимых) компонентов «инфекционного госпитализма» [7—9].
Другой значимый фактор, влияющий на течение и исход сепсиса, — вирулентность K. pneumoniae. К их числу относят адгезины (фимбрии 1-го и 3-го типов), капсульный антиген, липополисахарид, си-дерофоры [10, 11]. В 80-90-е годы прошлого века на Тайване были идентифицированы так называемые гипервирулентные штаммы K. pneumoniae (hv-KP), которые вызывали тяжелые инвазивные формы инфекции в виде абсцессов печени, менингита, эндофтальмита у ранее здоровых взрослых пациентов [12-14]. Высокую вирулентность этих штаммов связывают с выработкой регулятора мукоидного фенотипа (rmpA) [15]. В настоящее время случаи клебсиеллезной инфекции, вызванной hv-KP, регистрируют по всему миру [16, 17]. При этом, как показывает практика, наибольшую опасность представляют случаи, связанные с гипервирулентными штаммами, способными одновременно продуцировать и БЛРС [18, 19]. Именно такое сочетание гипервирулентности с множественной лекарственной устойчивостью штаммов K. pneumoniae представляет колоссальную опасность для пациентов.
Цель исследования: изучение влияния вирулентности и чувствительности к антибиотикам K. pneu-moniae на течение и исход локализованных и генерализованных форм инфекции у новорожденных.
Характеристика детей и методы исследования
Исследование проведено в период с 2015 по 2018 г. Изучались 25 изолятов K. pneumoniae, выделенных из крови (12 изолятов) и кала (13 изолятов) детей с различными формами неонатальной инфекции. Все
пациенты были разделены на две группы. Первую группу составили 12 детей с бактериологически доказанным неонатальным сепсисом, из крови которых была выделена K. pneumoniae. Критерии диагностики сепсиса включали наличие одного или нескольких очагов инфекции, развитие синдрома системного воспалительного ответа с высоким уровнем (выше 1,5 мг/дл) С-реактивного белка. У 4 детей диагностирован ранний неонатальный сепсис, у 8 — поздний. Всем детям проводилось комплексное лечение, включавшее антибиотики, инфузионную терапию, искусственную вентиляцию легких (ИВЛ) различной продолжительности и внутривенное введение иммуноглобулинов. Эмпирическая антибиотикотерапия в подобных случаях осуществлялась амоксиклавом, а после выделении из крови K. pneumoniae корректировалась по результатам антибиотикочувствитель-ности. Во вторую группу вошли 13 детей с локализованной бактериальной инфекцией, протекавшей в форме пневмонии, у которых K. pneumoniae была выделена из кала. У 5 детей пневмония развилась на фоне аспирационного синдрома. У 2 детей K. pneu-moniae была выделена из ротоглотки.
Определение С-реактивного белка. Количественное определение СРБ в крови проводилось иммуно-турбидиметрическим методом [20] на анализаторе «CobasIntegra 800» с использованием набора реагентов компании «Roche» (Швейцария) согласно инструкции производителя.
Выделение изолятов K. pneumoniae: 1 мл крови больных забирали стерильным шприцем, смешивали с 20 мл бульона из мозгасердца (CondaPronadisa, Испания) и инкубировали при 37°С в течение 7 дней, затем проводили посев на поверхность кровяного агара, агара MacConkey (Oxoid, Великобритания) и инкубировали при 37°C в течение 24 часов [21]. Для выделения K. pneumoniae из ликвора был использован шоколадный агар (Oxoid, Великобритания). Изоляты бактерий были идентифицированы морфологически и на основании биохимических тестов (окраска по Граму, тесты на подвижность, продукцию индола и уреазный тест).
Тест на гипервирулентность. Колонии K. pneumoni-ae, выделенные при культивировании на кровяном агаре и агаре MacConkey (Oxoid, Великобритания), были тестированы на способность формировать му-коидную нить. Стандартной микробиологической петлей касались поверхности колоний K. pneumoniae, затем петлю медленно поднимали. Формирование му-коидной нити более 5 мм в длину указывало на гипервирулентный фенотип микроорганизма.
Определение факторов вирулентности K. pneumoniae. Методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) проведено определение генов rmpA, аэробактина и коли-бактина.
Определение чувствительности K. pneumoniae к антибиотикам. Тестирование на чувствительность
K. pneumoniae к антибиотикам осуществлялось методом Kirby—Bauer, согласно протоколу клинических лабораторных стандартов (CLSI) [22]. Для определения способности K. pneumoniae продуцировать БЛРС использован метод двойных дисков согласно протоколу CLSI [22].
Выделение ДНК. Несколько колоний K. pneumoniae, взятых с поверхности агара MacConkey, смешивали с 50 мкл дистиллированной воды. ДНК бактерий выделяли, используя набор реактивов ("Litech", Россия), согласно инструкции производителя.
ПЦР-детекция генов факторов вирулентности. Образцы ДНК проанализированы методом ПЦР. Праймеры сиквенсов, использованные для амплификации фрагментов генов, представлены в табл. 1.
Комитет по этике Казанского государственного медицинского университета одобрил это исследование, от родителей детей было получено письменное информированное согласие в соответствии с принципами, утвержденными настоящим протоколом (Федеральный закон Ю23-Ф3 от 21.11.2011 г. «О защите здоровья граждан в Российской Федерации»).
Результаты
Установлено, что неонатальный сепсис в 6 из 12 случаев развился у недоношенных детей, трое из которых родились с очень низкой массой тела. При этом 7 из 12 детей родились путем кесарева сечения. В 4 случаях выявлены материнские факторы риска инфицирования новорожденных: у 3 женщин во время беременности диагностирован кольпит, у одной — хронический пиелонефрит. Очаги инфекции были установлены у 8 детей. У 3 пациентов сепсис протекал в форме гнойного менингита, у 3 — в виде некротического энтероколита, у 2 — в виде пневмонии и энтероколита. В 4 случаях имела место септицемия. У 3 детей (двое с гнойным менингитом, один — с некротическим энтероколитом, осложнившимся разлитым перитонитом) наступил летальный исход. Подробная характеристика пациентов представлена в табл. 2.
У 8 из 12 детей изоляты K. pneumoniae продуцировали БЛРС. Бактерии были резистентны ко всем ами-нопенициллинам (защищенным и незащищенным), цефалоспоринам 3-го поколения, гентамицину, в 4 случаях — к ципрофлоксацину. Эти же микробы были чувствительны к меропенему и амикацину (табл. 3). У одного ребенка отмечалась устойчивость бактерий и к меропенему. Остальные 4 изолята были устойчивы только к незащищенным аминопенициллинам, но чувствительны к цефалоспоринам 3-го поколения, защищенным аминопенициллинам, амикацину, меропенему и ципрофлоксацину.
При изучении вирулентности микроорганизма ген rmpA был выявлен у K. pneumoniae в 6 из 12 случаев неонатального сепсиса. В 3 случаях этот ген обнаружен у микробов, выделенных от детей с гнойным
Таблица 1. Праймеры, использованные для ПЦР Table 1. Primers used for PCR
Ген ll|PIMMCpi>l Cllk'BCIK'Olt (5' ^ 3') Размер ПЦР-продукта, п.н. Ссылки на литературу
rmpA Forward (ACGACTTTCAAGAGAAATGA) 418 [23]
Reverse (CATAGATGTCATAATCACAC)
rmpA Forward (CATAAGAGTATTGGTTGACAG) 462 [24]
Reverse (CTTGCATGAGCCATCTTTCA)
iroD Forward (GCATAGGCGGATACGAACAT) 531 [23]
Reverse (CACAGGGCAATTGCTTACCT)
iroN Forward (CTGTCGGCATCGGTTTTATT) 556 [25]
Reverse (TGGCGTGTCGATTATTACCA)
clbA Forward (ATGAGGATTGATATATTAATTGGAC) 579 [26]
Reverse (ATTCTGCCCATTTGACGAATG)
clbB Forward (GATTTGGATACTGGCGATAACCG) 732 [26]
Reverse (CCATTTCCCGTTTGAGCACAC)
Таблица 2. Клинико-лабораторная характеристика пациентов (Me; межквартильный размах) Table 2. Clinical and laboratory characteristics of patients (Me; interquartile range)
Параметры Группа новорожденных
сепсис, и=12 пневмония, и=13 р
Гестационный возраст, нед 36,5 [31,5—39] 35 [32—39] 0,9
Масса при рождении, г 2600 [1575—3285] 2500 [1900—2890] 0,9
Пол (мальчики), абс (%) 7 (58) 8 (62)
Родоразрешение: кесарево сечение, абс (%) 7 (58) 7 (54)
Оценка по шкале Апгар, баллы 7 [5,5—7,5] 7 [7—8] 0,15
Клиническая форма, абс (%): менингит пневмония пневмония и энтероколит некротический энтероколит септицемия 3 (35) 0 2 (17) 3 (25) 4 (33) 13 (100)
С-реактивный белок, мг/дл 3,6 [0,9—9,8] 0,2 [0,1—0,4] 0,002
Лейкоциты в крови -109/л 17,7 [4,7—21,6] 11,7 [8,3—13,2] 0,3
Тромбоциты в крови -Ю'/л 38,5 [14,5—48,5] 212 [204—291] 0,0002
Умерли, абс (%) 3 (25) 0
менингитом, в 2 случаях — при септицемии и в одном - от пациента с некротическим энтероколитом. Исследование колоний K. pneumoniae, обнаруживших наличие гена rmpA, дало положительный результат на «стринг-тест».
У 3 изолятов выявлены гены сидерофоров аэро-бактина и колибактина (табл. 4). Аэробактин и коли-бактин продуцировали только штаммы, несущие ген rmpA. Три rmpA-положительных изолята K. pneumoni-ae не продуцировали ни аэробактин, ни колибактин. У 2 из 3 погибших детей изоляты бактерий содержали гены rmpA, аэробактина и колибактина. Это были доношенные дети с поздним началом неонатального
сепсиса, протекавшего в форме гнойного менингита, осложнившегося отеком-набуханием головного мозга. Следует отметить, что эти же микробы продуцировали БЛРС. Третий случай летального исхода был связан с низковирулентным штаммом K. pneu-moniae (rmpA-отрицательным), но продуцирующим БЛРС. Это был недоношенный ребенок, родившийся с очень низкой массой тела, у которого в последующем развился некротический энтероколит, осложнившийся разлитым перитонитом.
В группе новорожденных с пневмонией (вторая группа) недоношенными родились 7 из 13 детей, из них двое - с очень низкой массой тела, 7 родились
Таблица 3. Результаты антибиотикочувствительности изолятов K.pmeumoniae у новорожденных с сепсисом и локализованной бактериальной инфекцией, абс (%)
Table 3. Antibiotic susceptibility of K.pneumoniae isolates in neonates with sepsis and with localized bacterial infection, abs (%)
Группа новорожденных
Антибиотик (содержание в диске, мкг) сепсис, n= =12 пневмония, n=13
чувствителен устойчив чувствителен устойчив
Ампициллин (25) 0 12(100) 0 13 (100)
Ампициллин/клавуланат (30) 5 (42) 7 (58) 10 (77) 3 (23)
Цефтазидим (30) 5 (42) 7 (58) 10 (77) 3 (23)
Цефотаксим (30) 5 (42) 7 (58) 10 (77) 3 (23)
Цефтриаксон (30) 5 (42) 7 (58) 10 (77) 3 (23)
Цефепим (30) 5 (42) 7 (58) 10 (77) 3 (23)
Ципрофлоксацин (5) 8 (67) 4 (33) 10 (77) 3 (23)
Меропенем (10) 11 (92) 1 (8) 10 (77) 0
Амикацин (30) 12 (100) 0 10 (77) 0
путем кесарева сечения. Во всех случаях заболевание завершилось выздоровлением. В 6 случаях выявлены материнские факторы риска инфицирования новорожденных: у 2 матерей отмечался длительный безводный период (более 18 ч), в 2 случаях околоплодные воды были мекониальными, еще у 2 женщин во время беременности был диагностирован кольпит.
В этой группе детей БЛРС продуцировали 3 из 13 изолятов. Ген rmpA обнаружен в 8 случаях, гены аэро-бактина и колибактина — у 11 и 7 изолятов соответственно. «Стринг-тест» был положительным в 8 случаях. Это были только rmpA-позитивные бактерии. Сидерофоры выявлялись как у rmpA-позитивных, так и у rmpA-негативных изолятов (см. табл. 4). У 2 детей микробы продуцировали БЛРС и были rmpA-позитивными. В одном случае изоляты не имели ни характерных факторов вирулентности, ни БЛРС.
Сравнительная оценка частоты выделения бета-лактамаз расширенного спектра действия и фактора вирулентности — гена rmpA показало, что риск нео-натального сепсиса ассоциирован в первую очередь с продукцией БЛРС (OR=6,8; ДИ 3,6-12,7; р<0,001), а не с наличием у микроба гена rmpA (OR=0,6; ДИ 0,3-1,1; р=0,1).
Обсуждение
Антибиотикорезистентность бактерий — одна из основных причин неэффективности терапии при нозоко-миальных инфекциях и сепсисе. Всемирная организация здравоохранения в 2017 г. обозначила K. pneumoniae, продуцирующие БЛРС, как одну из наиболее опасных супербактерий, включив ее вместе с Acinetobacter bau-mani и Pseudomonas aeruguinosa по степени опасности в группу бактерий наивысшего приоритета [27]. Новорожденные дети для таких бактерий - наиболее уязвимые пациенты. Как известно, риск тяжелой нео-натальной инфекции (сепсиса, пневмонии) ассоциируется с низким гестационным возрастом, малой массой
тела при рождении, а также длительным нахождением в отделениях интенсивной терапии [28, 29]. В нашем исследовании в группе детей с неонатальным сепсисом недоношенные составили 45%*, в группе детей с пневмонией — 54%. Изоляты K. pneumoniae продуценты БЛРС у детей с сепсисом, выявлены в 67% случаев, в группе детей с пневмонией — в 23%.
Оценка антибиотикочувствительности показала, что БЛРС-продуцирующие изоляты K. pneumoniae в обеих группах были чувствительны к меропене-му и амикацину. Только у одного ребенка микробы, выделенные из крови, были устойчивы к меропе-нему, что, вероятно, было связано с продукцией ими карбапенемаз. Очевидно, что в случаях развития доказанного или предполагаемого неонатально-го сепсиса, обусловленного БЛРС-продуцирующи-ми штаммами бактерий семейства Enterobacteriacae, меропенем и амикацин должны рассматриваться в качестве средств приоритетной антибактериальной терапии. Раннее введение антибиотиков, как известно, является одним из важных условий эффективной терапии сепсиса, поскольку задержка с ее началом может существенно повлиять на исход заболевания [30]. Однако клинические и лабораторные признаки нео-натального сепсиса, в том числе клебсиеллезного, часто неспецифичны, а потому ранняя диагностика нередко бывает затруднительной. Из лабораторных признаков неонатального сепсиса, ассоциируемых с грамотрицательными бактериями, ряд исследователей указывает на частое развитие тромбоцитопе-нии [31]. В нашем исследовании тромбоцитопения наблюдалась у 11 из 12 детей с сепсисом, тогда как в группе детей с пневмонией количество тромбоцитов оставалось в пределах нормальных значений на протяжении всего периода заболевания.
* Здесь и далее % вычислен условно, т.к. количество детей меньше 100.
Таблица 4. Факторы вирулентности изолятов K.pmeumoniae у новорожденных с сепсисом и локализованной бактериальной инфекцией
Table 4. Virulence factors of K.pneumoniae isolates in neonates with sepsis and with localized bacterial infection
Очаг инфекции Исход заболевания БЛРС rmpA Аэробактин Колибактин
iro D iro N clb A clb B
Дети с неонатальным сепсисом (n=12)
Менингит Выздоровление - + - - --
Менингит Летальный + + + + ++
Менингит Летальный + + + + +-
Энтероколит Выздоровление - + - - --
Энтероколит Выздоровление + - - - --
Энтероколит + Пневмония Выздоровление + - - - --
Энтероколит + Пневмония Выздоровление + - - - --
Септицемия Выздоровление - - - - --
Септицемия Выздоровление - - - - --
Септицемия Выздоровление + + + + -+
Энтероколит Летальный + - - - --
Септицемия Выздоровление + + - - --
Новорожденные с пневмонией (n=13)
Пневмония Выздоровление - - - - --
Пневмония Выздоровление + + + + --
Пневмония Выздоровление - + + + ++
Пневмония Выздоровление - - + + --
Пневмония Выздоровление - - + + -+
Пневмония Выздоровление - + + + -+
Пневмония Выздоровление - - + + --
Пневмония Выздоровление - + + + -+
Пневмония Выздоровление - + + + -+
Пневмония Выздоровление + - - - --
Пневмония Выздоровление + + + + -+
Пневмония Выздоровление - + + + -+
Пневмония Выздоровление - + + +
Несмотря на известную роль БЛРС в развитии неонатального сепсиса, очевидно, что неменьшая (а возможно, даже и решающая) принадлежит факторам вирулентности K. pneumoniae — капсульному полисахариду, липополисахариду, адгезинам и сиде-рофорам [10, 11]. Обнаружение у K. pneumoniae гена rmpA указывает на гипервирулентный генотип бактерий [15]. Штаммы hv-KP, в отличие от «классических» низковирулентных штаммов (c-KP), характеризуются большей резистентностью к действию комплемента и фагоцитозу [11, 32]. Механизмы, обеспечивающие устойчивость hv-KP к фагоцитозу, включают низкую опсонизацию бактерий, связанную с наличием у них толстой капсулы, блокирование толл-подобных рецепторов (TLR), тормозящих синтез интерлейкина-8 — основного хемоаттрактанта нейтрофилов [11].
Среди факторов, обеспечивающих рост и выживание клебсиелл в организме инфицированного хозяина, важнейшими являются сидерофоры аэробактин, эн-теробактин, иерсиниабактин и колибактин [11, 15]. Как известно, железо необходимо для роста и размножения бактерий. Доступ к железу служит ключевым фактором, обеспечивающим K. pneumoniae способность вызывать инвазивные формы заболевания в организме как иммунокомпрометированных, так и им-мунокомпетентных людей [33]. Hv-KP продуцируют молекулы сидерофор в значительно большем количестве и в более активной форме, чем c-KP [33]. В нашем исследовании rmpA был выявлен в изолятах от детей с неонатальным сепсисом и пневмонией в 50% (6 детей) и 61% (8 детей) случаев соответственно. И хотя риск развития сепсиса ассоциировался не столько с экспрессией изолятами гена rmpA, сколько с продук-
цией БЛРС (OR=6,8; ДИ 3,6-12,7; р<0,001), следует все же признать, что неблагоприятный исход от неонатального сепсиса имел место у детей с гипервирулентными штаммами K. pneumoniae, являвшимися также продуцентами БЛРС. По данным литературы, летальность среди пациентов, инфицированных hv-KP, колеблется от 3 до 42% [16, 34], достигая максимума (55%) при развитии бактериемии [35]. Очевидно, что риск неблагоприятного исхода возрастает при наличии у hv-KP множественной резистентности к антибиотикам, что позволяет рассматривать их как чрезвычайно опасные супербактерии.
Заключение
Риск развития локализованных и генерализованных форм неонатальной инфекции в значительной
ЛИТЕРАТУРА (REFERENCES)
1. Verma P., Berwal P.K., Nagaraj N., Swami S., Jivaji P., Narayan S. Neonatal sepsis: epidemiology, clinical spectrum. Recent antimicrobial agents and their antibiotic susceptibility pattern. Int J Contemp Pediatr 2015; 2: 176-180. DOI: 10.18203/2349-3291.ijcp20150523
2. Camacho-Gonzales A., Spearman P. W., Stoll B.J. Neonatal infectious diseases: evaluation of neonatal sepsis. Pediatr Clin North A 2013; 60: 367-389. DOI: 10.1016/j.pcl.2012.12.003
3. BorghesiA., Stronati M. Superbugs and antibiotics in the newborn. Journal of Pediatric and Neonatal Individualized Medicine 2015; 4(2): e040253. DOI: 10.7363/040253
4. Stoll B.J., Hansen N.I., Fanaroff A.A., Wright L.L., Carlo W.A., Ehrenkranz, R.A. et al. Late onset sepsis in very low birth weight neonates: the experience of the NICHD Neonatal Research Network. Pediatrics 2002; 110: 285-291.
5. Dong Y, Speer C.P. Late-onset neonatal sepsis: recent developments. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed 2015; 100(3): F257-263. DOI: 10.1136/archdischild-2014-306213
6. Zea-Vera A., Ochoa T.J. Challenges in the diagnosis and management of neonatal sepsis. J Trop Pediatr 2015; 61: 1-13. DOI: 10.1093/tropej/fmu079
7. Podschun R., Ullmann U. Klebsiella spp. As Nosocomial Pathogens: Epidemiology, Taxonomy, Typing Methods, and Pathoge-nicity Factors. Clin Microbiol Rev 1998; 4: 11: 589-603.
8. Haller S., Eller C., Hermes J., Kaase M., Steglich M., Radonic A. et al. What caused the outbreak of ESBL-producing Klebsiella pneumoniae in a neonatal intensive care unit, Germany 2009 to 2012? Reconstucting transmission with epidemiological analysis and whole-genome sequencing. BMJ 2015; 5: e007397. DOI: 10.1136/bmjopen-2014- 007397
9. Хаертынов Х.С., Анохин В.А., Николаева И.В., Семенова Д.Р., Любин С.А., Агапова И.В. и др. Клебсиеллезный неонатальный сепсис. Медицинский вестник Северного Кавказа 2016; 11(1): 82-86. DOI: 10.14300/mnnc.2016. 11004 [Khaertynov Kh.S., Anohin V.A., Nikolaeva I.V., Semenova D.R., Lyubin S.A., Agapova I.V. et al. Neonatal sepsis caused by Klebsiella. Meditsinskij vestnik Severnogo Kavkaza 2016; 11:82-86. DOI: 10.14300/mnnc.2016. 11004 (in Russ)]
10. Broberg C.A., Palacios M., Miller V.L. Klebsiella: a long way to go towards understanding this enigmatic jet-setter. F1000Prime Reports 2014; 6: 64: DOI: 10.12703/P6-64
11. Li B., ZhaoY., Liu C., Zhou D. Molecular pathogenesis of Klebsiella pneumonia. Future Microbiol 2014; 9: 9: 10711081. DOI: 10.2217/fmb.14.48
мере определяется как неонатальными факторами, так и биологическими особенностями микроорганизма, его резистентностью и вирулентностью. Традиционно внебольничные штаммы высоковирулентны, «проигрывая» госпитальным в резистентности к антибиотикам. Мы же наблюдали клинические варианты заболевания, вызванные микробами, обладающими одновременно двумя свойствами — высокой агрессивностью и устойчивостью к антибактериальной терапии. Тяжелые формы и неблагоприятный исход — классические атрибуты болезней, вызванных этими, так называемыми гипервирулентными штаммами K. pneumoniae. Очевидно, что подобного рода клинические ситуации будут складываться в будущем, что необходимо учитывать в работе практическим врачам.
12. Liu Y.C., Cheng D.L., Lin C.L. Klebsiella pneumoniae liver abscess associated with septic endophthalmitis. Arch Intern Med 1986; 146: 1913—1916.
13. Cheng D.L, Liu Y.C, Yen M.Y, Liu C.Y, Wang R.S. Septic metastatic lesions of pyogenic liver abscess. Their association with Klebsiella pneumoniae bacteremia in diabetic patients. Arch Intern Med 1991; 151: 1557—1559.
14. Wang J.H, Liu Y.C, Lee S.S., Yen M.Y, Chen Y.S., Wang J.H. et al. Primary liver abscess due to Klebsiella pneumoniae in Taiwan. Clin Infect Dis 1998; 26: 1434—1438.
15. Shon A.S., Bajwa R.P., Russo T.A. Hypervirulent (hypermu-coviscous) Klebsiella pneumoniae: a new and dangerous breed. Virulence 2013; 4: 2: 107—118. DOI: 10.4161/viru.22718
16. Deere D., Verdet C., Emirian A., Le Gourrierec T., Petit J.C., Offenstadt G. et al. Emerging severe and fatal infections due to Klebsiella pneumoniaein two university hospitals in France. J Clin Microbiol 2011; 49: 3012—3014. DOI: 10.1128/ JCM.00676-11
17. Bialek-Davenet S., Criscuolo A., Ailloud F., Passet V., Jones L., Delannoy-Vieillard A.S. et al. Genomic definition of hypervirulent and multidrug-resistant Klebsiella pneumoniae clonal groups. Emerg Infect Dis 2014; 20: 1812—1820. DOI: 10.3201/eid2011.14020622
18. Surgers L., Boyd A., Girard P.M., Arlet G., Decre D. ESBL-Producing Strain of Hypervirulent Klebsiella pneumoniae K2, France. Emerging Infectious Diseases 2016; 22(9): 1687— 1688. DOI: 10.3201/eid2209.160681
19. Khaertynov Kh.S., Anokhin V.A., Davidyuk Y.N., Nicolaeva I.V., Khalioullina S.V., Semyenova D.R., Alatyrev E.Yu., Skvortsova N.N., Abrahamyan L.G. Case of meningitis in a neonate caused by an extended-spectrum-beta-lactamase-producing strain of hypervirulent Klebsiella pneumoniae. Frontiers in Microbiology 2017; 8: 1576. DOI: 10.3389/ fmicb.2017.01576
20. Алексеев В.В., Алипов А.Н., Андреев В.А., Антонов В.Г., Асеев М.В., Бадиков В.Д. и др. Медицинские лабораторные технологии: руководство по клинической лабораторной диагностике. 3-е издание. Под редакцией А.И.Карпищенко. М: ГЭОТАР-Медиа 2013; 792. [Alekseev V.V., Alipov A.N., Andreev V.A., Antonov V.G., Aseev M.A., Badikov V.D. et al. Medical laboratory technologies. A.I. Karpishchenko (ed). Moscow: GEHOTАR-Media 2013; 792. (in Russ)]
21. Collee J.G., Mackie T.J., McCartney J.E. Practical medical microbiology, 14th edn. New York, Churchill Livingstone, 1996; 978.
22. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance standards for antimicrobial Susceptibility testing. 22ed. Informational Supplement. PA, USA, 2014; 32.
23. Luo Y, Wang Y., Ye L, Yang J. Molecular epidemiology and virulence factors of pyogenic liver abscess causing Klebsiella pneumoniae in China. Clin Microbiol Infect 2014; 20:818— 824. DOI: http://dx.doi.org/10.1111/1469-0691.12664
24. Compain F., Babosan A., Brisse S, Genel N, Audo J., AilloudF. et al. Multiplex PCR for detection of seven virulence factors and K1/K2 capsular serotypes of Klebsiella pneumoni-ae. J Clin Microbiol 2014; 52: 4377—4380. D0I:10.1128/ JCM.02316-14
25. Yu W.L., Ko W.C, ChengK.C., LeeC.C, LaiC.C, ChuangY.C. Comparison of prevalence of virulence factors for Klebsiella pneumoniae liver abscesses between isolates with capsular K1/K2 and non-K1/K2 serotypes. Diagn Microbiol Inf Dis 2008; 62: 1—6. DOI: 10.1016/j.diagmicrobio.2008.04.007
26. Lai Y.C, Lin A.C., Chiang M.K., Dai Y.H, Hsu C.C, Lu M.C. et al. Genotoxic Klebsiella pneumoniae in Taiwan. PLOS ONE. 2014; 9(5): e96292. DOI: 10.1371/journal.pone.0096292
27. Branswell H. WHO releases list of world's dangerous superbugs. Stat 2017; February: 27.
28. Cortese F., Scicchitano P., Gesualdo M., Filaninno A., De Giorgi E. Early and Late Infections in Newborns: Where Do We Stand? A Review. Pediatr Neonatol 2016; 57: 265— 273. DOI: 10.1016/j.pedneo.2015.09.007
29. Samuelsson A., Isaksson B., Hanberger H., Olhager E. Late-onset neonatal sepsis, risk factors and interventions: an
Поступила 27.07.18
Конфликт интересов:
Авторы данной статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов и финансовой поддержки, о которых
необходимо сообщить.
analysis of recurrent outbreaks of Serratia marcescens, 2006— 2011. J Hosp Infect 2014; 86: 57-63. DOI: http://dx.doi. org/10.1016/j.jhin.2013.09.017
30. Rhodes A., Evans L.E., Alhazzani W., Levy M.M., Antonelli M., Ferrer R, Kumar A. et al. Surviving Sepsis Campaign: International Guidelines for Management of Sepsis and Septic Shock: 2016. Intensive Care Med 2017; 43: 304-377. DOI: 10.1007/s00134-017-4683-6
31. Arif S.H., Ahmad I., Ali S.M., Khan H.M. Thrombocytopenia and Bacterial Sepsis in Neonates. Indian J Hematol Blood Transfus 2012; 28(3): 147-151. DOI: 10.1007/s12288-011-0118-7
32. Doorduijn D.J., Rooijakkers S.H.M., van Schaik W., Bar-doel B.W. Complement resistance mechanisms of Klebsiella pneumoniae. Immunobiol 2016; 221: 1102-1109. DOI: 10.1016/j.imbio.2016.06.014
33. Holden V.I., Breen P., Houle S., Dozois Ch.M., Bachman M.A. Klebsiella pneumoniae Siderophores Induce Inflammation, Bacterial Dissemination, and HIF-1 Stabilization during Pneumonia. mBio 2016; 7(5): e01397-16. DOI: 10.1128/ mBio.01397-16
34. Fang C.T., Chen Y.C, Chang S.C, Sau W.Y, Luh K.T. Kleb-siella pneumoniae meningitis: timing of antimicrobial therapy and prognosis. QJM 2000; 93: 45-53.
35. Lin Y.T., Jeng Y.Y., Chen T.L., Fung C.P. Bacteremic community- acquired pneumonia due to Klebsiella pneumoniae: clinical and microbiological characteristics in Taiwan, 20012008. BMC Infect Dis 2010; 10: 307. DOI: 10.1186/14712334-10-307
Received on 2018.07.27
Conflict of interest: The authors of this article confirmed the lack of conflict of interest and financial support, which should be reported.
