CC BY
135
УДК 619:616.981.25:636.5
ВИДОВОЙ СПЕКТР И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА СТАФИЛОКОККОВ, ИЗОЛИРОВАННЫХ ОТ ПТИЦ, В УСЛОВИЯХ КРУПНОЙ ПТИЦЕФАБРИКИ
Е.М. Гордина, Э.С. Горовиц, С.В. Поспелова, Е.В. Афанасьевская,
ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. акад. Е.А. Вагнера»
Гордина Екатерина Михайловна - e-mail: kate_alex.07@mail.ru
Изучены видовое разнообразие стафилококков и их биологические свойства, изолированных с 2007 по 2013 г. на одной из крупных птицефабрик Пермского края. Из 1561 выделенного штамма микроорганизмов различных таксономических групп 344 были представителями рода Staphylococcus. Стафилококки характеризовались широким видовым разнообразием (28 видов), преобладали S. aureus и S. gallinarum. Практически все выделенные штаммы S. aureus обладали лецитовителлазной, ДНК-азной и 29,4% гемолитической активностями. Все штаммы S. aureus образовывали биопленки. При этом степень их выраженности была выше, чем у коагулазоотрицательных стафилококков (КОС). Наличие указанных факторов вирулентности выявлено и у значительного процента штаммов КОС. Из них наибольшим набором обладали S. xylosus. Изолированные КОС обладали биопленкообразующей способностью. Все штаммы S. aureus сохранили чувствительность к изучаемым бета-лактамным антибиотикам и были резистентны к линкомицину. Большая часть КОС была чувствительна к амикацину и также резистентна к линкомицину. Выявлены полирезистентные штаммы стафилококков, как S. aureus, так и КОС. Антибиотикочувствительность стафилококков, выделенных от птиц, во многом зависит от спектра антибактериальных препаратов, применяемых на птицефабрике. Обращает на себя внимание наличие ряда факторов вирулентности и антибиотикорезистентности среди «птичьих» штаммов КОС.
Ключевые слова: стафилококки, видовое разнообразие, биологические свойства.
The purpose of this study was to investigate the biological properties and species diversity of staphylococci isolated from 2007 to 2013 in one of the largest poultry farms of Perm region. From 1561 isolated strains of different taxonomic groups 344 were identified as Staphylococcus. The Staphylococci isolated from birds were characterized by a wide diversity of species (28 species), the most prevalent were S. aureus and S. gallinarum. Almost all the isolates of S. aureus had DNA : ase activity and 29,4% - hemolytic activity. All strains of S.aureus formed biofilms. The degree of their severity was higher than that of coagulase-negative staphylococci (CNS). The presence of these virulence factors was identified among the majority of CNS. S. xylosus showed the most expressed factors of virulence. All isolated CNS had the ability of biofilm formation. All strains of S.aureus were susceptible to beta - lactam antibiotics and resistant to lincomycin. Most of the CNS were susceptible to amikacin and also resistant to lincomycin. Multidrug-resistant strains of staphylococci were revealed among the strains of S.aureus and CNS. The antibiotic susceptibility of Staphylococci isolated from birds depends a lot on the spectrum of antibacterial drugs used in the poultry farm. The presence of virulence factors and antimicrobial resistance among the strains of CNS isolated from birds should be noticed.
Key words: staphylococci, the species diversity, the biological properties.
Бактерии рода Staphylococcus относятся к числу широко распространенных микроорганизмов. Они колонизируют различные биотопы человека и животных, могут присутствовать в воде, в воздухе и на различных объектах окружающей среды. Если видовой состав и биологические свойства стафилококков, вегетирующих у человека, достаточно хорошо изучены, то видовому спектру стафилококков птиц и их биологическим свойствам посвящено ограниченное число работ. В частности, J. Kawano et all. выделяли коагулазоотрицательные стафилококки (КОС) от больных цыплят, и эти же виды стафилококков были выделены из воздуха на птицефабрике [1]. Об инфицированно-сти метициллинрезистентными S. aureus 25% проб куриного мяса в Германии сообщает Andrea T. Febler et all. [2]. Geert Huys et all. выделяли КОС и S. aureus на всех этапах переработки птицы. Они пришли к выводу, что стафилококки являются наиболее распространенными микроорганизмами на птицефабрике. Эти микроорганизмы способны колонизировать и выживать на всех этапах обработки продукции за счет своей устойчивости к антибиотикам и дезинфектантам [3]. И, наконец, С. Лыско и О. Макарова на основании изучения микробиоты в инкубаториях птицефабрик Западной Сибири установили, что бактерии рода Staphylococcus были одними из превалирующих [4].
В то же время циркуляция различных штаммов стафилококков на предприятиях птицепрома представляет потенциальную опасность для сотрудников, инфицирование которых может происходить как при непосредственном контакте с птицами, так и опосредованно, в результате чего повышается риск возникновения и развития у них гнойносептических заболеваний. Около 50% типичных и атипичных штаммов S. aureus продуцируют энтеротоксины, способные вызывать пищевые отравления у людей, которые зачастую связаны с потреблением мяса и субпродуктов птиц.
С другой стороны, современное промышленное птицеводство невозможно представить без систематического применения различных антибактериальных препаратов, которые уменьшают экономические потери от инфекционных болезней и стимулируют рост птицы. Несмотря на то, что они используются в малых, нередко суббактериостати-ческих дозах, антибиотики могут не только отрицательно влиять на качество продукции, но и способствовать селекции резистентных штаммов бактерий.
Недостаточная изученность видового разнообразия стафилококков, выделяемых от промышленной птицы, их биологических свойств, в том числе распространенности антибиотикорезистентных штаммов, не позволяет оценить значение этого фактора как резервуара и потенциального источника стафилококковой инфекции для населения.
Цель исследования: изучение видового спектра и биологических свойств стафилококков, изолированных от кур, в условиях крупной птицефабрики.
Материалы и методы
В течение 2007-2013 гг. проведено бактериологическое исследование 753 образцов внутренних органов птиц: печень, сердце, селезенка, легкие. Материал получали от бройлеров различных возрастов (от 2 до 45 суток), в результате вынужденного убоя. Выделенные культуры стафилококков идентифицировали главным образом на
основании биохимических свойств, используя Staphytest 24. Для идентификации энтеробактерий применяли Enterotest 24 фирмы ERBOLACHEMA (Чехия). Гемолитическую активность выделенных культур определяли на кровяном агаре, лецитоветиллазную (ЛВ) - на желточно-солевом [5]. Изучение ДНК-азной активности осуществляли на DNAseTestAgar производства Испании, в соответствии с инструкцией производителя.
Биопленкообразующую способность штаммов стафилококков изучали в 96-луночных полистероловых планшетах для иммуноферментного анализа (Медполимер, Россия). В 6 лунок каждого ряда планшета вносили по 100 микролитров инокулума определенного штамма стафилококка, содержащего 107 КОЕ/мл, после чего планшеты инкубировали в течение 24 часов в термостате (370С). Через сутки планктонную культуру из всех лунок удаляли, биопленки дважды аккуратно промывали 10 мМ фосфатным буфером (рН 7,2), затем окрашивали 0,1% раствором генциан-виолета с последующей спиртовой экстракцией связавшегося красителя для оценки общей биомассы образовавшихся пленок. Детекцию окрашенных экстрактов биопленок осуществляли на ридере BenchmarkPlus (BioRad, США) при длине волны 570 нм (O'Toole G., 2000), степень био-пленкообразования выражали в оптической плотности. Антибиотикочувствительность изолированных штаммов определяли диско-диффузионным методом в соответствии с МУК 2004 г. [6]. В качестве тестируемых использовали препараты, рекомендованные МУК для определения антибиотикочувствительности стафилококков. Статистическую обработку полученных результатов проводили в программе Statistica 6.0. Достоверность различий определяли путем расчета критерия Манна-Уитни и точного критерия Фишера.
Результаты и их обсуждение
На основании семилетнего динамического бактериологического наблюдения за птицами промышленного стада выявлены определенные закономерности их инфицирования, которые в значительной мере зависели от возраста птицы. Если в первые сутки внутренние органы цыплят, как правило, оставались практически стерильными, то к 40-м их инфицированность достигала 78,3%. Микроорганизмы различных таксономических групп чаще выделяли из печени и селезенки. За весь срок наблюдения была выделена 1561 культура микроорганизмов 58 видов. Преобладали грамотрицательные микроорганизмы - 55%, которые при идентификации были отнесены к 20 видам. В основном это были представители семейства Enterobacteriacae: E. coli, Enterobacter cloacae, Proteus mirabilis, Klebsiella sp. Что касается грампозитивной флоры, то она составила 45% от общего количества выделенных микроорганизмов. Главным образом это были представители родов Staphylococcus, Enterococcus и Streptococcus, а также Streptobacillus. Стафилококки были доминирующим родом (таблица 1).
Всего было выделено 344 штамма 28 видов стафилококков. Среди них преобладали S. aureus (21,2%) и S. gallinarum (15,7%). В серии специальных наблюдений изучены биологические свойства ряда штаммов стафилококков. При их выборе мы учитывали частоту встречаемости этих видов у птиц и человека. В результате объектом наблюдения
служили S. aureus, S. gallinarum, S. xylosus, S. warneri. В таблице 2 суммированы результаты изучения основных биологических свойств различных штаммов стафилококков.
ТАБЛИЦА 2.
Факторы вирулентности стафилококков, выделенных от птиц
Из представленных данных следует, что ДНК-азную и гемолитическую активности регистрировали у представителей всех изучаемых видов стафилококков. Большим набором факторов вирулентности обладали штаммы S. xylosus и S. aureus. Штаммы S. aureus достоверно чаще обладали выраженными лецитовителлазными и ДНК-азными свойствами. Что касается гемолитических свойств,
то они чаще были присущи штаммам Б. xylosus. В связи с этим следует отметить, что представители КОС, изолированные от человека, как правило, относительно редко обладают ДНК-азной и лецитовителлазной активностями, «птичьи» штаммы по этим же характеристикам существенно отличались.
В качестве одного из факторов персистенции исследована биопленкообразующая способность стафилококков. Образование биопленок регистрировалось у всех 63 штаммов (таблица 3).
ТАБЛИЦА 3.
Интенсивность пленкообразования стафилококков, выделенных от птиц
Вид Среднее значение оптической плотности р
S.gallinarum (п=22) 0,530+0,085 0,26*
S. xylosus (п=14) 0,357+0,055 0,004*
S.warneri (п=10) 0,433+0,069 0,004*
S.aureus (п=17) 0,584+0,094
Примечание:* - в сравнении с S. aureus.
Спектр полученных значений оптической плотности степени выраженности пленкообразования у разных штаммов всех изученных видов варьировал в широких пределах от 0,122 до 1,617. При этом интенсивность биопленко-образования была достоверно выше у штаммов S. aureus, чем у штаммов S. xylosus и S. warneri. Таким образом, изолированные штаммы S. aureus обладали не только более широким набором факторов вирулентности по сравнению с КОС, но и более активно образовывали биопленки.
Изучена антибиотикочувствительность изолированных культур стафилококков (рис. 1). Все штаммы S. aureus были чувствительны к тестируемым бета-лактамным антибиотикам, в том числе к оксациллину, а также и к амикацину (рис. 1а). В то же время значительная доля культур была устойчива к линкомицину.
Штаммы S. gallinarum также характеризовались абсолютной чувствительностью к амикацину и ампициллину (рис. 1б). Однако большая часть этих культур была рези-стентена не только к линкомицину (68%), но и к доксици-клину (55%) и оксациллину (36%). Что касается антибио-тикочувствительности культур S. warneri, то они были чувствительны только к ампициллину (рис. 1в). Резистентность к линкомицину и доксициклину регистрировали у 67% этих изолятов. Штаммы S. xylosus проявляли чувствительность к амикацину, но значительное число штаммов были резистентны к линкомицину, доксициклину и ампициллину (рис. 1г). Важно отметить, что полирезистентными были 5,9% штаммов S. aureus, 21,4% - S. xylosus, 22,73% -S. gallinarum и 30,0% - S. warneri.
Таким образом, из всех изучаемых изолятов наиболее резистентны к антибактериальным препаратам были представители вида S. warneri. Все изученные штаммы проявляли устойчивость к левофлоксацину, линкомицину и доксициклину. Скорее всего, это связано с применением данных групп антибактериальных препаратов в условиях птицефабрики. Интересно отметить, что «птичьи» штаммы этих видов в отличие от представителей КОС, изолированных от человека, значительно чаще были резистентны к тестируемым антибактериальным препаратам. Циркуляция полирезистентных штаммов стафилококков в условиях
ТАБЛИЦА 1.
Спектр бактерий рода Staphylococcus, выделенных от кур
№ Вид Количество выделенных культур
1 S.aureus 73 (21,2±1,14%)
2 S.gallinarum 54 (15,7+0,85%)
3 S.cochnii 34 (9,9±0,53%)
4 S.sciuri 30 (8,7+0,47%)
5 S.epidermidis 22 (6,4+0,42%)
6 S.lentus 22 (6,4+0,42%)
7 S.xylosus 14 (4,1±0,22%)
8 S.hominis 12 (3,5±0,19%)
9 S.arlettae 12 (3,5±0,19%)
10 S.warneri 10 (2,9±0,16%)
11 S.equorum 10 (2,9±0,16%)
12 S.saprophyticus 8 (2,4+0,13%)
13 S.haemoliticus 7 (2,0±0,11%)
14 S.simulans 4 (1,2±0,06%)
15 S.piscifermentans 4 (1,2±0,06%)
16 S.felis 4 (1,2±0,06%)
17 S.carnaticus 3 (0,9±0,05%)
18 S.intermedius 3 (0,9±0,05%)
19 S.caprae 3 (0,9±0,05%)
20 S.chromogenes 3 (0,9±0,05%)
21 S.kloosi 2 (0,6±0,03%)
22 S.pasteuri 2 (0,6±0,03%)
23 S.hyicus 2 (0,6±0,03%)
24 S.lutrae 2 (0,6±0,03%)
25 S.capitis 1 (0,3±0,02%)
26 S.condimenti 1 (0,3±0,02%)
27 S.schleiferi 1 (0,3±0,02%)
28 S.lugdunensis 1 (0,3±0,02%)
Всего 344
Вид Частота встречаемости признака
Гемолитическая активность ЛВ активность ДНК-азная активность
абс % р абс % р абс % р
S.aureus (n=17) 5 29,41+7,3 14 82,35+19,97 15 88,24+21,4
S.gallinarum (n=22) 5 22,73±4,85 0,45 1 4,55+0,97 0,0001 4 18,18±3,88 0,0001
S. xylosus (n=14) 5 35,75+9,55 0,5 3 21,43+5,73 0,001 11 78,57+21,0 0,4
S.warneri (n=10) 3 30,0+9,55 0,65 0 0 5 50,0+15,81 0,042
Всего (n=63) 18 28,57±6,09 18 28,57±6,09 35 55,55±11,84
Примечание: р - достоверность различий каждого вида в сравнении с S. aureus.
РИС.
Распределение штаммов стафилококков, выделенных от птиц, по чувствительности к анализируемым антибактериальным препаратам.
птицефабрики представляет угрозу для персонала, непосредственно контактирующего с птицами. Результатом может быть увеличение антибиотикорезистентности культур стафилококка, колонизирующих человека.
Выводы
1. Из 1561 культуры микроорганизмов, изолированных от кур в течение 7 лет, 344 были представителями рода Staphylococcus. Они отличались широким видовым разнообразием (28 видов). Среди них преобладали S. aureus (21,2%) и S. gallinarum (15,7%).
2. Практически все выделенные штаммы S. aureus обладали набором факторов вирулентности. Эти же штаммы характеризовались наиболее выраженной способностью к биопленкообразованию. По существу 50% штаммов КОС также обладали гемолитической, лецитовителлазной и ДНК-азной активностями. Все они образовывали биопленки, но степень их выраженности была ниже.
3. В условиях птицефабрики циркулирует значительное количество антибиотикорезистентных штаммов как S. aureus, так и КОС. При этом все выделенные штаммы S. aureus были чувствительны к оксациллину. Антибиотикорезистентность культур в существенной мере определяется использованием определенного ряда антибактериальных препаратов, предусмотренных технологией выращивания птицы.
4. Большинство выделенных штаммов стафилококков обладали широким набором факторов вирулентности, выраженной способностью к биопленкообразованию и устойчивостью к антибактериальным препаратам, что
представляет существенную опасность для здоровья персонала птицефабрики и людей, потребляющих мясо и субпродукты промышленных птиц. [Д
ЛИТЕРАТУРА
1. Junichi Kawano, Akira Shimizu, Yoshihiro Saitoh, Minoru Yagi, Takehiko Saito and Ryoichi Okamoto. Isolation of Methicillin-Resistant Coagulase-Negative Staphylococci from Chickens. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY. Sept. 1996. Р. 2072-2077.
2. Andrea T. Febler, Kristina Kadlec, Melanie Hassel Tomasz Hauschild, Christopher Eidam, Ralf Ehricht, Stefan Monecke, and Stefan Schwarz. Characterization of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Isolates from Food and Food Products of Poultry Origin in Germany. APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY. Oct. 2011. Р. 7151-7157.
3. Geert Huys, Klaas D'Haene, Johan Van Eldere, Alexander von Holy, and Jean Swings. Molecular Diversity and Characterization of Tetracycline-Resistant Staphylococcus aureus Isolates from a Poultry Processing Plant. APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY. Jan. 2005. Р. 574-579.
4. Лыско С., Макарова О. Микробиологический мониторинг в инкубаториях. Птицеводство. 2009. № 8. С. 43-44.
Lisko S., Makarova O. Microbiologicheskii monitoring v incubatoriiah. Pticevodstvo. 2009. № 8. S. 43-44.
5. Приказ Минздрава СССР от 22.04.1985 № 535. «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования в клиникодиагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений».
Prikaz Minzdrava SSSR ot22.04.1985 № 535. «Ob unifikacii microbiologicheskih (bacteriologicheskih) metodov issledovania v kliniko-diagnosticheskih laboratoriah lechebno-profilakticheskih uchrezhdenii».
6. Методические Указания МУК 4.2.1890-04. «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам».
Metodicheskie Ukazania MUK 4.2.1890-04. «Opredelenie chuvstvitelnosti microorganizmov k antibacterialnim preparatam».
