CC BY
57УДК 616-008.87:582.282.23:615.472.5
ВИДОВОЙ СОСТАВ
МИКРООРГАНИЗМОВ,
ОБРАЗОВАНИЕ
БИОПЛЕНОК И
КОЛОНИЗАЦИЯ
ЦЕНТРАЛЬНЫХ
ВЕНОЗНЫХ И
УРЕТРАЛЬНЫХ
КАТЕТЕРОВ
1Пинегина О.Н. (ассистент кафедры)*, Васильева Н.В., (директор института), 2Сатурнов А.В. (зав. отделением)
1 НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина и кафедра медицинской микробиологии, СевероЗападный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова; 2 Ленинградская областная клиническая больница, Санкт-Петербург, Россия
© Коллектив авторов, 2013
Использование центральных венозных и уретральных катетеров при оказании медицинской помощи сопряжено со значительным риском развития инфекционных осложнений. Микроорганизмы, взаимодействуя с поверхностью катетера, формируют биопленки - сообщества микробных клеток, погруженных во внеклеточный полисахаридный матрикс и проявляющих высокую резистентность к факторам окружающей среды. Изучен видовой состав микроорганизмов, образующих биопленки на центральных венозных и уретральных катетерах, у пациентов в отделе-нияхреанимации и интенсивной терапии.
Ключевые слова: биопленки, Candida species, катетер-ассо-циированные инфекции
SPECIES COMPOSITION OF MICROORGANISMS, FORMATION OF BIOFILMS AND COLONIZATION OF CENTRAL VENOUS AND URINARY CATHETERS
1 Pinegina O.N. (assistant lecturer of the chair), 1 Vasilyeva N.V. (director of Institute),
2 Saturnov A.V. (head of department)
1 Kashkin Research Institute of Medical Mycology and Chair of Medical Microbiology, North-western State Medical University named after I.I. Mechnikov;
2 Leningrad Regional Clinical Hospital, St. Petersburg, Russia
* Контактное лицо: Пинегина Ольга Николаевна, тел.: (812) 303-51-40
© Collective of authors, 2013
The using of central venous and urinary catheters in health care is associated with a significant risk of infectious complications. Microorganisms interacting with catheter surface, form biofilm -communities microbial cells embedded in a matrix of extracellular polysaccharide and exhibiting high resistance to environmental factors. We have studied the species composition of microorganisms that form biofilms in central venous and urinary catheters at patients in intensive care units.
Key words: biofilm, Candida species, catheter-associated infections
ВВЕДЕНИЕ
При использовании изделий медицинского назначения, таких как катетеры, шунты, протезы клапаны сердца, трахеостомы и пр., возникают предпосылки для формирования дополнительных экологических ниш для микроорганизмов, способных адгезиро-ваться, вырастать и размножаться на вновь возникших поверхностях. Микроорганизмы в кооперации формируют биопленки - микробные сообщества, относительно изолированные от внешней среды и, как следствие, резистентные к антимикробным агентам [1-8]. Полагают, что 65% всех хронических инфекционных заболеваний человека ассоциированы с биопленками [9, 10].
Использование центральных венозных катетеров связано со значительным риском развития инфекционных осложнений, самыми тяжелыми из которых являются инфекции кровотока. Как правило, они сопряжены с высокой летальностью и значительно увеличивают пребывание пациента в стационаре и рост затрат на его лечение. В соответствии с данными, полученными Европейской группой по сепсису (European Sepsis Group) у пациентов в ОРИТ, 28% ка-тетер-ассоциированных инфекций относят к сепсису, 24% - к тяжелому сепсису, 30% - к септическому шоку [1]. Объединенные в кластеры микроорганизмы, в свою очередь, могут быть причиной септической эмболии, внутрибольничного эндокардита и пр. [11].
Инфекции мочевыводящих путей - наиболее распространенный тип внутрибольничных инфекций, хотя и не сопряженный со столь высокой летальностью, как катетер-ассоциированные инфекции кровотока. В США катетер-ассоциированные инфекции мочевыводящих путей регистрируют у 449 334 пациентов в год [12].
По данным Европейского центра по профилактике и контролю заболеваний (Euriopean Center for Disease Prevention and Control), ежегодно у 4 миллионов пациентов в Евросоюзе возникают инфекции, связанные с оказанием медицинской помощи, и 37 000 из них умирают непосредственно от этих инфекций. Наиболее распространенные типы инфекций: возникающие в ходе хирургических операций, мочевыводящих путей, кровотока, желудочно-кишечные и пневмонии [13].
К сожалению, сведения о катетер-ассоциирован-ных инфекциях в Российской Федерации ограниче-
ны. В стационарах далеко не всегда осуществляют микробиологическое исследование удаленных катетеров, и публикаций, отражающих данные этих исследований, крайне мало. Отчасти это связано с отсутствием нормативной документации, предписывающей адекватную микробиологическую оценку обсемененности катетера, а также интерпретацию результатов посева.
Бережанский Б.В. с соавторами упоминают о прохождении в нашей стране с 2004 г. многоцентрового клинико-микробиологического исследования кате-тер-ассоциированных инфекций кровотока в отделениях реанимации и интенсивной терапии (CASCAT), посвященного катетер-ассоциированным инфекциям кровотока, согласно которым эти инфекции составили 5,7 случаев на 1000 дней катетеризации, а колонизация центрального венозного катетера (ЦВК) имела место в 16,4% случаев [14].
В связи с этим является актуальным микробиологическое исследование сосудистых и уретральных катетеров (УК), которые удаляли либо по причине отсутствия необходимости в венозном доступе, в ходе плановой замены катетера, либо в случае подозрения на катетер-ассоциированную инфекцию. Особое внимание уделяли выделению грибов, поскольку, на наш взгляд, значение этой группы микроорганизмов часто недооценивают в практической медицине.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследование микробной обсемененности фрагмента катетера (сосудистого или уретрального) проводили количественным методом, предложенным Brun-Buisson (1987). Дистальный фрагмент катетера помещали в стерильную пробирку, содержащую 1 мл физиологического раствора. Затем пробирку встряхивали на вортексе «Heidolph» (Германия) в течение 1 минуты; полученную суспензию высевали количественно на кровяной агар и агар Сабуро. Оставшийся материал засевали в среду накопления на основе триптиказо-соевого бульона (bioMerieux).
Бактерии идентифицировали при помощи анализатора «Vitek 2 Compact» (bioMerieux), а также методом MALDI-ToF-MS на аппарате «Biotyper» (Bruker Daltonik GmbH).
Дрожжи идентифицировали на основании физиологических свойств микромицетов (тест на образование ростковых трубок в сыворотке крови крупного рогатого скота при 37 °С), с помощью тест-системы «Ауксаколор 2» (BioRad), а также методом MALDI-ToF. Для определения дрожжей методом MALDI-ToF-MC чистую 24 часовую культуру дрожжей (1-3 колонии) суспендировали в 300 мкл деионизиро-ванной воды, встряхивали на вортексе в течение 1 минуты, а затем добавляли 900 мкл этанола (95%) и повторно встряхивали на вортексе 1 минуту. Образцы центрифугировали дважды в течение 2 минут при 13000 об/мин и удаляли надосадочную жидкость. Затем к осадку добавляли 50 мкл муравьиной кислоты, тщательно перемешивали и прибавляли 50 мкл аце-
тонитрила. Образцы центрифугировали в течение двух минут при 13000 об/мин. В лунки планшета вносили по 1 мкл надосадочной жидкости, высушивали при 23 оС в течение 5 мин, добавляли 1 мкл матрицы (а-циано-4-гидроксикоричная кислота) и высушивали повторно при тех же условиях. Для идентификации использовали базу данных Вю1урег 3.1.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Было проведено микробиологическое исследование 157 центральных венозных и 60 уретральных катетеров, из которых подавляющее большинство было получено от пациентов, находящихся в отделениях реанимации и интенсивной терапии. Все сосудистые и уретральные катетеры были удалены на 7-10 сутки после установки.
При посеве материала из сосудистых катетеров рост микроорганизмов наблюдали в 39% случаев. Частота встречаемости различных микроорганизмов представлена в таблице 1.
Таблица 1
Частота встречаемости микроорганизмов, выделенных с/из сосудистых катетеров
Группы микроорганизмов Частота встречаемости (%) Виды микроорганизмов Частота встречаемости (%)
Грам (+) бактерии 55,74 Коагулазонегативные стафилококки 31,15»%
Staphylococcus aureus 9,84
Enterococcus faecalis 8,20
Enterococcus faecium 1,64
Micrococcus luteus 1,64
Bacillus sp. 1,64
Corynebacterium 1,64
Грам (-) бактерии 27, 87 Klebsiella pneumonia 9,84
Acinetobacter baumannii 9,84
Pseudomonas aeruginosa 1,64
Escherichia coli 3,28
Stenotrophomonas maltophilia 1,64
Delftia acidovorans 1,64
Candida spp 14,75 Candida parapsilosis 4,92
Candida albicans 3,28
Candida tropicalis 1,64
Candida glabrata 1,64
Candida famata 1,64
Candida krusei 1,64
Миксты 1,64 Candida parapsilosis + Staphylococcus aureus 1,64
Наиболее часто выделяли коагулазонегативные стафилококки (S. epidermidis - в подавляющем большинстве случаев), грамотрицательные палочки (K. pneumoniae и A. baumannii), энтерококки и Candida spp. Эти микроорганизмы могут представлять нормальную микробиоту кожи пациента и медицинского персонала и чаще колонизируют наружную поверхность катетера [15]. Поскольку катетер находится в прямом контакте с кровью, его поверхность быстро покрывается тромбоцитами, плазмой и белками крови - альбумином, фибриногеном, фибронектином и ламинином, что способствует прочной адгезии микроорганизмов и формированию ими биопленки [1, 2].
При посеве УК рост микроорганизмов был получен в 100% случаев (табл. 2).
Таблица 2
Видовой состав микроорганизмов в/на уретральных катетерах
Выделенные микроорганизмы Частота встречаемости (%)
Candida spp. 30,0
Candida spp. + грамотрицательные бактерии 30,0
Candida spp. + грамположительные бактерии 3,33
Ассоциации Candida spp. и 2-х и более видов бактерий 3,33
Грамотрицательные бактерии (чистая культура одного вида) 8,33
Грамположительные бактерии (чистая культура одного вида) 6,67
Ассоциации 2-х и более видов бактерий 18,33
В более чем 60% случаев с УК выделяли Candida spp. в монокультуре или в ассоциации с бактериями (K. pneumonia, A. baumannii и др). Этиологическая структура микроорганизмов, выделенных с УК, представлена на рисунках 1-3.
Рис.1. Candida spp., выделенные с/из УК
Рис. 3. Грамположительные бактерии, выделенные с/из УК
Отличительной особенностью биопленки на уретральных катетерах является то, что некоторые микроорганизмы могут изменять рН окружающей среды за счет продукции уреазы - фермента, расщепляющего мочевину с образованием свободного аммиака. Аммиак, в свою очередь, повышает рН среды и способствует осаждению минералов, таких как кальция фосфат (гидроксиапатит), магния фосфата и аммония (струвита). Эти минералы, накапливаясь в биопленке катетера, образуют так называемые минеральные инкрустации. Было показано, что в течение 4-5 дней просвет катетера может быть полностью блокирован микробной биопленкой. При рентгенологическом микроанализе биопленки в этом катетере выявили, что в ней содержался повышенный уровень кальция, магния и фосфора. Отметим, что уреазу образуют Proteus mirabilis, P. vulgaris, Morganella morganii, Pseudomonas aeruginosa, K. pneumoniae [1].
Различие в видовом составе микроорганизмов, выделенных с/из уретральных и сосудистых катетеров, можно объяснить отличием микробного окружения и материала катетера, т.к. полиуретан, используемый для изготовления сосудистых катетеров, в большей степени препятствует адгезии микроорганизмов, чем силикон, из которого изготавливают УК.
Рис. 2. Грамотрицательные бактерии, выделенные с/из УК
(, 1ЧЦ1 I ■■ .'V .....>..• ¡л S; -Л*1 ■,.
fífcífSííi■ dy.■■
Рис. 4. Микробные биопленки, полученные с/из УК:
а) прямая световая микроскопия ув. 400, C. albicans и
P. aeruginosa, б) флуоресцентная микроскопия ув. 400 C. albicans
Характерной особенностью микробных биопленок является их резистентность к антимикробным препаратам. К механизмам, участвующим в повышенной устойчивости биопленок к антимикробным агентам, предположительно, относят:
1) медленное или неполное проникновение (за счет полисахаридного матрикса) антимикробных препаратов внутрь биопленки;
2) замедление темпов роста микроорганизмов, приводящее к значительному уменьшению мишеней для антимикробных веществ;
3) возникновение субпопуляции покоящихся не-делящихся форм (персисторов) [16], составляющих около 1% всей популяции биопленки [17].
Было показано, что персисторы биопленок P. aeruginosa менее чувствительны к тобрамицину и ионам серебра. С другой стороны, в недавних исследованиях биопленок Candida spp. авторы [18] отмечали, что персисторы не могут обеспечить полной резистентности к антимикотикам.
Дополнительные преимущества могут создавать друг другу участники многовидовых сообществ. Так, на биопленках, сформированных in vivo C. albicans и S. epidermidis, выявили сниженную чувствительность к антибиотикам, включая антимикотики: внеклеточный полисахаридный матрикс, вырабатываемый стафилококком, тормозит проникновение флуконазола, тогда как C. albicans защищает бактерии от ванкоми-цина [19, 20].
Установлено, что Candida spp. в биопленках проявляют выраженную резистентность к флуконазолу и вориконазолу (МИК, подавляющая рост биопленок, в 1000 раз превышает МИК, подавляющую рост планктонных микроорганизмов) [21, 22].
ВЫВОДЫ
1. При посеве материала с/из центральных венозных катетеров микроорганизмы выделяли преимущественно в монокультуре, тогда как биопленки на/в уретральных катетерах были сформированы несколькими видами микроорганизмов в более чем половине случаев. Частота образования микробных биопленок на/в сосудистых катетерах составила 39%, на уретральных - 100%.
2. Чаще всего сосудистые катетеры колонизируются коагулазонегативными и позитивными стафилококками (41%), Candida spp. (15%), энтерококками (9,8%), K. pneumonia (9,8%) и A. baumannii (9,8%).
3. При посеве материала с/из уретральных катетеров Candida spp. выделяли в 66% (в ассоциациях и в монокультуре). Среди бактерий наиболее распространенными агентами были Klebsiella spp. (61%), P. aeruginosa (15%) A. baumannii (12%).
4. Образование биопленок на имплантируемых биоматериалах придает им клиническую значимость, поскольку инфицированное устройство выступает в качестве резервуара патогенных микроорганизмов, резистентных к компонентам иммунной системы и антимикробным агентам [23].
5. Возрастание осведомленности врачей о роли микробных биопленок, формирующихся на/в катетерах, должно оказать положительное влияние на процесс принятия решений о тактике ведения пациентов с имплантируемыми медицинскими устройствами.
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Romeo T. Bacterial Biofilms // Springer. - 2008. - P. 295.
2. Lynch A.S. & Robertson G.T. Bacterial and fungal biofilm Infections // Ann. Rev. Med. - 2008. - Vol. 59. - P. 415-428.
3. Francolini I., Donelli G. Prevention and control of biofilm-based medical-device-ralated infections // FEMS Immunol. Med. Microbiol. - 2010. - Vol. 59. - P. 227-238.
4. Andes D., Nett J., OschelP., et al. Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model // Infect. and Immun. - 2004. - Vol. 72, №10. - P. 6023-6031.
5. Pannanusorn S., Fernandez V. & Romling U. Prevalence of biofilm formation in clinical isolates of Candida species causing bloodstream infection // Mycoses. - 2012. - Vol. 56. - P. 264-272.
а
6. Donlan R.M. and Costerton J. W. Biofilms: Survival mechanisms of clinically relevant microorganisms // J. Clin. Microbiol.
- 2002. - Vol. 15, №2. - P. 167-193.
7. Chandra J., Mukherjee P.K. Ghannoum M.A. Candida biofilms associated with CVC and medical devices // Mycoses. -2011. - Vol. 55. - P. 46-57.
8. Блинов Н.П. Структурированные и неструктурированные формы существования микромицетов в искусственных и естественных условиях // Проблемы медицинской микологии. - 2009. - Т. 11, №3. - С. 3-9.
9. Ramage G., Martinez J.P., Lopez-Ribot J.L. Candida biofilms on implanted biomaterials: a clinically significant problem // FEMS Microbiol. Lett. - 2006. - Vol. 6. - P. 979-983.
10. LebeauxD., Chauhan A., Rendueles O., Beloin C. From in vitro to in vivo models of bacterial biofilm - related infections // Pathogens. - 2013. - Vol. 2. - P. 288-356.
11. Corey G. R., Lalani T. Risk of intravascular cardiac device infections in patients with bacteraemia: impact on device removal // Int. J. Antimicrob. Ag. - 2008. - Vol. 32. - P. 26-29.
12. Klevens R.M. Edwards J.R., Richards C.L., et al. Estimating health care-associated infections and deaths in U.S. hospitals, 2002 // Public Health Rep. - 2007. - Vol. 122. - P. 160-166.
13. http://ecdc.europa.eu/en/healthtopics/Healthcare-associated_infections/Pages/news.aspx
14. Бережанский Б.В., Жевнерев А.А. Катетер-ассоциированные инфекции кровотока // Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. - 2006. - Т. 8, №2. - С. 130-144.
15. Valles J., Ferrer R. Bloodstream infections in the ICU // Infect. Dis. Clin. N. Am. - 2009. - Vol. 23. - P. 557-569.
16. Lewis K. Persister cells, dormancy and infectious disease // Nat. Rev. Micribiol. - 2007. - Vol. 5. - P. 48-56.
17. Seneviratne C.J., Jin L., Samaranayake L.P. Biofilm lifestyle of Candida: a mini review // Oral Deseases. - 2008. - Vol. 14.
- P. 582-590.
18. Al-Dhaheri P.S., Douglas L.J. Absence of amphotericin B - tolerant persister cells in biofilm of some Candida species // Antimicrob. Agents Ch. - 2008. - Vol. 52. - P. 1884-1887.
19. Harriott M.M., Noverr M.C. Candida albicans and Staphylococcus aureus form polymicrobial biofilms: effects on antimicrobial resistance // Antimicrob. Agents Ch. - 2009. - Vol. 53. - P. 3914-3922.
20. Pammi M., Liang R., Hicks J., et al. Biofilm extracellular DNA enhances mixed species biofilms of Staphylococcus epidermidisand Candida albicans // BMC Microbiology. - 2013. - Vol. 13. - P. 257.
21. Пинегина О.Н., Выборнова И.В. Определение чувствительности биопленок Candida spp. к антимикотикам // Проблемы медицинской микологии. - 2013. - Т. 15, №2. - С. 112.
22. Tobudic S., Kratzer C., Lassnigg A., Presterl E. Antifungal susceptibility of Candida albicans in biofilms // Mycoses. - 2011.
- Vol. 55. - P. 199-204.
23. Hall-Stoodley L., Stoodley P. Evolving concepts in biofilm infections // Cell Microbiol. - 2009. - Vol. 11, №7. - P. 1034-1043.
Поступила в редакцию журнала 20.12.2013 Рецензент: Н.П. Блинов
