CC BY
175
УДК 616.15-009.61 1-055.28:615.838
Видовой состав лактобактерий
при различном состоянии микробиоты
влагалища у беременных
A.Р. Мелкумян, Т.В. Припутневич, А.С. Анкирская, Д.Ю. Трофимов,
B.В. Муравьева, С.М. Муллабаева, М.Г. Завьялова
ФГБУ «Научный Центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Россия
Цель. Определение видового состава лактобактерий при различных микробиотических состояниях влагалища у беременных с помощью культурального, масс-спектрометрического и молекулярно-генетического методов.
Материалы и методы. Обследованы 163 женщины от 18 до 40 лет во II-III триместрах беременности. Проведено комплексное микробиологическое исследование влагалищного отделяемого: микроскопия мазков (окрашенных по Граму и метиленовым синим) и культураль-ное исследование. Видовую идентификацию выделенных микроорганизмов проводили масс-спектрометрическим методом; определение количества Lactobacillus spp. и генотипирова-ние шести видов лактобактерий (L. crispatus, L. iners, L. jensenii, L. gasseri, L. johnsonii, L. vaginalis) - методом ПЦР-РВ с использованием тест-систем для научного применения.
Результаты. Использование масс-спектро-метрии позволило идентифицировать 15 видов лактобактерий, которые были культивированы на стандартных селективных питательных средах. Среди них три вида - L. crispatus, L. jensenii и L. gasseri были доминирующими по высеваемо-сти. Среди всех видов лактобактерий L. crispatus по результатам обеих методик лидировал по частоте встречаемости в группе беременных с нормоценозом (>60%). ПЦР-диагностика позволила установить значительное место вида
L. iners среди видового разнообразия лактобактерий, обитающих во влагалище. При нормоце-нозе по результатам культурального исследования с помощью масс- спектрометрии идентифицировано 8 видов лактобактерий, тогда как при бактериальном вагинозе (БВ) - 15 видов. Опровергнуто представление о ведущей роли вида L. acidophilus в пуле молочнокислых бактерий вагинальной микробиоты.
Выводы. Метод MALDI TOF масс-спектро-метрии позволил определить 15 видов влагалищных лактобактерий и может быть рекомендован для идентификации культивируемых лактобактерий. L. iners является некультиви-руемым микроорганизмом при использовании стандартных селективных для лактобактерий питательных сред. По данным ПЦР-диагностики вид L. iners при БВ присутствовал у 84,6% пациенток. Анализ видового состава влагалищных лактобактерий, выделенных у беременных с абсолютным нормоценозом, дает право считать доминирование вида Lactobacillus crispatus показателем стабильности нормы микроэкологии влагалища.
Ключевые слова: лактобактерии, Lacto-bacillus iners, беременные, масс-спектрометрия, микробиота влагалища, бактериальный ваги-ноз.
Контактный адрес:
Алина Рантиковна Мелкумян
Эл. почта: alinamelkumyan@yandex.ru
Lactobacilli Species Diversity in Different States of Vaginal Microbiota in Pregnant Women
A.R. Melkumyan, T.V. Priputnevitch, A.S. Ankirskaya, D.Yu. Trofimov, V.V. Muravyova, S.M. Mullabaeva, M.G. Zavyalova
Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology, Moscow, Russia
Objective. To determine lactobacilli species diversity in different states of vaginal microbiota in pregnant women using culture, mass-spectrometry, and DNA-based assays.
Material and Methods. A total of 163 pregnant women (18 to 40 years of age) were examined in the 2nd or 3rd trimester. A comprehensive microbiological examination of vaginal swabs, including Gram staining, methylene blue staining, and culture was performed. All isolated microorganisms were identified to species level using mass-spectrometry. Quantification of Lactobacillus spp. and genotyping of 6 lactobacilli species (L. crispatus, L. iners, L. jensenii, L. gasseri, L. johnsonii, L. vaginalis) were performed by real-time PCR.
Results. Using mass-spectrometry, a total of 15 lactobacilli species were identified and cultured on standard selective media. Of these, 3 species (L. crispatus, L. jensenii and L. gasseri) were found more often than others. Based on the both assays, L. crispatus appeared to be the most frequent species in pregnant women with
normocenosis (>60%). PCR assay showed significant place of L. iners among vaginal lactobacilli species. Using mass-spectrometry, 8 lactobacilli species were identified in pregnant women with normocenosis, and 15 species in bacterial vaginosis. Conception about leading role of L. acidophilus among lactobacilli from vaginal microbiota was contradicted.
Conclusions. MALDI-TOF mass-spectrometry could identify15 species of vaginal lactobacilli and, therefore, may be recommended for identification of cultured lac-tobacilli. L. iners is unable to be cultured on standard selective media. Based on the PCR data, L. iners was found in 84.6% of pregnant women with bacterial vaginosis. Analysis of vaginal lactobacilli species isolated from pregnant women with absolute normocenosis suggests that predominance of L. crispatus may be considered as a measure of normal vaginal microbiota.
Key words: lactobacilli, Lactobacillus iners, pregnant, mass-spectrometry, vaginal microbiota, bacterial vaginosis.
Введение
В последние два десятилетия в связи с методологическими прорывами в клинической микробиологии открылись новые возможности для более углубленного изучения микробной экологии влагалища, многие вопросы которой остаются неизученными и являются предметом дискуссий. Долгие годы изучение микробиоты влагалища было затруднено из-за отсутствия достаточных методических возможностей для исследования микрофлоры и состава вагинального отделяемого, все еще не решены вопросы, связанные с характеристикой и классификацией физиологических и патологических состояний микроценоза влагалища [1, 2].
До середины XX века вагинальный микроценоз считался представленным, в основном, Lactobacillus acidophilus. К 80-м годам было показано, что нормальный микроценоз гениталий женщин репродуктивного возраста неоднороден и представлен как Lactobacillus spp. 85-98%, так и большой группой так называемых условно-патогенных микроорганизмов (УПМ) - Staphylococcus spp., Escherichia coli, Gardnerella vaginalis, Candida albicans - с частотой выявления 10-50% [3-5].
В XXI веке, как и в минувшем столетии, несмотря на бурное развитие технологий, микроскопический метод остается широко распространенным в лабораторной диагностике влагалищных инфекций. Метод микроскопии имеет ряд преимуществ, а именно: экономичность, быстрота и доступность для большинства лечебных учреждений, не требуется наличие дорогостоящего оборудования [6]. Но большим его недостатком является субъективизм, неполноценность получаемых результатов, выявление узкого спектра возбудителей, зависимость результатов от квалификации врача. Существуют и косвенные причины недостоверности результатов: качество взятия мазков, правильность окраски препаратов [7, 8]. До настоящего времени в нашей стране микроскопию окрашенных метиленовым синим вагинальных мазков выполняют в клинико-диагностических лабораториях, что позволяет выявлять лишь узкий круг возбудителей (три-хомонады, грибы). Одна из объективных причин малой информативности этого метода связана с разрешающей способностью оптики, которая дает возможность выявлять микроорганизмы при их количестве в биоматериале выше 5 ^ КОЕ/мл. Кроме того, морфологическое сходство многих
выявляемых УПМ различных видов и родов также не позволяет делать заключение об их этиологической роли [1, 7, 9]. Например, к лактоморфотипам могут быть ложно отнесены актиномицеты, кори-небактерии, листерии и др. Таким образом, микроскопический метод в ряде случаев может быть рекомендован только как начальный скрининговый этап диагностики и для выбора тактики назначения дальнейших лабораторных анализов.
Удовлетворить возросшие требования к микробиологическому исследованию возможно внедрением измерительных приборов и тест-систем нового поколения, реализующих принципы молекулярного анализа и способных в максимально короткие сроки проводить идентификацию микроорганизмов, определять их клинически значимые свойства [10]. Одним из таких методов является метод масс-спектрометрической идентификации.
Разработки по использованию масс-спектро-метрического анализа в микробиологической диагностике ведутся с начала XXI века. В настоящее время масс-спектрометрическая детекция позволяет проводить точную идентификацию более 4000 видов микроорганизмов, сокращая при этом сроки идентификации на 24-72 часа. Один из важных показателей - экономичность методики, которая почти не требует затрат на реактивы и расходные материалы. С использованием данной методики впервые появилась возможность видовой идентификации микроорганизмов влагалища, ранее требовавших дорогих и длительных затрат (облигатные анаэробы, гемофилы, нейссерии, лак-тобактерии, коринебактерии, актиномицеты и др.). Поэтому задачи, связанные с разработкой и внедрением в рутинную практику микробиологических лабораторий новых эффективных подходов к идентификации, характеристике и типированию клинически значимых патогенов, являются актуальными и своевременными [7, 11].
В этой связи внедрение метода MALDI TOF (время-пролетной масс-спектрометрии) рибосомальных белковых фракций в практическую работу бактериологических лабораторий является крайне перспективным и открывает новые возможности диагностики микробиома различных локусов организма.
Целью исследования было определить видовой состав лактобактерий при различных микробиотических состояниях влагалища у беременных с помощью культурального, масс-спектрометрического и молекулярно-генетического методов.
Материалы и методы_
Обследованы 163 женщины от 18 до 40 лет во II-III триместрах беременности с наличием инфор-
мированного согласия. Из исследования были исключены 8 женщин с инфекциями, передающимися половым путем (ИППП): ВИЧ-инфекция, сифилис (методом ИФА), гонорея, трихомониаз, хлами-диоз, инфекции, вызванные Mycoplasma genitalium (методом ПЦР). В анализ включены 155 беременных, у которых было проведено комплексное микробиологическое исследование влагалищного отделяемого: микроскопия мазков (окрашенных по Граму и метиленовым синим) и культуральное исследование.
Комплексная оценка состояния микроценоза влагалища была проведена в соответствии с медицинской технологией «Интегральная оценка состояния микробиоты влагалища. Диагностика оппортунистических вагинитов»: учитывали состояние вагинального эпителия, лейкоцитарную реакцию, разнообразие морфотипов, а также видовую идентификацию с количественной оценкой роста микроорганизмов при культуральном исследовании [1]. Взятие отделяемого влагалища для посева проводили стерильным ватным тампоном из заднего свода влагалища в пробирку с транспортной средой Эймса (Medical Wire, Англия). Первичный посев с полуколичественной оценкой роста микроорганизмов проводили на селективные и дифференциально-диагностические питательные среды: колумбийский агар, маннит-солевой агар (Conda, Испания), среду Эндо, энтерококкагар и агар Сабуро (ФГУН «ГИЦПМ и Б», Оболенск, Россия). Все посевы культивировали по стандартной методике при температуре 36°С в течение 24-48 часов. Лактобактерии культивировали в условиях СО2 инкубатора (Jouan, Франция), в анаэробных газогенераторных пакетах (ВюМепеих, Франция) и анаэростате (Jouan, Франция) с использованием питательных сред отечественных (Лактобакагар, ФГУН «ГИЦПМиБ», Оболенск) и иностранных (агар MRS, Conda, Испания) производителей.
Видовую идентификацию всех выделенных микроорганизмов, в том числе 267 штаммов лак-тобактерий, проводили масс-спектрометрическим методом с использованием времяпролетного масс-спектрометра MALDI TOF MS AutoFlex III с программным обеспечением Maldi BioTyper (Bruker Daltoniks, Германия).
Материал для генотипирования лактобактерий забирали из заднего свода влагалища в транспортные среды с изотоническим водно-солевым раствором и консервантом. Для оценки видового состава лактобактерий проводили определение количества Lactobacillus spp. и генотипирование 6 видов лактобактерий (L. crispatus, L. iners, L. jensenii, L. gasseri, L. johnsonii, L. vaginalis) методом ПЦР-РВ с исполь-
Enterococcus faecalis Staphylococcus epidermidis Staphylococcus haemolyticus Staphylococcus hominis Corynebacterium aurimucosum Corynebacterium amycolatum Streptococcus anginosus Staphylococcus auricularis Staphylococcus capitis Actinomyces denticolens Escherichia coli
1 %
0
10
20
30
Рис. 1. Высеваемость факультативно-анаэробных микроорганизмов у беременных с нормоценозом.
Staphylococcus spp. Corynebacterium spp.
Actinomyces spp.
Streptococcus spp.
Enterococcus faecalis
Candida spp.
Klebsiella pneumoniae
Escherichia coli
□ <4 lg KOE/мл
□ >4 lg KOE/мл
0 10 20
Рис. 2. Высеваемость факультативно-анаэробных микроорганизмов у беременных с бактериальным вагинозом.
зованием тест-систем для научного применения (OOO «НПО ДНК-Технология», Москва).
Результаты исследования
На основании комплексной оценки результатов микроскопии и культуральной диагностики в общей группе (n=155) состояние микроценоза оценено как нормоценоз (Н) у 57 (36,8%) женщин, а у 98 (63,2%) диагностированы различные варианты вагинальных инфекций. Кандидозный вагинит (КВ) выявлен у 34 (21,9%) пациенток, аэробный (неспецифический) вагинит (АВ), ассоциированный с факультативно-анаэробными условно-патогенными микроорганизмами - у 22 (14,2%), бактериальный вагиноз (БВ) - у 26 (16,8%) беременных, промежуточный вариант микроценоза - у 3 (1,9%), бессимптомное носительство грибов - у 7 (4,5%), цитолитический вагиноз - у 6 (3,9%) беременных.
Проведен сравнительный анализ видового состава лактобактерий в каждой из 4 групп с
«микробиологическим диагнозом» нормоценоза, бактериального ваги-ноза, аэробного вагинита и кандидоз-ного вагинита.
При микроскопии мазков пациенток группы с нормоценозом лейкоцитарная реакция отсутствовала (82,5%) или была слабовыраженной (17,5%). В мазках доминировали лак-томорфотипы.
При посевах отделяемого влагалища беременных с нормоценозом во всех пробах в высоком титре (>6 lg КОЕ/мл) были выделены лактобак-терии. У 54,4% беременных, кроме того, были выделены условно-патогенные микроорганизмы, преимущественно в низких титрах (рис. 1).
Среди лактобактерий, выделенных при нормоценозе, идентифицированы 8 видов. Лидирующее положение занимали 3 вида: L. crispatus (63,2%), L. jensenii (33,4%) и L. gasseri (17,5%). Частота высеваемости остальных 5 видов - L. fermentum, L. salivarius, L. mucosae L. delbrueckii, L. plantarum составила менее 5,3%.
При анализе частоты выявления лактобактерий методом ПЦР-РВ с учетом относительных показателей нормы (50-100% ОБМ) L. crispatus обнаружены у 61,4% беременных, L. iners - у 28,1%, L. jensenii - у 15,8%, L. gasseri - у 8,8% беременных.
В группе беременных с БВ при микроскопии в 76,9% случаев в окрашенных по Граму мазках, не выявлены морфотипы лактобактерий, а в 23,1% отмечено умеренное их количество (до 100 микробных клеток в поле зрения).
При культуральной диагностике в аэробных условиях при БВ обнаружен рост широкого спектра факультативно-анаэробных УПМ (рис. 2). Доминирующее положение занимали коагулазоне-гативные стафилококки (Staphylococcus epidermidis, S. haemolyticus, S. cohnii. S. warneri), коринебакте-рии (Corynebacterium amycolatum, C.minutissimum, C.aurimucosum, C.coyleae, C.simulans, C.imitans) и актиномицеты (Actinomyces urogenitalis, A.neuii, A.denticolens, A.turicensis).
Что касается лактобактерий, то их рост обнаружен у беременных с БВ в 80,6% случаев. В низких титрах выделено 15 видов лактобактерий (<5 lg КОЕ/мл): L. crispatus, L. jensenii, L. gasseri, L. fermentum, L. salivarius, L. mucosae, L. oris,
-I % 30
13
I 3,2%
2
12,9%
7
6,5% 1Л 6,5%
5
9,7%
4
9,7%
1 - L. crispatus
2 - L. jensenii
3 - L. gasseri
4 - L. fermentum
5 - L. salivarius
6 - L. mucosae
7 - L. delbrueckii
8 - L. plantarum
9 - L. ultunensis
10 - L. oris
11 - L. rhamnosus
12 - L. casei
13 - L. paracasei
14 - L. zeae
15 - L. reuteri
Рис. 3. Видовой спектр лактобактерий при бактериальном вагинозе. MS-идентификация.
Enterococcus faecalis Escherichia coli Streptococcus agalactiae Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus hemolyticus Streptococcus constelatus Corynebacterium amycolatum Actinomyces urogenitalis Actinomyces turicensis
□ <4 lg KOE/мл
□ >4 lg KOE/мл
—i— 10
20
Рис. 4. Высеваемость факультативно-анаэробных микроорганизмов у беременных с аэробным вагинитом.
Candida albicans 'Candida glabrata Staphylococcus epidermidis Enterococcus faecalis 'Staphylococcus haemolyticus Staphylococcus hominis Staphylococcus aureus Corynebacterium aurimucosum Corynebacterium coyleae Streptococcus anginosus Staphylococcus capitis Klebsiella pneumoniae Escherichia coli
Я Я
□ <4 lg KOE/мл
□ >4 lg KOE/мл
0 20 420
Рис. 5. Высеваемость факультативно-анаэробных микроорганизмов у беременных с кандидозным вагинитом.
L. ultunensis, L. delbrueckii, L. р1ап1атт, L. rhаmnosus, L. casei, L. paracasei, L. zeae, L. геМеп (рис. 3).
Метод ПЦР у 84,6% беременных с БВ выявил вид L. iners, который не был обнаружен в посевах. Этот вид оказался некультивируемым на традиционных селективных питательных средах для выде-
ления лактобактерий. Далее методом ПЦР-РВ с учетом относительных показателей (>10% ОБМ) и абсолютных показателей (>5 lg ГЭ/обра-зец) по частоте выявления следовали L. crispatus (7,6%), L. gasseri (7,6%), L. jensenii (3,8%).
Беременные, в мазках которых отмечена резко выраженная лейкоцитарная реакция, а в посевах в высоких титрах выделены факультивно-анаэробные УПМ, были отнесены в группу с аэробным вагинитом (АВ). Среди возбудителей АВ превалировали в высоком титре (>5 lg КОЕ/ мл) Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus (рис. 4).
Частота выделения лактобакте-рий различных видов в посевах у беременных с АВ составила 36,4% - L. crispatus, 22,7% - L. gasseri, по 9,1% - L.jensenii и L. rhamnosus, менее 4,5% - L. salivarius, L. mucosae, L. ultunensis.
Методом ПЦР-РВ у 55,5% беременных с АВ выявлены лактобак-терии в низких титрах по абсолютному (<5 lg ГЭ/образец) и относительному показателю (<10% ОБМ). С относительным показателем более 10% ОБМ обнаружены: L. crispatus (36,4%), L. iners (27,3%), L. gasseri (22,7%). Частота индикации L. jensenii и L. johnsonii была менее 4,5%.
При микроскопии мазков беременных с КВ во всех случаях была выраженная лейкоцитарная реакция (в отличие от бессимптомного носи-тельства грибов) и наличие бласто-спор. В 70,6% случаев отмечено наличие псевдомицелия.
Культуральным методом во всех пробах у беременных с КВ в высоких титрах (>5 lg КОЕ/мл) были выделены грибы рода Кандида. Частота выделения Candida albicans составила 94,1%, Candida glabrata - 14,7%. микроорганизмов, ассоциированных с грибами, присутствовали стафилококки, стрептококки и другие УПМ, но их доля не имела диагностического значения (рис. 5).
Лактобактерии при культуральном исследовании у беременных с КВ были представлены вида-
—i % 30
-I % 60
В
спектре
0
ми: L. jensenii (32,3%), L. crispatus (26,4%), L. gasseri (17,6%), L. fermentum (11,7%) и L. reuteri (2,9%). В 85,3% случаев при КВ лактобактерии выявлены в высоком титре (>7 lg КОЕ/мл).
В группе женщин с КВ методом ПЦР-РВ лактобактерии идентифицированы в 91,2% с относительным показателем более 50% ОБМ. Видовой спектр лактобактерий состоял из L. iners (32,4%), L. crispatus (29,4 %), L. jensenii (23,6%).
Обсуждение результатов
Для оценки видового состава лактобактерий при различных состояниях микробиоты влагалища проведено комплексное обследование 155 женщин во II и III триместрах беременности. Уникальность дизайна исследования состояла в том, что была впервые проведена видовая идентификация лак-тобактерий методом масс-спектрометрии после выделения штаммов на селективных питательных средах из отделяемого влагалища и параллельно были определены виды лактобактерий в первичном материале методом ПЦР. Выбор видового спектра лактобактерий, типированных ПЦР-методом, был обусловлен результатами ранних исследований, которые показали значимость 6 видов лактобакте-рий в общей картине лактобациллярного «пейзажа» [12].
В нашем исследовании опровергнуто представление о ведущей роли вида L. acidophilus в пуле молочнокислых бактерий вагинальной микробио-ты. Этот вид ни разу не был идентифицирован среди 267 штаммов, выделенных у 155 обследованных беременных как с нормоценозом влагалища, так и при различных оппортунистических вагинитах. Частота выделения видов лак-тобактерий, которые в настоящее время используются в качестве пробиотических препаратов (L. rhamnosus, L. reuteri), была минимальной и не превышала 3,6%.
Исследование показало значительное видовое разнообразие влагалищных лактобактерий. Использование масс-спектрометрии позволило идентифицировать 15 видов лактобактерий, которые были культивированы на стандартных селективных питательных средах. Среди них три вида - L. crispatus, L. jensenii и L. gasseri были доминирующими по высеваемости. ПЦР-диагностика позволила установить значительное место вида L. iners среди видового разнообразия лактобакте-рий, обитающих во влагалище. Исследование подтвердило, что L. iners является некультивируемым микроорганизмом при использовании стандартных селективных для лактобактерий питательных сред. В то же время метод ПЦР позволил выявить этот
1 - L. crispatus
2 - L. jensenii
3 - L. gasseri
4 - L. fermentum
5 - L. salivarius
6 - L. mucosae
7 - L. delbrueckii
8 - L. plantarum
9 - L. oris
10 - L. ultunensis
11 - L. rhamnosus
12 - L. casei
13 - L. paracasei
14 - L. zeae
15 - L. reuteri
Рис. 6. Частота выделения различных видов лактобактерий при нормоценозе (Н) и бактериальном вагинозе (БВ). MS-идентификация.
вид при нормоценозе у 28,1% беременных всегда в высоком титре. По данным ПЦР-диагностики среди лактобактерий преобладали виды L. crispatus, L. iners, L. jensenii и L. gasseri. Таким образом, сравнивая две методики видовой идентиф2икации лак-тобактерий, можно полагать, что три вида являются ведущими по частоте выявления обоими методами и что вид L. iners занимает 2-3 место по частоте встречаемости среди пула влагалищных лактобак-терий.
Другой итог исследования связан с полученным видовым спектром лактобактерий при нормоценозе и бактериальном вагинозе (рис. 6). При нормоце-нозе, по результатам культурального исследования с помощью масс-спектрометрии, идентифицировано 8 видов лактобактерий, тогда как при БВ -15 видов. При нормоценозе лактобактерии всегда выделяли в высоком титре (>7 lg КОЕ/мл) и чаще в монокультуре, тогда как при бактериальном вагинозе титры всегда были низкими (<5 lg КОЕ/мл) и нередко выделяли 2-3 вида лактобактерий. По данным ПЦР-диагностики вид L. iners при БВ присутствовал у 84,6% пациенток. Возможно, L. iners при БВ приобретает патогенетическую роль (но не этиологическую), так как у 85% пациенток с БВ при относительно низкой доле в общей бактериальной массе (<10%), абсолютный титр их сохраняется высоким (>7 lg ГЭ/образец).
В этом же ключе можно трактовать данные по высеваемости при БВ о многообразии видов лакто-бактерий, которые не встречаются при нормоцено-зе. На основании полученных результатов можно предположить, что индикация L. iners и редко встречающихся видов лактобактерий может свидетель-
ствовать о предрасположенности к развитию БВ и его рецидивированию. Подобное заключение было сделано A. Kalra и соавт. [13] и E. Falsen и соавт. [14], которые предположили, что бактериальный вагиноз может развиться в определенных условиях из представителей нормальной микрофлоры, и что повторное заселение L. iners после эпизода бактериального вагиноза может быть фактором риска развития рецидива. Полученные данные подтвердили малоинформативность результатов микроскопии мазков, окрашенных по Граму, при которых не выявляются морфотипы лактобактерий при БВ (76,9%) или их титр резко снижен (23,1%). Проведенное нами пилотное исследование с включением расширенного набора питательных и селективных сред для роста лактобактерий и облигатных анаэробов - агар Шадлера, агар MRS, бульон MRS, агар Рогозы (Conda, Испания), Лактобакагар (ФГУН «ГИЦПМиБ», Оболенск) с последующей MS идентификацией показали, что ростовые потребности L. iners включают дефибринированную баранью кровь и зависят от pH среды культивирования. Изучение биологических свойств L. iners показало, что этот вид лактобактерий очень изменчив по морфологическим (морфотип лактобактерий, гарднерелл, строгих анаэробов) и тинкториальным (грамвариабельность) свойствам (неопубликованные данные).
В нашем исследовании, благодаря масс-спектрометрической идентификации, впервые были видоидентифицированы актиномицеты и коринебактерии и показана их широкая видовая палитра при БВ. Возможно, их роль в развитии БВ также может быть пересмотрена, что требует дальнейших исследований.
Выводы
1. Метод MALDI TOF масс-спектрометрии позволил определить 15 видов влагалищных лактобактерий: L. crispatus, L. jensenii, L. gasseri, L. fermentum, L. salivarius, L. mucosae, L. oris, L. ultunensis, L. delbrueckii, L. plantarum, L. rhamnosus, L. casei, L. paracasei, L. zeae, L. reuteri.
2. Совпадающие результаты двух методов идентификации лактобактерий получены по трем ведущим видам: L. crispatus, L. jensenii и L. gasseri (без учета L. iners при нормоценозе).
3. По результатам MS-идентификации:
• при нормоценозе выделено 8 видов лактобак-терий, из которых абсолютно доминировали 3 вида, а частота выявления остальных 5 видов была менее 5,3 %;
• при бактериальном вагинозе выделено 15 видов лактобактерий всегда в низком титре, частота встречаемости доминирующих трех видов (L. crispatus, L. jensenii, L. gasseri) составила по 15,4% каждого вида; L. fermentum, L. salivarius, L. mucosae, L. delbrueckii и L. plantarum по частоте выявления составили от 7,7 до 11,5%, остальные 7 видов встречались редко (менее 3,8% случаев).
4. ПЦР-типирование лактобактерий позволило выявить вид Lactobacillus iners, который не выявляется с помощью культуральной диагностики при использовании стандартных селективных питательных сред:
• Lactobacillus iners выявлен в высоком титре у 28,1% женщин с нормоценозом влагалища;
• Lactobacillus iners обнаружен в относительно большом количестве (>10% ОБМ) у 84,6% беременных с бактериальным вагинозом;
• остается открытым вопрос о патогенетической роли L. iners в развитии и рецидивах бактериального вагиноза.
5. При вульвовагинальном кандидозе и аэробном вагините не обнаружено большого разнообразия видов лактобактерий, как это наблюдалось при бактериальном вагинозе.
6. Проведенное исследование опровергает доминирующее положение L. acidophilus в видовом составе влагалищных лактобактерий, а частота выделения других пробиотических штаммов (L. rhamnosus, L. reuteri) в общей группе беременных не превышала 3,6%.
7. Анализ видового состава влагалищных лакто-бактерий, выделенных у беременных с абсолютным нормоценозом, дает право считать доминирование вида L. crispatus показателем стабильности нормы микроэкологии влагалища. По-видимому, именно этот вид лактобактерий может быть перспективным для отбора производственных штаммов в качестве пробиотиков для лечения и профилактики урогенитальных инфекций.
Литература
1. Анкирская А.С., МуравьеваВ.В. Интегральная оценка состояния микробиоты влагалища. Диагностика оппортунистических вагинитов (медицинская технология) - М.:Б/И, 2011.
2. Кочеровец В.И., Бунятян Н.Д. Нормальная микрофлора женских мочеполовых органов и препараты для её коррекции. Учебное пособие, М. 2012.
3. Анкирская А.С. Микроэкология влагалища и профилактика акушерской патологии. Гинекология 1999; 3:80-82.
4. Петрова Н.А., Клясова Г.А., Толкачева Т.В. Этиологическая структура кандидоза у иммуноском-проментированных больных. Первый съезд микологов России. - М. 2002; 371.
5. Черкасов СВ. Персистентные характеристики микрофлоры репродуктивного тракта женщин в норме и патологии. Автореф.дисс....канд. мед. наук. Оренбург, 1998. 22 с.
6. Krohn M., Hillier S. , Eschenbach D. Comparison of methods for diagnosing bacterial vaginosis among pregnant women. J Clin Microbiol 1989; 27(6):1266-71.
7. Forsum U., Jakobsson T., Larsson P., et al. An international study of the interobserver variation between interpretations of vaginal smear criteria of bacterial vaginosis. APMIS 2002;110(11):811-18.
8. Vasquez A., Jakobsson T., Ahrne S. , Forsum U., Molin G. Vaginal Lactobacillus flora of healthy Swedish women. J Clin Microbiol 2002; 40:2746-49.
9. Forsum U., Larsson P., Spiegel C. Scoring vaginal fluid smears for diagnosis of bacterial vaginosis: need for quality specifications. APMIS 2008; 116(2):156-59.
10. Верещагин В.А., Ильина Е.Н., Зубков М.М., При-путневич Т.В., Кубанова А.А., Говорун В.М. Использование масс-спектрометрии MALDI-TOF для выявления в генах gyrA и parC Neisseria gonorrhoeae одно-нуклеотидных замен, определяющих формирование устойчивости к фторхинолонам. Молекулярная биология 2005; 39(6):923-32.
11. Ильина Е.Н., Говорун В.М. Масс-спектрометрия нуклеиновых кислот в молекулярной медицине. Биоорганическая химия 2009; 35(2):149-64.
12. Ворошилина Е.С., Сергеев А.Г., Тумбинская Л.В. Полиморфизм генов системы цитокинов и видовой состав вагинальных лактобактерий у женщин репродуктивного возраста с сохранной нормофлорой. Уральский медицинский журнал 2011; 3(81):58.
13. Kalra A., Palcu C., Sobel J., Akins R. Bacterial vaginosis: culture- and PCR-based characterizations of a complex polymicrobial disease's pathobiology. Curr Infect Dis Rep 2007; 9(6):485-500.
14. Falsen E., Pascual C., Sjoden B., Ohlen M., Collins M. Phenotypic and phylogenetic characterization of a novel Lactobacillus species from human sources: description of Lactobacillus iners sp. Nov. Int J Syst Bacteriol 1999; 49:217-21.
