CC BY
30
УДК 544.18/577.29:577.17
ВЕРОЯТНЫЙ МЕХАНИЗМ ИНДУКЦИИ ЦИТОХРОМА Р-450(448) ПОЛИХЛОРИРОВАННЫМИ ДИБЕНЗО-П-ДИОКСИНАМИ
© 2018 Н. Б. Кузнецова, П. Е. Кузнецов
1канд. хим. наук, доцент кафедры химии e-mail: [email protected]
2докт. хим. наук, профессор кафедры химии e-mail: [email protected]
Курский государственный университет
На основе расчетов полуэмпирическими методами квантовой химии предложен вероятный механизм индукции цитохрома Р-450(448) дибензо-п-диоксинами (ДД). Механизм заключается в том, что ДД могут протонироваться и множество раз взаимодействовать с кислородом цитохрома Р-450, являясь донорами электронов. Комплекс (ДД-цитохром Р-450) может существовать длительное время не разрушаясь. При этом ДД не гидроксилируются, генерируется пероксид водорода, а вся система, обеспечивающая микросомальное окисление, поддерживается в активной форме. В результате цикличности этого процесса, его высокой скорости резко возрастает число взаимодействий ДД с цитохромом .
Ключевые слова: квантово-химическая модель, индукция цитохрома Р-450, протонирование, перенос электрона.
В настоящее время достоверно установлено, что диоксины в организме вызывают индукцию цитохрома Р-450(448) [Лакин, Крылов 1981]. Однако окончательно механизм индукции не определен. Поэтому представляет несомненный интерес рассмотрение механизма взаимодействия цитохрома Р-450 с ПХДД (полихлорированными дибензо-п-диоксинами) с позиций теории протонизации диоксинов.
Исследователями было установлено, что свойство диоксинов к протонизации проявляется на границе раздела фаз. В межфазном пространстве формируется двойной электрический слой. ПХДД в системе двух соприкасающихся фаз выступает в качестве поверхностно-активных веществ, концентрирующихся в межфазном слое [Кучинский, Поляков 1992].
Указанные условия соблюдаются и в области активного центра цитохрома Р-450. Во-первых, реакция гидроксилирования осуществляется в межфазном пространстве, между белковой и липидной составляющими мембраны. Во-вторых, локальный электростатический потенциал рассматриваемой области складывается:
- из общего электростатического потенциала мембраны;
- из значительного положительного заряда на ионе железа (Q =+3 ат.ед.), существенно усиливающего локальный электростатический потенциал.
Таким образом, возможность протонирования ПХДД имеется в условиях реакции гидроксилирования на цитохроме Р-450. На кислород цитохрома поступают электроны от цитохрома b5. При переносе на кислород одного электрона
TXDDH
e +
e
-O=O-
-H , цитохром b5
TXDD +---H2O2
H
+
H
+
будут образовываться перекись водорода и катион-радикал ТХДД (2,3,7,8-тетрахлордибензо-п-диоксина). Другой электрон переносится от молекулы протонированного диоксина, который является донором электронов [Кузнецова и соавт. 2013].
В настоящее время считается установленным, что, наряду с продуктами окисления субстратов, при микросомальном окислении протекает процесс образования перекиси водорода или воды [Метелица 1982]. Предполагается, что процесс восстановления кислорода до перекиси водорода осуществляется в основном за счет электронов, поступающих от цитохрома Ь5, кроме того, в области активного центра цитохрома Р-450 присутствуют и протоны.
При определении характера взаимодействия ДД (дибензо-п-диоксины) и цитохрома Р-450 следует учитывать, что ДД можно рассматривать как в качестве субстрата, так и в качестве конкурента флавиновой группировки цитохром-Р-450-зависимой редуктазы. Данные реакции могут быть конкурирующими. Однако в действительности, по-видимому, реализуется второй вариант. Вероятность этого механизма определяется следующими экспериментально подтвержденными фактами. Во-первых, метаболиты ТХДД не выявлены, следовательно, реакция гидроксилирования не происходит. Во-вторых, протонированные ДД имеют структурное сходство с восстановленным дигидрофлавином - конечным элементом электронно-транспортной цепи. В-третьих, предлагаемый механизм биохимического действия ДД и механизм взаимодействия флавина с кислородом близки. При этом фермент функционирует как катализатор, который поставляет на молекулу триплетного кислорода электроны и протоны. Таким образом, реакция взаимодействия протонированного ДД с триплетным кислородом, видимо, может осуществляться в среде микроокружения цитохрома Р-450. Решающее значение имеет лишь характер комплекса (ТХДДН+-О2) и количество электронов и протонов, которые поступают на молекулу кислорода. Следует ожидать, что электроны на кислород цитохрома Р-450 будут поступать от цитохрома Ь5. Протоны в принципе могут присутствовать в микроокружении активного центра цитохрома Р-450, так как в процессе побочной реакции образуется перекись водорода из молекулы триплетного кислорода [Метелица 1982]. Таким образом, можно сделать заключение о возможности протекания реакции взаимодействия кислорода цитохрома Р-450 с протонированным ТХДД.
Упрощенная модель исследуемого процесса представлена на рисунке. Ранее было показано, что водородный комплекс (ТХДДН+-О=О) существует, но в нем не происходит перераспределения электронной плотности. При поступлении в систему электрона комплекс изменится. Однако квантово-химические расчеты, проведенные методом РМ3, показали, что водородная связь комплекса не разрывается, а остается равной 1,84А. Структурные характеристики протонированного диоксина и кислорода также не изменяются, а спиновая плотность равномерно распределяется по всей системе.
Схема механизма взаимодействия ТХДД и кислорода цитохрома Р-450
Таким образом, взаимодействие протонированного ТХДД и кислорода с первым электроном приводит к образованию термодинамически устойчивого водородного комплекса с перераспределением электронной плотности.
В результате присоединения к системе (ТХДДН+-О2-^) протона возможна структурная трансформация образующегося комплекса. После присоединения протона следует ожидать образования перекиси водорода и ТХДД как продуктов, имеющих энтальпии намного меньшие, чем исходные соединения.
В результате такой трансформации молекула протонированного диоксина вновь превращается в катион-радикал.
Квантово-химический анализ, проведенный методом РМ3, показал, что интермедиат (ТХДДН+-О2-^-Н+) не существует. Такой комплекс, по-видимому, с низким активационным барьером трансформируется в перекись водорода и катион-радикал ТХДД+-.
Таким образом, квантово-химические исследования подтверждают предложенную схему химического преобразования протонированного ТХДД в катион-радикал.
В результате возможного искажения процесса гидроксилирования ТХДД не окисляется, а остается на центре связывания цитохрома либо в качестве субстрата, либо в качестве донора электронов, заменяя флавин. Тем самым цитохром поддерживается постоянно в активном состоянии, и система может непрерывно элиминировать перекись водорода. Известно, что
реакция гидроксилирования инициируется процессом связывания субстрата с цитохромом [Шилов, Шульгин 1987: 754-792]. Комплекс (ТХДД-цитохром Р-450) может существовать длительное время не разрушаясь, и его образование приводит к постоянной инициации реакции. При этом ТХДД не гидроксилируется, генерируется пероксид водорода, а вся система, обеспечивающая микросомальное окисление, поддерживается в активной форме, в том числе и цепь переноса электронов. Последствия подобного искажения реакции гидроксилирования будут зависеть от скорости элиминирования перекиси водорода.
Таким образом, определяющей стадией предложенного механизма взаимодействия ТХДД и цитохрома может являться образование перекиси водорода. Если этот процесс будет протекать с высокой скоростью, как и ожидается для ТХДД, то в результате концентрация перекиси водорода резко повысится, а поток электронов через цепь переноса электронов возрастет.
Таким образом, особенностью взаимодействия молекулы ТХДД с кислородом цитохрома заключается в том, что в результате не происходит гидроксилирования ТХДД.
Предлагаемая схема взаимодействия диоксина с цитохромом Р-450 объясняет некоторые особенности воздействия ТХДД на биообъекты. Становятся объяснимыми следующие эффекты.
1. Отсутствие метаболитов ТХДД и продуктов его окисления может быть объяснено тем, что в результате химических свойств ТХДД происходит искажение реакции гидроксилирования и микросомального окисления не происходит. ТХДД остается в организме и выделяется в неизменном виде, а механизм взаимодействия диоксина с цитохромом носит циклический характер.
2. Большое время полувыведения ТХДД из организма биообъекта является следствием того, что механизм гидроксилирования, призванный переводить ксенобиотики в водорастворимые формы, в данном случае не срабатывает.
3. Высокую степень индукции при интоксикации ТХДД можно рассматривать как следствие протекающих безбарьерно реакций протонирования и взаимодействия с молекулярным кислородом. В результате цикличности этого процесса, его высокой скорости резко возрастает число взаимодействий диоксина с цитохромом, что обычно происходит при высоких концентрациях ксенобиотика, в то время как в данном случае одна молекула ТХДД выступает в роли инициатора множества реакций. Количество взаимодействий может контролироваться числом электронов, поток которых в систему окисления ксенобиотика должен резко возрасти. Таким образом, малые количества ТХДД создают эффект высоких концентраций. ТХДД также можно рассматривать в качестве донора электронов подобно конечному элементу в цепи переноса электронов - флавину.
Выявленный механизм катализа позволяет молекуле ТХДД непрерывно индуцировать образование перекиси водорода.
Высокую степень индукции цитохрома Р-450 при интоксикации ТХДД можно рассматривать как следствие создаваемого эффекта высоких концентраций.
В рамках предложенного механизма возможно объяснение известных экспериментальных данных по индукции цитохрома Р-450.
Предложенная схема взаимодействия ПХДД и кислорода цитохрома Р-450 позволяет рассматривать ПХДД как возможные переносчики электронов. Действительно, ПХДД, являясь донорами электронов, после переноса электронов на кислород цитохрома Р-450 превращаются в устойчивые катион-радикалы. При восстановлении последних возможно возобновление данной циклической реакции.
Известно, что при поступлении ксенобиотика происходит индукция цитохрома Р-450. Механизм этого процесса осуществляется, по-видимому, за счет образования фермент-субстратного комплекса и ассоциации компонентов гидроксилирующей системы в виде кластера. В результате цитохром Р-450 накапливается в мембране и уменьшается его катаболизм. После окисления субстрат выводится из мембраны, комплекс разрушается, фермент деградирует.
Результатом образования неразрушающегося комплекса (цитохром Р-450-ТХДД), приводящего к непрерывному функционированию гидроксилирующей системы, будет являться резкое увеличение концентрации цитохрома Р-450 и составных частей этой системы в мембране. Это, соответственно, вызывает уменьшение катаболизма монооксигеназных белков.
Ряд авторов считают, что существенно недооценено значение первичного метаболизма ПАУ в механизме индукции монооксигеназ [Ляхович, Цырлов 1981; Nebert 1979].
Проанализируем некоторые экспериментальные факты.
В присутствии субстратов активность ферментов ОСФ повышается. Скорость гидроксилирования субстратов в присутствии индукторов увеличивается во много раз. Так, при введении 2,3,7,8-ТХДД активность бензпирен-гидроксилазы увеличивается в 100 и более раз, в то время как концентрация цитохрома Р-448 увеличивается всего в несколько раз (2-4 раза) [Berry и соавт. 1976].
Увеличение скорости гидроксилирования 3,4-бензпирена может происходить за счет увеличения количества цитохрома Р-448, то есть точек связывания субстрата, а также за счет ускорения процесса гидроксилирования. Увеличение количества цитохрома Р-448 (в 2-4 раза) не объясняет значительного увеличения метаболизма 3,4-бензпирена (в 100 и более раз). Следовательно, по-видимому, наблюдается влияние индуктора на изменение скорости процесса гидроксилирования. Об этом же свидетельствуют следующие факты.
Через 4 ч. после введения индуктора 3МХ увеличивается активность бензпирен-гидроксилаз, через 12 ч. монооксигеназная активность возрастает уже в 10-20 раз, содержание же внутриклеточных рецепторов в этот период еще не изменяется [Nebert 1979]. Таким образом, рост активности бензпирен-гидроксилазы наблюдается уже через 4 ч., когда увеличение содержания цитохрома Р-448 еще не фиксируется. Следовательно, индукторы обладают какими-то особыми свойствами и могут работать как агенты, влияющие на процесс гидроксилирования.
Таким образом, предлагаемый возможный механизм индукции цитохрома Р-450 объясняет известные экспериментальные данные.
Следствием структурного подобия молекул индукторов и полностью восстановленного дигидрофлавина может являться подобие их биохимических механизмов действия.
Предлагаемый механизм биохимического действия ДД имеет ряд особенностей, аналогичных процессам переноса атома водорода от флавина к триплетному кислороду.
1. Способность ДД протонироваться по атому кислорода делает их похожими по структуре на восстановленные флавины:
CH CH
5
N'
H
O
H
O
протонированный по атому кислорода ДД
полностью восстановленный дигидрофлавин
2. Другой особенностью в обоих случаях является возможность переноса как электрона, так и протона к молекуле кислорода.
3. Следствием этого является способность генерировать супероксидный анион-радикал О2-. и перекись водорода как при взаимодействии восстановленного флавина с триплетным кислородом, так и при аналогичном процессе для ТХДД.
4. В результате в обоих случаях образуются радикалы, представляющие собой устойчивые системы с делокализацией неспаренного электрона. В самом деле, катион-радикал ТХДД обладает структурой с максимальной локализацией на атомах не более 0.23 атомных единиц, то есть заряд «размыт» по всей молекуле.
Таким образом, как флавины, так и протонированные ДД могут выступать в качестве доноров электронов. И флавиновая группировка цитохом-Р-450-зависимой редуктазы, и молекула ТХДД могут выступать в качестве элемента электронотранспортной цепи и конкурировать между собой за акцептор электронов -цитохром Р-450.
Показано, что в условиях ферментативного катализа производные дибензо-п-диоксина могут протонироваться и взаимодействовать с кислородом цитохрома Р-450, являясь катализатором образования активных форм кислорода: перекиси водорода и супероксиданиона. Предложена схема взаимодействия производных дибензо-п-диоксина и цитохрома Р-450, которая объясняет такие особенности воздействия данных соединений на биообъект, как отсутствие метаболитов, высокое время вывода из биообъектов, высокую концентрацию активных форм кислорода и др.
Предложен возможный механизм индукции цитохрома Р-450, который объясняет известные экспериментальные данные.
Библиографический список
Кузнецов П.Е., Кузнецова Н.Б., Власов И.А. Экспресс-метод определения 2,3,7,8-тетрахлордибензо-п-диоксина в водных средах // Ученые записки. Электронный научный журнал Курского государственного университета. 2013. Вып. 3(27). Ч. 2. URL: http://www.scientific-notes.ru/pdf/032-014.pdf (дата обращения: 22.01.2018).
Кучинский Е.В., Поляков И.Т. Химические свойства протонированных полихлорированных ДД // Первая конференция по диоксиновым ксенобиотикам: тез. докл. Шиханы, 1992. 34 с.
Лакин К.М., Крылов Ю.Ф. Биотрансформация лекарственных веществ. М.: Медицина, 1981. 342 с.
Ляхович В.В., Цырлов И.Б. Индукция ферментов метаболизма ксенобиотиков. Новосибирск: Наука. Сибирское отделение, 1981. 240 с.
Метелица Д.И. Активация кислорода ферментными системами. М.: Наука, 1982.
249 с.
Berry D.L., Zacharian P.K., Slaga T.G., Juchau M.R. Transplacental stimulation of benzo[a]pyrene metabolism in extrahepatic tissues by 2,3,7,8-TCDD // Fed. Proc. 1976. V. 35. P. 409-414.
Nebert D.W. Genetic aspect of enzyme induction by drugs and chemical carcinogens // In: The Induction of Drug Metabolism. Stuttgart. N.Y.: Schattauer, 1979. Р. 419-452.
Шилов А.Е., Шульпин Г.Б. Активация и каталитические реакции алканов в растворах комплексов металлов // Успехи химии. 1987. Т. LVI. №5. С. 754-792.
