CC BY
8
УДК 577.35
Векторная наноплатформа для прижизненной визуализации глубинных опухолей
Е. И. Шрамова1, С. М. Деев1-3, Г. М. Прошкина1*
1Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, 117997 Россия
2Первый Московский государственный медицинский университет имени Сеченова (Сеченовский университет), Москва, 119991 Россия
Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт», Москва, 123098 Россия
*E-mail: [email protected]
Поступила в редакцию 12.05.2024
Принята к печати 16.05.2024
DOI: 10.32607/actanaturae.27425
РЕФЕРАТ Оптический биоимиджинг на основе люминесценции и флуоресценции в доклинических исследованиях на сегодняшний день является незаменимым подходом при оценке развития неопластических трансформаций, изучения пролиферативной активности опухоли, ее метастатического потенциала, а также при оценке терапевтического эффекта противоопухолевых агентов. В рамках расширения возможностей оптической визуализации интерес представляет создание сенсоров, основанных на биолюминесцентной резонансной передаче энергии (BRET) и не зависящих от внешнего источника облучения. Для визуализации глубинных опухолей, характеризующихся сверхэкспрессией рецептора второго типа эпидермального фактора роста человека (HER2), в данной работе разработана адресная наноплатформа на основе HER2-специфичных липосом, внутренняя среда которых содержит генетически кодируемый BRET-сенсор. BRET-сенсор представлен гибридным белком, функциональные модули которого включают высококаталитическую люциферазу NanoLuc (донор энергии) и красный флуоресцентный белок с большим стоксовым сдвигом LSSmKatel (акцептор энергии). В опытах in vivo по визуализации внутрибрюшинных диссеминированных опухолей, сформированных клетками серозной цистаденокарциномы яичников SKOV3.ip1 и характеризующихся сверхэкспрессией HER2, установлено, что разработанная система применима для детекции глубоко расположенных опухолей определенного молекулярного профиля. Разработанная адресная система может стать эффективной платформой для оптимизации доклинических исследований новых таргетных препаратов.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА биолюминесцентный резонансный перенос энергии, DARPins-белки, белок с большим стоксовым сдвигом LSSmKatel, рецептор второго типа эпидермального фактора роста HER2, люцифе-раза NanoLuc, молекулярно-таргетный биоимиджинг.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ BRET (bioluminescence resonance energy transfer) - биолюминесцентный резонансный перенос энергии; DARPin (Designed Ankyrin Repeat Proteins) - искусственные белки с анкириновыми повторами; HER2 (human epidermal growth factor receptor 2) - рецептор второго типа эпидермального фактора роста человека; LSS protein (large Stockes shift) - белок с большим стоксовым сдвигом.
ВВЕДЕНИЕ
Несмотря на колоссальный прогресс терапии опухолей, обусловленный ранней диагностикой и инновационными методами лечения, рак по-прежнему остается одной из основных причин смертности во всем мире. Так, по данным Всемирной организации здравоохранения, в 2022 году было зарегистрировано 20 миллионов новых случаев рака, почти половина из которых - 9.7 миллиона, за-
кончились летальным исходом (https://www.who. mt/news/item/01-02-2024-global-cancer-burden-growing--amidst-mounting-need-for-services). Поскольку метастазирование является основной причиной смерти онкологических больных, актуальна разработка новых модельных систем и технологий для проведения доклинических исследований, позволяющих оценивать как процесс развития опухоли, так и отклик опухоли на терапию.
Современные знания о молекулярных основах он-когенеза, позволяющие проводить профилирование (или типирование) опухоли, определяют развитие таргетной терапии, строго селективно воздействующей на конкретные молекулярные мишени, специфичные для данного типа или подтипа рака, такие, как антигены клеточной поверхности, факторы роста, рецепторы или пути передачи сигналов, регулирующие клеточный цикл, пролиферацию, метаста-зирование и ангиогенез.
Вместе с развитием методов молекулярного профилирования опухоли в экспериментальной онкологии интенсивно развивается направление доклинических методов неинвазивной молекуляр-но-таргетной визуализации опухолей и метастазов [1—3]. Мониторинг в живом организме распространения клеточных популяций, экзогенно введенных в модельный организм, исключительно важен для понимания онкогенеза, а также для оценки терапевтического эффекта противоопухолевых агентов в доклинических фармакологических исследованиях [2, 4].
Оптический биоимиджинг в режиме реального времени на уровне целого организма на основе флуоресцентных и люминесцентных систем является незаменимым инструментом современных доклинических исследований [1, 3, 5].
Биолюминесцентная визуализация основана на детекции видимого света, выделяемого в результате реакции окисления люциферазой своего специфического субстрата [6]. Для мониторинга роста или регрессии опухоли, а также для оценки эффективности противоопухолевого препарата in vivo ген люциферазы конститутивно или индуцибельно экс-прессируется в опухолевых клетках, на основе которых потом формируется модель рака у животного [7, 8]. Биолюминесцентная визуализация широко используется в доклинических исследованиях, однако внедрению данного метода в клинику препятствует необходимость получения клеточной линии, транс-фицированной геном люциферазы.
Флуоресцентная визуализация позволяет получать изображения опухолей путем детекции света, генерируемого флуоресцентными белками, квантовыми точками или флуоресцентными красителями [1]. Однако необходимость использования внешнего источника света для возбуждения флуоресцентной метки накладывает существенные ограничения на применение этого метода для детекции глубинных опухолей: при прохождении через ткани интенсивность возбуждающего света резко падает вследствие дифракции, снижающей пространственное разрешение флуоресцентных изображений, диффузии, обусловливающей рассеяние света тканями,
а также вследствие поглощения фотонов биологическими хромофорами (меланином, гемоглобином, оксигемоглобином) [1, 9, 10].
Преодолеть описанные ограничения позволяют методы оптического биоимиджинга, основанные на механизме резонансной передачи энергии - биолюминесцентной (BRET, bioluminescence resonance energy transfer) или флуоресцентной (FRET, fluorescence resonance energy transfer), которые все чаще используются в доклинических исследованиях [11]. И хотя в основе BRET- и FRET-систем лежит один и тот же механизм - Фёрстеровский резонансный перенос энергии от донора к акцептору [12], BRET-системы являются более предпочтительными, поскольку отсутствие автофлуоресценции и фотообесцвечивания, связанных с возбуждением флуорофора, обеспечивает повышенную чувствительность детекции на уровне организма.
Стандартные системы BRET состоят из люци-феразы, которая в присутствии своего биолюмино-генного субстрата действует как донор резонансной энергии, и акцептора, представленного флуоресцентным белком, красителем или квантовыми точками. Для эффективного оптического биоимиджинга на животных BRET-система должна обладать высокой передачей энергии от донора к акцептору, отличным спектральным разрешением, и акцептором, излучающем в красном диапазоне спектра. Для визуализации глубоких тканей и всего тела предпочтителен именно красный и ближний инфракрасный диапазон из-за отсутствия поглощения света гемоглобином, меланином и водой в этой области спектра.
На сегодняшний день разработано порядка двух десятков высокочувствительных BRET-систем [11], использующих в качестве донора энергии люци-феразы кораллов Renilla reniformis (RLuc), североамериканского светлячка Photinus pyralis (Fluc), генно-инженерную люциферазу NanoLuc из глубоководной креветки Oplophorus gracilirostris и белки различной цветовой палитры, в том числе с максимумом эмиссии в красном диапазоне спектра [13-19], в качестве акцепторов.
Во всех перечисленных работах по созданию BRET-сенсоров на основе флуоресцентных белков для мониторинга раковых клеток в организме животного использовали опухолевые модели на основе генно-модифицированных клеток, стабильно экс-прессирующих ген BRET-сенсора. В своей работе мы предлагаем другой подход, предполагающий детекцию опухолей, глубоко расположенных в организме животного, с помощью BRET-сенсора, введенного в организм экзогенно и обладающего тропностью к опухоли определенного молекулярного профиля.
В качестве мишени нами выбран такой опухоль-ассоциированный антиген, как рецептор второго типа эпидермального фактора роста человека HER2 (Human epidermal growth factor receptor type 2). Известно, что 15-20% опухолей молочной железы и рака яичника человека характеризуются повышенным уровнем экспрессии гена HER2 [20, 21]. В современной медицинской практике онкомаркер HER2 служит терапевтической мишенью для моно-клональных антител (Пертузумаб, Трастузумаб) и ингибиторов киназ (Лапатиниб) при HER2-положительных опухолях молочной железы [22].
В данной работе разработана платформа для детекции HER2-положительных опухолей на основе опухоль-специфичных липосом, загруженных генетически кодируемым BRET-сенсором (рис. 1). BRET-сенсор представлен гибридным белком на основе высококаталитической люциферазы NanoLuc и красного белка с большим стоксовым сдвигом LSSmKatel (Ä,exAem = 463/624 нм) [23] -NanoLuc-LSSmKatel. Люцифераза NanoLuc в присутствии субстрата фуримазина служит источником эндогенной биолюминесценции, будучи тем самым источником энергии для возбуждения красного флуоресцентного белка LSSmKatel. Тропность липосом к HER2-антигену на поверхности раковой клетки определяется HER2-специфичным белком DARPin_9-29 [24]. Функциональность разработанной системы in vivo показана в опытах на модели глубинных диссеминированных опухолей.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Клонирование гена NanoLuc-LSSmKatel и наработка белков NanoLuc-LSSmKatel, NanoLuc и DARPin_9-29
Нуклеотидная последовательность, кодирующая LSSmKatel, получена введением мутаций K69Y/P131T/S148G/M167E/T183S/M196V в кодирующую последовательность mKate2 (плазмида pmKate2-N, «Евроген», Россия). Затем последовательности, кодирующие люциферазу NanoLuc и красный флуоресцентный белок LSSmKatel, объединяли в одной рамке считывания и клонировали в вектор pET22b. Между кодирующими последовательностями генов NanoLuc и LSSmKatel находится линкер, кодирующий полипептид GGGGS. Пептидный линкер предусмотрен для того, чтобы два функциональных домена (люцифераза NanoLuc и флуоресцентный модуль LSSmKatel) в гибридном белке не испытывали стерических затруднений в пространстве, имея возможность сохранить свои функциональные свойства, но при этом быть сближенными для эффективного протекания BRET.
LSSmKate1
7
У
NanoLuc
HER2-nоложительные внутрибрюшинные диссеминированные опухоли
Фуримазин
HER2-специфичные липосомы, загруженные BRET-сенсором
Биоимиджинг без возбуждения флуорофора внешним светом
Рис. 1. Адресная наноплатформа на основе BRET-сенсора NanoLuc-LSSmK.ate1 и HER2-специфичных липосом для неинвазивной диагностики глубинных опухолей. Концептуальная схема эксперимента: генетически кодируемый BRET-сенсор NanoLuc-LSSmKate1 включен в липосомы, модифицированные по внешней поверхности HER2-специфичным модулем DARPin_9-29. В присутствии люциферазного субстрата в организме животного происходит активация красного флуоресцентного белка без внешнего источника света, позволяя прижизненно в режиме реального времени детектировать глубоко расположенные опухоли в организме животного
Правильность финальной конструкции доказывали секвенированием. Кодирующая последовательность гена NanoLuc-LSSmKate1 соответствует белку с первичной структурой: MVFTLEDFVGDWRQTAG YNLDQVLEQGGVSSLFQNLGVSVTPIQRIVLSGEN GLKIDIHVIIPYEGLSGDQMGQIEKIFKVVYPVDDH HFKVILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYEGIAVFDG KKITVTGTLWNGNKIIDERLINPDGSLLFRVTINGV TGWRLCERILAGGGGSMVSELIKENMHMKLYMEG TVNNHHFKCTSEGEGKPYEGTQTMRIKVVEGGPL
PFAFDILATSFMYGSYTFINHTQGIPDFFKQSFPEG FTWERVTTYEDGGVLTATQDTSLQDGCLIYNVKIR GVNFTSNGPVMQKKTLGWEAGTEMLYPADGGLE GRSDEALKLVGGGHLICNLKSTYRSKKPAKNLKV PGVYYVDRRLERIKEADKETYVEQHEVAVARYCDL PSKLGHKLNAAALEHHHHHH.
Для получения белков (NanoLuc-LSSmKatel, NanoLuc и DARPin_9-29), использованных в этом исследовании, применяли метод автоиндукции [25]. Колонии E. coli BL21(DE3), трансформированные pET22-NanoLuc-LSSmKate1, pET22-NanoLuc или pET22-DARP, культивировали в автоиндукционной среде ZYM-5052 в присутствии ампициллина (100 мкг/мл) при 25°C и 200 об/мин в течение ночи. Автоиндукционная среда, содержащая эквимоляр-ные концентрации гидрофосфата натрия и дигидро-фосфата калия, препятствует закислению культу-ральной среды продуктами метаболизма бактерий и обеспечивает поддержание нейтральных значений рН даже при достижении культурой высоких плотностей (OD600 ~10). Сбалансированные концентрации глюкозы, лактозы и глицерина, а также высокая интенсивность перемешивания культуры (200 об/мин) позволяют индуцировать экспрессию гена целевого белка автоматически (при истощении в среде глюкозы), не прибегая к контролю плотности культуры. Биомассу осаждали центрифугированием при 6000 g в течение 15 мин, ресу-спендировали в 20 мМ NaPi, рН 8.0, 150 мМ NaCl, лизоцим (30 мкг/мл). Клетки разрушали ультразвуком, дебрис удаляли высокоскоростным центрифугированием (25000 g). К осветленному лиза-ту добавляли имидазол до конечной концентрации 30 мМ. Лизат фильтровали через мембрану с диаметром пор 0.2 мкм и наносили на колонку HisTrap, 1 мл (Cytiva). Белок выделяли согласно протоколу производителя. Концентрации белков определяли спектрофотометрически (по закону Бугера-Ламберта-Бера) с использованием следующих коэффициентов экстинкции: NanoLuc-LSSmKate1: е280 = 5 4 5 7 0 М^м'1; NanoLuc: е280 = 25400 М^м-1; DARPin: е280 = 4470 М-^м-1. Коэффициенты экстинк-ции определяли с помощью программы ProtParam tool (https://web.expasy.org).
Определение величины BRET в системе NanoLuc-LSSmKate1
Для оценки эффективности BRET в системе NanoLuc-LSSmKate1 проводили регистрацию спектров люминесценции NanoLuc-LSSmKate1 и NanoLuc в присутствии 5 мкМ фуримазина. Измерения проводили через 10 с после добавления люциферазного субстрата на приборе IVIS Spectrum CT (PerkinElmer, США) в режиме Excitation block,
спектр эмиссии регистрировали в диапазоне длин волн 500-740 нм с шагом 20 нм. Значение BRET рассчитывали как отношение энергии, излучаемой акцептором (NanoLuc-LSSmKatel), к энергии, излучаемой донором (NanoLuc) [26, 27].
Получение HER2-специфичных липосом, загруженных NanoLuc-LSSmKate1
Инкапсулирование NanoLuc-LSSmKatel в липосо-мы проводили согласно [28]. Суспензию фосфоли-пидов (0.3 мл, конечная концентрация 4 г/л), приготовленную из гранул L-a-фосфатидилхолина (Avanti Polar Lipids, Soy 40%), смешивали с 0.2 мл NanoLuc-LSSmKatel (конечная концентрация 150 мкМ в 20 мМ NaPi, pH 6.0). Инкапсуляция основана на электростатическом взаимодействии положительно заряженной полигистидиновой метки белка (pK имидазола гистидина ~6) и отрицательно заряженной внутренней липосомной мембраны при нейтральном значении pH. Суспензию фос-фолипидов и NanoLuc-LSSmKatel подвергали пятикратной процедуре быстрого замораживания (-150°С) и быстрого оттаивания (+30°С), после чего с помощью экструдера продавливали через фильтр с размером пор 100 нм. Липосомы отделяли от свободного белка и липидов с использованием гельпро-никающей хроматографии на колонке, упакованной сорбентом сефароза CL-2B.
Функционализацию внешней поверхности липосом HER-2-специфичным DARPin_9-29 проводили по аминогруппам фосфотидилэтаноламина. Для этого липосомы, загруженные NanoLuc-LSSmKatel, инкубировали с Ю-кратным молярным избытком сульфо-EMCS (эфир N-е-малеимидокапроилокси-сульфосукцинимида). Параллельно DARPin_9-29 (l00 мкМ в 20 мМ NaPi, pH 7.5) инкубировали с 2-иминотиоланом (6 мМ, реагент Траута, позволяющий ввести SH-группу по первичным аминам белка). Обе реакции проводили при комнатной температуре в течение 40 мин, после чего продукты отделяли от несвязавшихся модифицирующих агентов на колонке NAP5 (Cytiva). Конъюгацию сульфо-EMCS-протеолипосом с DARPin-SH проводили в течение 40 мин при комнатной температуре; DARPin-Lip(NanoLuc-LSSmKatel) отделяли от несвязанного DARPin_9-29 с помощью гельпроника-ющей хроматографии на колонке, упакованной се-фарозой CL-2B.
Клеточные линии
В работе использовали линию клеток серозной цистаденокарциномы яичников SKOV3.ipl, полученную из внутрибрюшинного асцита иммуно-дефицитной мыши, которой интраперитонеально
были введены клетки аденокарциномы яичника человека SKOV3 [29], а также клеточную линию SKOV3.ip1-NanoLuc, стабильно экспрессирующую ген люциферазы NanoLuc (коллекция клеточных линий лаборатории молекулярной иммунологии ИБХ РАН). SKOV3.ip1 и SKOV3.ip1-NanoLuc характеризуются сверхэкспрессией рецептора HER2 (106 рецептор/клетка). Клетки культивировали в стандартных условиях (37°С во влажной атмосфере с 5% CO2) в среде RPMI 1640 («ПанЭко», Россия), содержащей 2 мМ L-глутамина («ПанЭко»), 10% фетальной бычьей сыворотки (Gibco) и антибиотик (10 ЕД/мл пенициллина, 10 мкг/мл стрептомицина, «ПанЭко»).
Проточная цитометрия
Для изучения функциональной активности адресного модуля DARPin_9-29 в составе липосом оценивали взаимодействие DARP-Lip(NanoLuc-LSSmKate1) с HER2-положительными клетками SKOV3.ip1 методом проточной цитометрии. Клетки (100 000 в 200 мкл полной ростовой среды) инкубировали в течение 10 мин при 37°С с 300 нМ DARP-Lip(NanoLuc-LSSmKate1) (концентрация указана по NanoLuc-LSSmKate1). Клетки трижды промывали фосфатно-солевым буфером и анализировали на приборе NovoCyte 3000. Флуоресценцию LSSmKate1 возбуждали лазером с длиной волны 488 нм и детектировали в канале 615 ± 20 нм (канал PerCP-H).
Конфокальная микроскопия
Изучение связывания адресного модуля в составе DARP-Lip(NanoLuc-LSSmKate1) с рецептором HER2 на поверхности клеток SKOV3.ip1 проводили методом конфокальной микроскопии. Для этого 4000 клеток линии SKOV3.ip1 высевали в лунки 96-лу-ночного планшета со стеклянным дном (Eppendorf) и культивировали в течение ночи. На следующий день к клеткам добавляли 300 нМ DARP-Lip(NanoLuc-LSSmKate1) (концентрация указана по NanoLuc-LSSmKate1). Инкубацию клеток с конъ-югатом проводили в течение 20 и 90 мин. Ядра окрашивали 10 нМ Hoechst 33342 в течение 10 мин при 37°C. Клетки трижды промывали фосфатно-солевым буфером, добавляли среду FluoroBright (Gibco) и анализировали с помощью конфокального микроскопа LSM 980 (Carl Zeiss), используя масляный иммерсионный объектив 63* Plan-Apochromat. Флуоресценцию Hoechst 33342 возбуждали лазером с длиной волны 405 нм, детекцию проводили при 410-520 нм; LSSmKate1 возбуждали лазером с длиной волны 488 нм, флуоресценцию детектировали в диапазоне 600-755 нм.
Биолюминесцентная визуализация животных
Исследования in vivo проводили на мышах линии Balb/c nude/nude. Эксперименты на лабораторных животных проведены с соблюдением принципов гуманного обращения с животными, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕСС) и Хельсинкской декларации, в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (протокол Комиссии ИБХ РАН по контролю за содержанием и использованием животных № 368/2022 от 19.12.2022 г.). Модель диссемини-рованных внутрибрюшинных метастазов получали внутрибрюшинной инокуляцией 2 х 106 клеток линии SKOV3.ip1-NanoLuc в 100 мкл культураль-ной среды без сыворотки и антибиотиков. Рост внутрибрюшинных опухолей оценивали по люминесцентному сигналу. Для этого через 10 дней после прививки мышам в ретроорбитальный синус вводили 7 мкг фуримазина (Nano-Glo, Promega) в 100 мкл PBS и проводили биоимиджинг на приборе IVIS Spectrum CT (Perkin Elmier) в режиме «Люминесценция». Флуоресцентный биоимиджинг внутрибрюшинных опухолей проводили в режиме «Эпи-флуоресценция» в диапазоне 600-740 нм (с шагом 20 нм) без возбуждающего света (режим excitation block), при этом мышам в разные ретро-орбитальные синусы вводили: за 60 мин до анестезии - 2 мкМ DARP-Lip(NanoLuc-LSSmKate1) (концентрация указана по NanoLuc-LSSmKate1), за 30 с до анестезии - 7 мкг фуримазина. Съемку осуществляли сразу после засыпания животных.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Среди люцифераз, используемых в настоящее время в BRET-сенсорах, идеальным донором энергии является NanoLuc, поскольку выделяется своей необычайной яркостью (мощностью люминесценции) и малым размером [30]. В качестве акцептора энергии нами был выбран красный белок с большим стоксовым сдвигом LSSmKate1 с максимумом эмиссии при 624 нм [23]. Этот белок удовлетворяет двум важным условиям: 1) спектр возбуждения LSSmKate1 (максимум возбуждения 463 нм) совпадает со спектром эмиссии окисленной формы лю-циферазного субстрата (максимум эмиссии 460 нм) (рис. 2А); 2) спектр эмиссии LSSmKate1 находится в окне прозрачности биоткани (600-1000 нм), где коэффициент поглощения ткани минимален [31].
Известно, что эффективность BRET зависит от расстояния: чтобы процесс безызлучательного переноса энергии был эффективен, донор и акцептор должны находиться друг от друга на расстоянии, не превышающем 10 нм [32]. Именно поэтому
Л
ш
и
0
1
m s
и
I
<U н I
X
1.2
0.8
0.4
NanoLuc, эмиссия
LSSmKate1,
возбуждение
400 500
Длина волны, нм
600
NanoLuc
LSSmKatel
9
Фуримазин Фуримамид
210 260 310 360 410 460 510 560 610 660 Длина волны, нм
7.92
3.92
-û \
!3 -во,
5*
Ï -0.08
500
_ À624NanciLuc — LSSmKate À,hlN.nH il ,<п
BKt I — ~—-- ~—--
NanoLuc— LSSmKate A... ..NanoLuc
NanoLuc -—- NanoLuc-LSSmKate1
550 600 650 700 750 800 Длина волны, нм
Рис. 2. Характеристика BRET-сенсора NanoLuc-LSSmKate1. Л - нормированные спектры люминесценции лю-циферазы NanoLuc в присутствии 30 мкМ фуримазина (синяя кривая) и флуоресценции LSSmKate1 (бордовая кривая). Б - схема BRET-сенсора NanoLuc-LSSmKate1 и принцип работы: люцифераза NanoLuc высокоспецифично окисляет свой субстрат фуримазин, окисленная форма которого, фуримамид, излучает в синем диапазоне спектра. Часть этой энергии безызлучательно переносится на LSSmKate1, находящийся в одной полипептидной цепи с люциферазой NanoLuc. LSSmKate1 начинает флуоресцировать. В - спектр поглощения очищенного белка NanoLuc-LSSmKate1 и образец белка в пробирке. Г - спектры флуоресценции NanoLuc-LSSmKate1 (сиреневая кривая) и NanoLuc (синяя кривая), зарегистрированные на приборе IVIS Spectrum CT без возбуждения внешним светом (режим excitation block) в присутствии люциферазного субстрата. Приведена формула для расчета эффективности резонансного переноса энергии в системе NanoLuc-LSSmKate1
Б
0
В
представлялось целесообразным получить гибридный белок NanoLuc-LSSmKate1 с максимально сближенными функциональными модулями (люцифераза и флуоресцентный белок). Схема работы BRET-сенсора представлена на рис. 2Б: люцифераза NanoLuc окисляет субстрат фуримазин, который при переходе в окисленную форму, фу-римамид, испускает фотоны в видимой области спектра. Частично эта энергия поглощается акцептором - флуоресцентным белком LSSmKate1, который при этом переходит в возбужденное состояние и флуоресцирует.
Конструкцию NanoLuc-LSSmKate1 и соответствующий ей белок получали как описано
в «Экспериментальной части». Спектр поглощения очищенного белка NanoLuc-LSSmKate1 характеризуется сильным поглощением в видимой области спектра, о чем говорит наличие пика при 460 нм и ярко-желтый цвет очищенного белка (рис. 2В).
Эффективность резонансного переноса энергии в системе NanoLuc-LSSmKate1, рассчитанная как отношение величины эмиссии системы «донор-акцептор» (NanoLuc-LSSmKate1) на длине волны максимума испускания акцептора (624 нм) к величине эмиссии этой системы на длине волны максимума испускания донора (NanoLuc, 460 нм) за вычетом этого же отношения, детектированного только для донора [8, 33], составила 0.3 (рис. 2Г).
Для селективной доставки BRET-сенсора к HER2-положительным опухолям использовали липосомы, модифицированные по внешней поверхности HER2-специфичным модулем DARPin_9-29 (Designed Ankyrin Repeat Proteins), который взаимодействует с субдоменом I рецептора HER2 с высокой аффинностью (KD = 3.8 нМ) [24]. DARPin-белки являются новым классом адресных молекул неиммуноглобулиновой природы. Эти молекулы отличаются от антител высоким уровнем экспрессии, мономерностью в растворе, небольшими размерами, устойчивостью к протеазам и высокой растворимостью [34, 35]. Перечисленные особенности позволяют DARPins конкурировать с антителами в качестве альтернативных адресных компонентов в составе мультифункциональных соединений, предназначенных для терапии онкозаболеваний.
Метод загрузки BRET-сенсора в липосомы основан на электростатическом взаимодействии положительно заряженной полигистидиновой метки белка (pKa имидазола гистидина ~6) и отрицательно заряженной внутренней липосомной мембраны при нейтральном значении pH [28]. Концентрацию липосом, загруженных NanoLuc-LSSmKatel, оценивали спектрофотометрически, сравнивая спектр поглощения пустых липосом со спектром протеоли-посом. Как видно из рис. 3А, спектр протеолипо-сом (синяя кривая) совпадает со спектром пустых липосом с концентрацией 4.25 г/л (зеленая кривая), полученных 15-кратным продавливанием суспензии фосфолипидов через фильтр с диаметром пор 100 нм. Ранее с использованием гидрофильного мембранонепроницаемого красителя фталоцианин-3,4',4',4''-тетрасульфоната меди (CPTS) мы установили, что концентрация липидных везикул в 1 мг/мл суспензии соответствует 1.2 нМ [28]. Таким образом, молярная концентрация суспензии липосом 4.25 г/л составляет 5.1 нМ. Вычитание спектра пустых липосом (зеленая кривая на рис. 3А) из спектра липосом, нагруженных NanoLuc-LSSmKate1 (синяя кривая на рис. 3А), дает спектр NanoLuc-LSSmKate1, включенного в липосому (сиреневая кривая на рис. 3А). Концентрация белка, включенного в липосомы, составляет ~5.42 мкМ (OD280/e280 = 0.296/54570). Следовательно, одна протеолипосома содержит ~ 1063 молекул BRET-сенсора.
Функционализацию протеолипосом адресным модулем DARPin проводили с использованием реагента Траута (2-иминотиолана) и гидрофильного амино/ сульфгидрильного сшивающего агента сульфо-EMCS как описано в «Экспериментальной части».
Способность липосом, загруженных BRET-сенсором и функционализированных адресным модулем DARPin, взаимодействовать с рецептором
HER2 in vitro изучена методами проточной цито-метрии и конфокальной микроскопии (рис. 3Б,В). Данные проточной цитометрии подтверждают специфическое взаимодействие DARPin-модифицированных липосом с рецептором HER2 на поверхности клеток SKOV3.ip1. Как видно из рис. 3Б, средняя интенсивность флуоресценции (MFI, median fluorescence intensity) HER2-положительных клеток SKOV3.ip1, обработанных DARP-Lip(NanoLuc-LSSmKatel), составляет 102279 (зеленая кривая на рис. 3Б), что примерно в 25 раз выше автофлуоресценции этих клеток (синяя кривая на рис. 3Б).
С помощью конфокальной микроскопии установлено, что в течение 20 мин инкубации клеток SKOV3.ip1 с 300-нМ суспензией DARP-Lip(NanoLuc-LSSmKatel) происходит эффективное связывание адресных протеолипосом с мембраной клетки (красная корона по мембране клеток на левом фото рис. 3В). Дальнейшая инкубация в течение 1.5 ч приводит к интернализации DARP-Lip(NanoLuc-LSSmKate1), о чем свидетельствуют красные пиксели в цитоплазме (рис. 3В, правое фото).
Таким образом, как видно из приведенных данных (рис. 3), разработанная система характеризуется высокой степенью загрузки BRET-сенсора в липосомы и высокой специфичностью к HER2-мишени.
Применимость DARPin-модифицированных липосом, загруженных BRET-сенсором, для неинва-зивной детекции in vivo HER2-положительных глубоко расположенных опухолей в режиме реального времени оценивали на мышиной модели диссеми-нированных внутрибрюшинных метастазов, сформированной на основе клеток карциномы яичника человека SKOV3.ip1, стабильно экспрессирующих репортерный ген NanoLuc. Клетки SKOV3.ip1 характеризуются высоким потенциалом метастазиро-вания, имитируя при внутрибрюшинном введении позднюю стадию рака яичников с обширным распространением опухолевых клеток на стенку брюшины и поверхность органов [29]. Мониторинг роста внутрибрюшинных опухолей проводили по детекции люминесцентного сигнала через 10 дней после прививки животным опухолевых клеток, экс-прессирующих NanoLuс (рис. 4, верхние фото). Мониторинг биораспределения липосом DARP-Lip(NanoLuc-LSSmKatel), введенных в организм животного системно, осуществляли по детекции флуоресцентного сигнала, который регистрировали в режиме отсутствия возбуждения внешним светом (рис. 4, нижние фото). Как видно из рис. 4, интенсивность и топография люминесцентного сигнала, детектируемого после введения мышам фуримази-
А
д
е с.
б
а е,
и н
е ще
о л г о
d
NanoLuc-LSSmKatel, включенный в липосому
Lip(NanoLuc-LSSmKatel)
Пустые липосомы, 4.25 г/л
210 260 310 360 410 460 510 560 610 660 Длина волны, нм
"-S
й,
и т ы б о с
о в т с е ч и л о К
100-
80
60
40
20
Красный канал флуоресценции (PerCP-H)
t • 20 мин 90 мин
50 мкм 50 мкм
i----^
Б
0
В
Рис. 3. Характеристика HER2-специфичных липосом, загруженных BRET-сенсором NanoLuc-LSSmKatel. А - спектры поглощения пустых липосом (зеленая кривая) и липосом, содержащих NanoLuc-LSSmKatel (синяя кривая). Сиреневая кривая соответствует белку NanoLuc-LSSmKatel, загруженному в липосомы. Б - данные проточной цитометрии по рецептор-специфичному взаимодействию DARP-Lip(NanoLuc-LSSmKatel) с HER2-положительными SKOV3ip-клетками. Синяя кривая соответствует флуоресцентно немеченным клеткам (контроль), зеленая кривая - клеткам, обработанным DARP-Lip(NanoLuc-LSSmKatel).
На пиктограмме указаны значения средней интенсивности флуоресценции (MFI). Детекцию сигнала вели в красном канале флуоресценции (PerCP-H, = 615 ± 20 нм) при возбуждении лазером 488 нм. В - наложенные конфокальные изображения в синем 405 нм, детекция 410-520 нм) и красном 488 нм, детекция 600-755 нм) каналах флуоресценции клеток SKOV3.ip1 после 20 мин (левое фото) и 90 мин (правое изображение) инкубации с DARP-Lip(NanoLuc-LSSmKatel). Ядра окрашены Hoechst 33342
на, полностью совпадают с интенсивностью и топографией флуоресцентного сигнала, детектируемого в режиме без возбуждения флуорофора (excitation block) после введения мышам DARP-Lip(NanoLuc-LSSmKatel) и фуримазина. Таким образом, разработанные HER2-специфичные липосомы, несущие BRET-сенсор, могут использоваться в прижизненном оптическом биоимиджинге для детекции глубоко расположенных опухолей определенного молекулярного профиля.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Число противоопухолевых препаратов, не эффективных в клинике, намного превышает количество препаратов, эффективных в доклинических исследованиях [2, 36]. Этот факт указывает на необходимость разработки новых моделей и новых технологий доклинического мониторинга отклика опухоли на лечение [36, 37]. Широко используемые в современных экспериментальных исследованиях модели ксенотрансплантатов подкожных опухолей in vivo
Люминесценция х 106 , ф/с/см2/ср
0 1 1.5 2 2.5
0 0.5 2.0 1.5
Эпи-флуоресценция х 106 , ф/с/см2/ср
Рис. 4. Оптический биоимиджинг внутрибрюшин-ных диссеминированных опухолей с использованием HER2-специфичных липосом, загруженных BRET-сенсором NanoLuc-LSSmKate1. Прижизненные люминесцентные (верхние фото) и флуоресцентные (нижние фото) изображения животных, полученные в режиме реального времени на приборе IVIS Spectrum CT в двух разных режимах детекции сигнала: верхние фото - режим биолюминесценции; нижние фото - режим флуоресценции без возбуждения флуорофора
позволяют проводить целенаправленный скрининг лекарственных средств и могут предоставить данные об эффективности препарата, фармакокинетике и фармакодинамике, однако не позволяют оценить метастатический потенциал опухоли. Применение ортотопических моделей позволяет создать релевантную модель заболевания, однако встает проблема определения опухолевой нагрузки на ор-
ганизм: как быть, если опухоль нельзя измерить штангенциркулем? Очевидно, что ценность любой доклинической модели для оценки эффективности противоопухолевых соединений определяется, в конечном итоге, ее способностью максимально близко прогнозировать клинический ответ у человека. Потребность в прижизненной визуализации событий, происходящих в организме животного на стадии доклинических исследований противоопухолевых препаратов, обусловила бурное развитие оптического биоимиджинга, а развитие методов молекулярного профилирования опухоли заложило основу для создания молекулярно-таргетной визуализации опухолей.
В данной работе разработана система, позволяющая в режиме реального времени проводить неинвазивную детекцию HER2-положительных внутрибрюшинных диссеминированных опухолей с помощью адресных липосом, загруженных BRET-сенсором NanoLuc-LSSmKate1. Система характеризуется высокой степенью загрузки BRET-сенсора в липосому (рис. 3), специфичностью протеолипо-сом к HER2-рецептору in vitro и in vivo (рис. 3, 4), а также позволяет проводить неинвазивную визуализацию опухолевых процессов на уровне целого организма (рис. 4).
Полагаем, что разработанная адресная система оптического биоимиджинга в реальном времени на основе BRET-сенсора NanoLuc-LSSmKate1 может стать эффективной платформой для оптимизации доклинических исследований новых таргетных препаратов. Кроме того, разработанный принцип создания адресного BRET-сенсора может стать универсальной платформой для неинвазивного био-имиджинга глубоко расположенных опухолей любого молекулярного профиля путем простой смены векторной молекулы на поверхности липосомы.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 24-14-00088 «Таргетированные флуоресцентные липосомы как система для неинвазивной оптической детекции первичных опухолей и удаленных метастазов HER2/EpCAM-положительных карцином»).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Bai J.W., Qiu S.Q., Zhang G.J. // Signal Transduct Target Ther. 2023. V. 8. № 1. P. 89.
2. O'Farrell A.C., Shnyder S.D., Marston G., Coletta P.L., Gill J.H. // Br. J. Pharmacol. 2013. V. 169. № 4. P. 719-735.
3. Hilderbrand S.A., Weissleder R. // Curr. Opin. Chem. Biol. 2010. V. 14. № 1. P. 71-79.
4. Shramova E.I., Kotlyar A.B., Lebedenko E.N., Deyev S.M., Proshkina G.M. // Acta Naturae. 2020. V. 12. № 3. P. 102-113.
5. Badr C.E. // Methods Mol. Biol. 2014. V. 1098. P. 1-18.
6. Serkova N.J., Glunde K., Haney C.R., Farhoud M., De Lille A., Redente E.F., Simberg D., Westerly D.C., Griffin L., Mason R.P. // Cancer Res. 2021. V. 81. № 5. P. 1189-1200.
7. Koessinger A.L., Koessinger D., Stevenson K., Cloix C.,
Mitchell L., Nixon C., Gomez-Roman N., Chalmers A.J., Norman J.C., Tait S.W.G. // Sci. Rep. 2020. V. 10. № 1. P. 15361.
8. Shramova E.I., Chumakov S.P., Shipunova V.O., Ryabova A.V., Telegin G.B., Kabashin A.V., Deyev S.M., Proshkina G.M. // Light Sci. Appl. 2022. V. 11. № 1. P. 38.
9. Ozawa T., Yoshimura H., Kim S.B. // Anal. Chem. 2013. V. 85. № 2. P. 590-609.
10. Grebenil E.A., Kostyuk A.B., Deyev S.M. // Russ. Chem. Rev. 2016. V. 85. № 12. P. 1277-1296.
11. Endo M., Ozawa T. // Int. J. Mol. Sci. 2020. V. 21. № 18. P. 6538.
12. Forster T. // Discuss. Faraday Soc. 1959. V. 27. P. 7-17.
13. Yeh H.W., Karmach O., Ji A., Carter D., Martins-Green M.M., Ai H.W. // Nat. Methods. 2017. V. 14. № 10. P. 971-974.
14. Eyre N.S., Aloia A.L., Joyce M.A., Chulanetra M., Tyrrell D.L., Beard M.R. // Virology. 2017. V. 507. P. 20-31.
15. Iglesias P., Costoya J.A. // Biosens. Bioelectron. 2009. V. 24. № 10. P. 3126-3130.
16. Branchini B.R., Rosenberg J.C., Ablamsky D.M., Taylor K.P., Southworth T.L., Linder S.J. // Anal. Biochem. 2011. V. 414. № 2. P. 239-245.
17. Rumyantsev K.A., Turoverov K.K., Verkhusha V.V. // Sci. Rep. 2016. V. 6. P. 36588.
18. Su Y., Walker J.R., Park Y., Smith T.P., Liu L.X., Hall M.P., Labanieh L., Hurst R., Wang D.C., Encell L.P., et al. // Nat. Methods. 2020. V. 17. № 8. P. 852-860.
19. Nishihara R., Paulmurugan R., Nakajima T., Yamamoto E., Natarajan A., Afjei R., Hiruta Y., Iwasawa N., Nishiyama S., Citterio D., et al. // Theranostics. 2019. V. 9. № 9. P. 26462661.
20. Ross J.S., Slodkowska E.A., Symmans W.F., Pusztai L., Ravdin P.M., Hortobagyi G.N. // Oncologist. 2009. V. 14. № 4. P. 320-368.
21.Polanovski O.L., Lebedenko E.N., Deyev S.M. // Biochemistry (Moscow). 2012. V. 77. № 3. P. 227-245.
22. Blumenthal G.M., Scher N.S., Cortazar P., Chattopadhyay S., Tang S., Song P., Liu Q., Ringgold K., Pilaro A.M., Tilley A., et al. // Clin. Cancer Res. 2013. V. 19. № 18. P. 4911-4916.
23. Piatkevich K.D., Hulit J., Subach O.M., Wu B., Abdulla A., Segall J.E., Verkhusha V.V. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. V. 107. № 12. P. 5369-5374.
24. Steiner D., Forrer P., Pluckthun A. // J. Mol. Biol. 2008. V. 382. № 5. P. 121-127.
25. Studier F.W. // Protein Expr. Purif. 2005. V. 41. № 1. P. 207-234.
26. Dragulescu-Andrasi A., Chan C.T., De A., Massoud T.F., Gambhir S.S. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011. V. 108. № 29. P. 12060-12065.
27. Shramova E.I., Filimonova V.P., Frolova A.Y., Pichkur E.B., Fedotov V.R., Konevega A.L., Deyev S.M., Proshkina G.M. // Eur. J. Pharm. Biopharm. 2023. V. 193. P. 208-217.
28. Deyev S., Proshkina G., Baryshnikova O., Ryabova A., Avishai G., Katrivas L., Giannini C., Levi-Kalisman Y., Kotlyar A. // Eur. J. Pharm. Biopharm. 2018. V. 130. P. 296-305.
29. Yu D., Wolf J.K., Scanlon M., Price J.E., Hung M.C. // Cancer Res. 1993. V. 53. № 4. P. 891-898.
30. Hall M.P., Unch J., Binkowski B.F., Valley M.P., Butler B.L., Wood M.G., Otto P., Zimmerman K., Vidugiris G., Machleidt T., et al. // ACS Chem. Biol. 2012. V. 7. № 11. P. 1848-1857.
31. Mahmood U. // IEEE Eng. Med. Biol. Mag. 2004. V. 23. № 4. P. 58-66.
32. Carpenter S., Fehr M.J., Kraus G.A., Petrich J.W. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. № 25. P. 12273-12277.
33. Proshkina G.M., Shramova E.I., Shilova O.N., Ryabova A.V., Deyev S.M. // J. Photochem. Photobiol. B. 2018. V. 188. P. 107-115.
34. Interlandi G., Wetzel S.K., Settanni G., Pluckthun A., Caflisch A. // J. Mol. Biol. 2008. V. 375. № 3. P. 837-854.
35. Zahnd C., Kawe M., Stumpp M.T., de Pasquale C., Tamaskovic R., Nagy-Davidescu G., Dreier B., Schibli R., Binz H.K., Waibel R., et al. // Cancer Res. 2010. V. 70. № 4. P. 1595-1605.
36. Suggitt M., Bibby M.C. // Clin. Cancer Res. 2005. V. 11. № 3. P. 971-981.
37. Tolmachev V.M., Chernov M.I., Deyev S.M. // Russ. Chem. Rev. 2023. V. 91. № 3. P. RCR5034.
