CC BY
122
УДК 577.29
Интернализация и рециркуляция рецептора HER2 при взаимодействии адресного фототоксичного белка DARPin-miniSOG с клетками аденокарциномы молочной железы человека
О. Н. Шилова*, Г. М. Прошкина, Е. Н. Лебеденко, С. М. Деев
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 *E-mail: [email protected] Поступила в редакцию 10.05.2015
РЕФЕРАТ Разработка и исследование новых высокоаффинных белковых соединений, способных избирательно и эффективно уничтожать раковые клетки человека, являются актуальной задачей современных биомедицинских исследований. В работе изучена способность рекомбинантного фототоксичного белка DARPin-miniSOG взаимодействовать с клетками аденокарциномы молочной железы человека, гиперэкс-прессирующими рецептор 2 эпидермального фактора роста человека (HER2). Установлено, что адресный фототоксин DARPin-miniSOG специфически взаимодействует с рецептором HER2 и вызывает его интер-нализацию, за которой следует медленный возврат рецептора на клеточную мембрану. Выяснение характера взаимодействия белка DARPin-miniSOG с рецептором является важным условием для дальнейшей разработки методов воздействия на HER2-положительные опухоли с использованием данного фототоксина. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА адресные фототоксичные белки, интернализация, каркасные белки, рециркуляция, рецептор HER2, DARPin.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ HER2 - рецептор 2 эпидермального фактора роста человека; PBS - фосфатно-соле-вой буфер; scFv - одноцепочечный вариабельный фрагмент антител; DARPin - искусственный белок с ан-кириновыми повторами (Designed Ankyrin Repeat Protein); IPTG - изопропилтио-0-О-галактопиранозид.
ВВЕДЕНИЕ
Моноклональные антитела и их производные широко используются в биомедицинской практике для селективного, прицельного поражения опухолевых новообразований человека [1, 2]. Вместе с тем, успехи в разработке методов получения неприродных белков, высокоаффинных к специфическим мишеням (создание синтетических библиотек, разработка эффективных технологий отбора белков, высокоаффинных к специфической мишени), позволили создать новые, так называемые каркасные белки (скаффол-ды) неиммуноглобулиновой природы с единым основным каркасом и возможностью варьировать специфичность по отношению к мишени [3-5]. Зачастую каркасные белки, обладая такой же высокой аффинностью и специфичностью к мишени, как соответствующие моноклональные антитела, превосходят их по своим физико-химическим свойствам.
Так, для каркасных белков характерно отсутствие агрегации, небольшой размер, обеспечивающий эффективное проникновение в ткани, быстрый фолдинг и высокая химическая, протеолитическая и термическая стабильность. Возможность получения нужного каркасного белка с единственным остатком цистеина в его составе облегчает последующую конъюгацию с цитотоксинами, флуорофорами или наночастица-ми, а отсутствие дисульфидных связей позволяет экспрессировать эти белки в цитоплазме Escherichia coli и нарабатывать белки, высокоаффинные к конкретной мишени, без иммунизации животных. Перечисленные особенности дают каркасным белкам неоспоримые преимущества перед иммуноглобулинами в качестве альтернативных адресных компонентов в составе мультифункциональных соединений, предназначенных для диагностики и терапии различных заболеваний.
К каркасным белкам, представляющим альтернативу моноклональным антителам, относятся аднек-тины, аффибоди, антикалины, а также искусственные белки, сконструированные на основе природных белков с повторяющимися структурными мотивами (анкириновые и тетратрикопептидные повторы) [3-5].
В лаборатории А. Плюктуна на основе искусственных белков с анкириновыми повторами - DARPins (Designed Ankyrin Repeat Proteins), получен ряд белков, обладающих высокой аффинностью к рецептору 2 эпидермального фактора роста человека HER2 (ERBB2) [6].
Поверхностный клеточный рецептор HER2 сверхэкспрессируется в 20-30% опухолей молочной железы и яичников [7, 8]. Как правило, сверхэкспрессия этого рецептора коррелирует с агрессивным фенотипом опухоли и активным метастазированием [9], что делает его привлекательной мишенью для иммунотерапии рака, поскольку в норме HER2 экспресси-руется лишь в небольших количествах на поверхности эпителиальных клеток. Таким образом, создание и исследование новых высокоаффинных белковых соединений, способных избирательно и эффективно уничтожать раковые клетки, сверхэкспрессирующие HER2, остаются актуальной задачей.
В своей работе мы использовали DARPin_9-29 в качестве адресного домена, способного доставить к HER2-положительным клеткам аденокарциномы молочной железы человека фототоксический белок miniSOG [10].
Цель данного исследования состояла в изучении способности гибридного белка DARPin-miniSOG взаимодействовать с опухолевыми клетками, сверх-экспрессирующими HER2, и возможности интерна-лизации образующегося комплекса HER2/DARPin-miniSOG.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Клеточные линии и условия культивирования
Культивируемые клетки аденокарциномы молочной железы человека SK-BR-3, сверхэкспрессирующие HER2, и клетки яичников китайского хомячка CHO растили в среде McCoy's 5A (Life technologies, США) с 10% эмбриональной сывороткой крупного рогатого скота (HyClone, Бельгия) в атмосфере 5% CO2 при 37°C.
Получение белка DARPin-miniSOG
Кодирующую последовательность адресного модуля DARPin_9-29 амплифицировали с плазмиды pCG-Hnse-DARPin-d18-9-29 (любезно предоставлена А. Плюктуном, Университет Цюриха). ПЦР-
фрагмент обрабатывали эндонуклеазами рестрикции NdeI и HindIII и лигировали с вектором pET22b, предварительно обработанным этими же эндону-клеазами рестрикции. Кодирующую последовательность цитотоксического модуля miniSOG амплифи-цировали с плазмиды pSD-4D5scFv-miniSOG [11], обрабатывали эндонуклеазами рестрикции HindIII и XhoI и клонировали в вектор pET22b в одной рамке считывания с кодирующей последовательностью DARPin_9-29. В результате экспрессионная кассета содержала индуцибельный промотор фага Т7, последовательности, кодирующие DARPin-9_29, miniSOG и олигогистидиновый пептид.
Белок DARPin-miniSOG экспрессировали в штамме BL21(DE3). Экспрессию индуцировали 1 мМ IPTG при достижении культурой OD600 = 0.5 - 0.7. После индукции биомассу растили при 25°С в течение 8 ч. Белок DARPin-miniSOG выделяли из растворимой фракции с использованием металл-хелатной аффинной хроматографии согласно протоколу производителя.
Проточная цитофлуориметрия
Опыты по проточной цитофлуориметрии выполняли на проточном цитометре BD Accuri C6 (Becton Dickinson, США). Адгезивные клетки снимали с подложки раствором Версена («ПанЭко», Россия) и промывали фосфатно-солевым буфером (PBS, «ПанЭко», Россия). Для определения субпопуляций живых и мертвых клеток пробу инкубировали в 100 мкл PBS с йодидом пропидия (конечная концентрация 2.5 мкг/мл, Sigma-Aldrich, США) в темноте на льду в течение 5 мин. Для каждого образца собирали не менее 104 событий. При измерении последовательно выделяли популяции одиночных клеток, затем живых клеток (не окрашенных йо-дидом пропидия). Для детекции использовали следующие параметры: напряжение на лазере 20 мВт и фильтры 533/30 (FL1-канал) для детекции флуоресценции DARPin-miniSOG, 585/40 (FL2-канал) для детекции флуоресценции йодида пропидия. Полученные данные анализировали с использованием программного обеспечения BD Accuri C6.
Конкурентный анализ
Специфичность связывания рекомбинантного белка DARPin-miniSOG с клеточным рецептором HER2 определяли по уровню флуоресценции HER2-сверхэкспрессирующих клеток, окрашенных белком DARPin-miniSOG, с помощью проточной цитофлу-ориметрии в отсутствие и в присутствии конкурирующего агента. Клетки линии SK-BR-3, достигшие конфлюэнтности, снимали с подложки раствором Версена, промывали дважды PBS. На один опыт
брали ~105 клеток. Клетки инкубировали с белком DARPin-miniSOG (500 нМ) на льду в течение 30 мин, затем дважды отмывали раствором PBS от несвя-завшегося белка и анализировали уровень флуоресценции в канале FL1 (зеленая флуоресценция). В качестве параметра интенсивности флуоресценции в работе использовали среднее значение интенсивности флуоресценции Mean FL1. В качестве конкурирующего агента использовали DARPin_9-29 в экви-молярной концентрации. В качестве отрицательного контроля использовали анти-HER2-мини-антитело 4D5scFv, специфичное к другому эпитопу HER2.
Оценка интернализации HER2 при взаимодействии c DARPin-miniSOG
Клетки SK-BR-3 выращивали в течение 14 ч на среде McCoy's 5A (Life technologies, США), содержащей 1% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, Бельгия). Культуральную среду удаляли, клетки снимали с пластика и дважды промывали стерильным PBS. Суспензию клеток в количестве 4 х 105 в течение 30 мин инкубировали на льду в 250 мкл 1 мкМ раствора DARPin-miniSOG в PBS, осаждали центрифугированием на охлажденной центрифуге в течение 5 мин при 800д, однократно промывали холодным PBS и делили на четыре части. Первую из них использовали для измерения уровня флуоресценции клеток, окрашенных белком DARPin-miniSOG при 4°С. Для контроля уровня базовой аутофлуоресценции клеток использовали клетки, не инкубированные с белком DARPin-miniSOG.
Остальные три части суспензии клеток (по 1 х 105 клеток в каждой), однократно окрашенных белком DARPin-miniSOG при 4°С, помещали в среде McCoy's с 1% сывороткой в 24-луночный планшет и оставляли в С02-инкубаторе в атмосфере 5% CO2 при 37°С до следующего измерения. Через 4, 8 и 12 ч после первого измерения клетки второй, третьей и четвертой части соответственно снимали с пластика раствором Версена, дважды промывали PBS, половину оставляли для контроля уровня базовой флуоресценции, вторую половину инкубировали в течение 30 мин в 50 мкл 1 мкМ раствора DARPin-miniSOG на льду. После окончания инкубации клетки однократно промывали холодным PBS. Флуоресценцию DARPin-miniSOG измеряли в обеих полученных пробах для каждого временного интервала.
Оценка динамики окраски белком DARPin-miniSOG клеток SK-BR-3, обработанных папаином
Клетки SK-BR-3 выращивали в течение 14 ч на среде McCoy's 5A (Life technologies, США), содержащей 1% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, Бельгия). Культуральную среду удаляли, клетки
снимали с пластика и дважды промывали стерильным PBS. Для удаления внеклеточного домена HER2 суспензию клеток 1.5 х 106 инкубировали в 1% растворе папаина (AppliChem, Германия) при 37°С в течение 15 мин. Клетки промывали холодным PBS, делили на семь частей. Первую часть (нулевой момент времени) делили пополам, одну половину (~12.5 х 104 клеток) окрашивали белком DARPin-miniSOG (1 мкМ) при 4°С, вторая половина клеток служила контролем уровня аутофлуоресценции. Оставшиеся пять частей клеток помещали в среде McCoy's с 1% сывороткой в 24-луночный планшет и оставляли в CO2-инкубаторе в атмосфере 5% CO2 при 37°С на 2, 4, 8, 12, 24 и 72 ч. По истечении указанного временного периода клетки снимали с подложки раствором Версена, промывали холодным PBS, делили пополам, одну половину окрашивали белком DARPin-miniSOG, как описано выше, вторую оставляли неокрашенной и проводили измерение флуоресценции двух проб для каждого временного интервала.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Ранее в лаборатории С.М. Деева (ИБХ РАН) был создан адресный белок DARPin-miniSOG для селективного фотодинамического поражения раковых клеток человека. Адресная часть DARPin-miniSOG представлена белком неиммуноглобулиновой природы DARPin_9-29, обладающим высоким сродством к рецептору HER2 [6]. В отличие от часто используемого анти-HER2-мини-антитела 4D5scFv, которое взаимодействует с субдоменом IV внеклеточного домена HER2, DARPin_9-29 узнает субдомен I того же HER2 [12]. В качестве цитотоксического модуля в рекомби-нантном белке DARPin-miniSOG использован генно-инженерный флавопротеин miniSOG [10], способный под действием синего света генерировать активные формы кислорода. Возбуждение miniSOG синим светом приводит к эмиссии в зеленой области спектра (X, = 500 нм), что позволяет прямо детектировать связывание белка с клетками методом проточной ци-тофлуориметрии.
Созданный рекомбинантный адресный фототоксин DARPin-miniSOG проявляет фотоиндуцированную цитотоксичность на HER2-положительных клеточных линиях in vitro, вызывая некроз клеток, подвергнутых облучению.
Представлялось необходимым изучить особенности взаимодействия гибридного белка DARPin-miniSOG с опухолевыми клетками, сверх-экспрессирующими HER2, и оценить влияние ци-тотоксического модуля в составе гибридного белка на способность адресного домена DARPin_9-29 специфически связываться с рецептором HER2.
л
н .0
Ю О и
О
СП
н
и ш т
X
с
О
О О
•-о
CN
О О
о
CN
О О
о
Популяция живых одиночных клеток
Популяция живых одиночных клеток
1.85x104
0.86x104 fl
0.53x104 w 1.82x104
101 102 103 104 105 106 1072 Интенсивность флуоресценции в канале FL1
* SK-BR-3 без DARPin-miniSOG м SK-BR-3 + DARPin-miniSOG
* SK-BR-3 + DARPin-miniSOG + DARPin_9-29 e SK-BR-3 + DARPin-miniSOG + 4D5scFv
и т ы б о с
о в т с е ч и л о
nim'iimn'iiniifiiiiiii пищ пищ
102 103 104 105 106 1072 Интенсивность флуоресценции в канале FL1
■ CHO без DARPin-miniSOG
■ CHO + DARPin-miniSOG
Б
Рис. 1. Оценка способности белка DARPin-miniSOG специфически взаимодействовать с клетками аденокарци-номы молочной железы SK-BR-3, сверхэкспрессирующими рецептор HER2. Л - гистограмма распределения флуоресценции HER2-положительных клеток SK-BR-3, обработанных: белком DARPin-miniSOG (красная линия), DARPin-miniSOG в присутствии конкурентного полипептида DARPin_9-29 (зеленая линия), DARPin-miniSOG в присутствии неконкурентного мини-антитела 4D5scFv, специфичного к HER2 (синяя линия), и аутофлуоресценции неокрашенных клеток SK-BR-3 (черная линия). Рядом с пиками соответствующим цветом указано численное значение флуоресцентного сигнала в зеленом канале (Mean FL1-A). Б - гистограмма распределения флуоресценции HER2-отрицательных клеток CHO, обработанных белком DARPin-miniSOG (красная линия), и аутофлуоресценции неокрашенных клеток СНО (черная линия)
Для оценки специфичности взаимодействия DARPin_9-29 в составе гибридного белка с HER2 мы исследовали эффективность окрашивания клеток SK-BR-3, экспрессирующих рецептор HER2 в количестве ~106 молекул на клетку, гибридным флуоресцентным белком DARPm-mmiSOG с использованием метода конкурентного ингибирования. В качестве конкурирующего агента использовали свободный полипептид DARPin_9-29. Клетки SK-BR-3 инкубировали с белком DARPm-mmiSOG (500 нМ) или с эк-вимолярной смесью белка DARPm-mmiSOG (500 нМ) и конкурирующего агента DARPin_9-29 (500 нМ). Для оценки уровня флуоресценции клетки SK-BR-3 инкубировали с белком при температуре 4°С, что исключает возможность интернализации комплекса рецептор-белок.
Было показано, что средняя интенсивность флуоресценции клеток, обработанных белком DARPin-miniSOG, почти в 2 раза выше, чем интенсивность
флуоресценции клеток, обработанных смесью белков DARP_9-29 и DARPin-miniSOG (рис. 1А, красная и зеленая линии соответственно), т.е. полипептид DARPin_9-29 конкурирует с белком DARPin-miniSOG за связывание с клетками SK-BR-3. Отметим, что при использовании мини-антитела 4D5scFv, узнающего на поверхности HER2 эпитоп, отличный от эпитопа DARPin_9-29, снижения в значении флуоресценции не происходит (рис. 1А, синяя линия). HER2-отрицательные клетки СНО не дают флуоресцентного сигнала при инкубации с белком DARPin-miniSOG (рис. 1Б). Таким образом, установлено, что адресный гибридный белок DARPin-miniSOG высокоспецифично связывается с клетками аденокарциномы молочной железы, сверхэкспрес-сирующими рецептор HER2, а присутствие в его составе цитотоксического модуля miniSOG не влияет на специфичность адресного домена по отношению к HER2.
л
+ DARPin-miniSOG 12 ч, 37°С
8 ч, 37°С
4 ч, 37°С
ЪК-ВР-'у
+DARPin-miniSOG "70ч, 4°С
Анализ уровня флуоресценции клеток, повторно инкубированных с белком DARPin-miniSOG
20000 18000 -16000-
Ф
4 ч, 37°С
^ иле фл
14000 12000 10000
8 ч, 37°С
12 ч, 37°С
Ек-ВР-Я
Анализ уровня флуоресценции клеток без повторной инкубации с белком DARPin-miniSOG
5 Ц 8000
? т 6000
сив 4000
тен 2000
Г1 1
0 4 8
Время, ч
Популяция живых одиночных клеток
и т ы б о с
о в т с е ч и л о
SK-BR-3 без DARPin-miniSOG
SK-BR-3, инкубированные с DARPin-miniSOG при 37°С SK-BR-3, инкубированные с DARPin-miniSOG при 4°С
Интенсивность флуоресценции в канале FL1
Рис. 2. Взаимодействие белка DARPin-miniSOG с рецептором НЕР2 клеток SK-BR-3. Л - схема эксперимента. Б - гистограмма изменения во времени уровня флуоресценции НЕР2-положительных клеток SK-BR-3, обработанных адресным белком DARPin-miniSOG. Голубой столбец на гистограмме показывает уровень исходной аутофлуоресценции клеток SK-BR-3, темно-зеленый столбец - уровень флуоресценции клеток SK-BR-3, однократно обработанных белком DARPin-miniSOG при 4°С. Синие столбцы соответствуют уровню флуоресценции, сохранившемуся после обработки клеток белком DARPin-miniSOG при 4°С и последующей инкубации при 37°С в течение 4, 8 и 12 ч. Светло-зеленые столбцы соответствуют уровню флуоресценции клеток, обработанных белком DARPin-miniSOG при 4°С, проинкубированных при 37°С в течение 4, 8 и 12 ч и обработанных белком DARPin-miniSOG повторно при 4°С. Планки погрешностей на гистограмме показывают стандартное отклонение, посчитанное по результатам двух независимых экспериментов. В - изменение уровня флуоресценции клеток SK-BR-3 в зависимости от условий инкубации с белком DARPin-miniSOG
Б
0
В
Для установления механизмов воздействия адресного фототоксина DARPm-mmiSOG на опухолевую клетку необходимо было выяснить, что происходит с образовавшимся комплексом рецептор-белок после специфичного связывания DARPin-miniSOG с HER2-положительными клетками. Происходит ли интернализация HER2, и если да, то какова дальнейшая судьба HER2 после интернализации - рециркуляция или деградация в поздних лизосомах?
Способность рецептора HER2 к интернализации в настоящее время активно изучается. Процесс ли-ганд-индуцированной интернализации других рецепторов семейства эпидермального фактора роста (EGFR/HER1 и HER3) описан весьма детально: рецептор, активированный лигандом, подвергается быстрому рецептор-опосредованному эндоцитозу [13]. После интернализации возможна сортировка комплекса рецептор-лиганд в ранней эндосоме (бы-
страя рециркуляция) или в мультивезикулярных тельцах (медленный возврат). И в том и в другом случае рецептор снова экспонируется на мембране. Но возможен и третий путь: деградация комплекса рецептор-лиганд в лизосоме. Судьба рецептора определяется чувствительностью комплекса ре-цептор-лиганд к кислотной деградации на пути от эндосом к лизосомам. Менее стойкие комплексы диссоциируют раньше, и рецептор подвергается рециркуляции. Более устойчивые комплексы диссоциируют позже, и рецепторы в комплексе с лигандом деградируют в лизосомах [14].
В современной научной литературе существуют две диаметрально противоположных точки зрения на интернализацию рецептора HER2. В то время как одни исследования указывают на то, что HER2 не способен к эндоцитозу [15, 16], в других показано, что HER2 интернализуется, но снова экспонируется на клеточной мембране в результате быстрой эффективной рециркуляции из ранней эндосомы [17-19].
Хорошо известно, что HER2, в отличие от других членов семейства, не имеет природных лигандов, а его внутриклеточный домен лишен сигнала интер-нализации [20]. Следовательно, изучать эндоцитоз гомодимеров, индуцированный лиганд-рецепторным взаимодействием, невозможно. Есть данные, свидетельствующие о том, что экспрессия HER2 подавляет формирование клатриновых ямок на клеточной поверхности [16, 21]. Приведены доказательства того, что HER2 способен ингибировать лиганд-активиро-ванную интернализацию других рецепторов семейства эпидермального фактора роста при образовании гетеродимеров с ними [22]. На сегодняшний день доказано, что гуманизированное моноклональное антитело Трастузумаб (НегсерМп), широко применяемое в терапии HER2-положительных опухолей молочной железы, само по себе не способно приводить к интернализации HER2 [23], как предполагалось первоначально. Однако сочетанное использование Трастузумаба с другим, неконкурентным, антителом - Пертузумабом (Ре^е1а) или с антителом L26, которое, как и Пертузумаб, препятствует образованию гетеродимеров рецептора HER2 с другими членами семейства эпидермального фактора роста, приводит к эффективной интернализации HER2 и его деградации [24-26].
Есть данные, согласно которым не только полноразмерные антитела, но и мини-антитела формата scFv, специфичные к внеклеточному домену HER2, вызывают интернализацию рецептора HER2. Так, в работе [27] показано, что инкубация HER2-положительных клеток ВТ-474 с комплексом 4D5scFv-дибарназа, представляющим собой одноцепочечный вариабельный фрагмент мини-
антитела 4D5 к рецептору HER2/neu, соединенный с двумя молекулами барназы - цитотоксической РНКазы из Bacillus amyloliquefaciens, при 37°С приводит к полному удалению рецептора с поверхности клеток. При этом рецептор обнаруживается в эндо-сомах и мультивезикулярных тельцах [27]. Также возможность интернализации рецептора HER2 показана при его взаимодействии с гибридным белком DARPin-mCherry, узнающим внеклеточный домен HER2 [28].
В настоящей работе изучена интернализация рецептора HER2 при его связывании с белком DARPin-miniSOG.
Схема эксперимента представлена на рис. 2А. При этом сначала определяли уровень флуоресценции клеток, окрашенных белком DARPin-miniSOG при 4°С (условия, в которых интернализация не идет) (рис. 2Б, темно-зеленый столбец, время 0 ч), в сравнении с аутофлуоресценцией (рис. 2Б, голубой столбец, время 0 ч). Затем определяли уровень флуоресценции этих однократно окрашенных клеток через 4, 8 и 12 ч после инкубации при 37°С в СО2-инкубаторе (условия, в которых идет интернализация) без повторного окрашивания (рис. 2Б, синие столбцы, время 4, 8 и 12 ч соответственно) и после их повторной окраски на холоду белком DARPin-miniSOG (рис. 2Б, светло-зеленые столбцы, время 4, 8 и 12 ч соответственно). Отметим, что белок DARPin-miniSOG для этих опытов брали в количестве, избыточном по отношению к количеству рецептора на клетках.
Об интернализации комплекса HER2/DARPin-miniSOG свидетельствует резкое падение интенсивности флуоресценции клеток SK-BR-3, инкубированных с белком DARPin-miniSOG при 37°С, по сравнению с клетками, инкубированными с белком DARPin-miniSOG при 4°С: в течение 10 мин инкубации при 37°С происходит падение средней интенсивности флуоресценции более чем в 2 раза (рис. 2В). При этом показано, что средняя интенсивность флуоресценции клеток SK-BR-3, предварительно окрашенных белком DARPin-miniSOG при 4°С, после их инкубации при 37°С (в условиях интернализации) превышает исходный уровень средней интенсивности аутофлуоресценции в 1.4 раза через 4 ч, в 1.3 раза через 8 ч и снижается почти до исходного уровня ау-тофлуоресценции через 12 ч (рис. 2Б, синие столбики).
Способность клеток SK-BR-3 повторно окрашиваться белком DARPin-miniSOG при 4°С по сравнению с контрольными клетками SK-BR-3, однократно обработанными белком DARPin-miniSOG при 4°С (темно-зеленый столбик), через 4 ч снижается в 1.2 раза, а через 8 ч - в 1.4 раза (рис. 2Б, светло-зеленые столбики). Через 12 ч способность клеток SK-BR-3
Контроль 0
4 8 Время, ч
12
24
72
Рис. 3. Динамика окраски белком DARPin-miniSOG клеток SK-BR-3, обработанных папаином. В качестве контроля взяты клетки SK-BR-3, необработанные папаином: голубой столбец - уровень исходной аутофлуоресценции клеток SK-BR-3, светло-зеленый столбец - уровень флуоресценции клеток SK-BR-3, обработанных белком DARPin-miniSOG при 4°С. Синие столбцы каждой временной точки соответствуют уровню флуоресценции клеток SK-BR-3, обработанных папаином. Темно-зеленые столбцы соответствуют уровню флуоресценции клеток SK-BR-3, обработанных папаином в нулевой момент времени и окрашенных белком DARPin-miniSOG при 4°С через 2, 4, 8, 12, 24 и 72 ч. Планки погрешностей на гистограмме показывают стандартное отклонение
повторно окрашиваться белком DARPin-miniSOG при 4°С возвращается к первоначальному уровню.
Способность клеток повторно окрашиваться белком DARPin-miniSOG после инкубации при 37°С может обусловливаться распадом комплекса HER2/DARPin-miniSOG и возвратом рецептора HER2 на мембрану, а также быстрым биосинтезом новых молекул рецептора.
Для изучения вклада биосинтеза новых молекул рецептора была изучена динамика окрашивания белком DARPm-mmiSOG клеток SK-BR-3, с поверхности которых с помощью папаина удален внеклеточный домен HER2. Через 12 и 24 ч после удаления внеклеточного домена HER2 уровень флуоресценции клеток SK-BR-3, окрашенных DARPm-mmiSOG, со-
ставлял всего 43 и 57% от исходного соответственно и достигал первоначального уровня лишь через 72 ч (рис. 3). Таким образом, показано, что за 12 ч клетки SK-BR-3, лишенные рецептора HER2, не успевают полностью восстановить способность окрашиваться белком DARPm-mmiSOG, т.е. наработать рецептор HER2 в количестве, соответствующем клеткам SK-BR-3, не обработанным папаином (рис. 3).
Полученные данные свидетельствуют о том, что уровень рецептора HER2 на поверхности клеток SK-BR-3 аденокарциномы молочной железы не является неизменным: при связывании белка DARPin-miniSOG с рецептором HER2 происходит интерна-лизация комплекса HER2/DARPm-mmiSOG, число молекул рецептора на поверхности клетки при этом уменьшается и соответственно уменьшается флуоресценция клеток, повторно окрашенных белком DARPm-mmiSOG (рис. 2). Через ~12 ч среднее значение интенсивности флуоресценции повторно окрашенных клеток достигает исходного значения. Таким образом, на основании проведенных экспериментов и учитывая динамику биосинтеза HER2, следует сделать вывод, что после интернализации комплекса HER2/DARPin-miniSOG происходит его распад и медленный возврат рецептора HER2 на клеточную мембрану. При этом поступление вновь синтезированных молекул рецептора HER2 на мембрану клеток невелико и не вносит большого вклада в среднее значение интенсивности флуоресценции окрашенных клеток.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В настоящей работе выявлены закономерности специфического взаимодействия белка DARPin-miniSOG с рецептором HER2, получены данные, свидетельствующие об интернализации рецептора HER2 в комплексе с DARPin-miniSOG и последующем возврате рецептора на клеточную мембрану. Полученные данные важны для дальнейшей разработки методов терапии HER2-положительных опухолей на основе нового фотоцитотоксического белка DARPm-mmiSOG. •
Работа поддержана Российским научным фондом (грант № 14-24-00106).
2
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Деев С.М., Лебеденко Е.Н. // Acta Naturae. 2009. Т. 1. № 1. С. 32-50.
2. Deyev S.M., Lebedenko E.N. // BioEssays. 2008. V. 30. № 9. P. 904-918.
3. Boersma Y.L., Plückthun A. // Curr. Opin. Biotechnol. 2011. V. 22. № 6. P. 849-857.
4. Löfblom J., Frejd F.Y., Stähl S. // Curr. Opin. Biotechnol. 2011. V. 22. № 6. P. 843-848.
5. Деев С.М., Лебеденко Е.Н., Петровская Л.Е., Долгих Д.А., Габибов А.Г., Кирпичников М.П. // Успехи химии. 2015. Т. 84. Вып. 1. С. 1-26. (Deyev S.M., Lebedenko E.N., Petrovskaya L.E., Dolgikh D.A., Gabibov A.G. , Kirpichnikov M.P. // Rus. Chem. Rev. 2015. V. 84. № 1. P. 1-26.)
6. Steiner D., Forrer P., Plückthun A. // J. Mol. Biol. 2008. V. 382. № 5. P. 1211-1227.
7. Slamon D.J., Clark G.M., Wong S.G., Levin W.J., Ullrich A., McGuire W.L. // Science. 1987. V. 235. № 4785. P. 177-182.
8. Slamon D.J., Godolphin W., Jones L.A., Holt J.A., Wong S.G., Keith D.E., Levin W.J., Stuart S.G., Udove J., Ullrich A. // Science. 1989. V. 244. № 4905. P. 707-712.
9. Holbro T., Hynes N.E. // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2004. V. 44. P. 195-217.
10. Shu X., Lev-Ram V., Deerinck T.J., Qi Y., Ramko E.B., Davidson M.W., Jin Y., Ellisman M.H., Tsien R.Y. // PLoS Biol. 2011. V. 9. № 4. e1001041.
11. Mironova K.E., Proshkina G.M., Ryabova A.V., Stremovskiy O.A., Lukyanov S.A., Petrov R.V., Deyev S.M. // Theranostics. 2013. V. 3. № 11. P. 831-840.
12. Jost C., Schilling J., Tamaskovic R., Schwill M., Honegger A., Plückthun A. // Structure. 2013. V. 21. № 11. P. 1979-1991.
13. Sorkin A., Goh L.K. // Exp. Cell Res. 2009. V. 315. № 4. P. 683-696.
14. Sorkin A., Waters C.M. // BioEssays. 1993. V. 15. № 6. P. 375-382.
15. Hommelgaard A.M., Lerdrup M., van Deurs B. // Mol. Biol. Cell. 2004. V. 15. № 4. P. 1557-1567.
16. Haslekas C., Breen K., Pedersen K.W., Johannessen L.E., Stang E., Madshus I.H. // Mol. Biol. Cell. 2005. V. 16. № 12. P. 5832-5842.
17. Harari D., Yarden Y. // Oncogene. 2000. V. 19. № 53. P. 61026114.
18. Hendriks B.S., Opresko L.K., Wiley H.S., Lauffenburger D. // Cancer Res. 2003. V. 63. № 5. P. 1130-1137.
19. Austin C.D., de Maziere A.M., Pisacane P.I., van Dijk S.M., Eigenbrot C., Sliwkowski M.X., Klumperman J., Scheller R.H. // Mol. Biol. Cell. 2004. V. 15. № 12. P. 5268-5282.
20. Sorkin A., Di Fiore P.P., Carpenter G. // Oncogene. 1993. V. 8. № 11. P. 3021-3028.
21. Cortese K., Howes M.T., Lundmark R., Tagliatti E., Bagnato P., Petrelli A., Bono M., McMahon H.T., Parton R.G., Tacchetti C. // Mol. Biol. Cell. 2013. V. 24. № 2. P. 129-144.
22. Wang Z., Zhang L., Yeung T.K., Chen X. // Mol. Biol. Cell. 1999. V. 10. № 5. P. 1621-1636.
23. Longva K.E., Pedersen N.M., Haslekas C., Stang E., Madshus I.H. // Int. J. Cancer. 2005. V. 116. № 3. P. 359-367.
24. Ben-Kasus T., Schechter B., Lavi S., Yarden Y., Sela M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009. V. 106. № 9. P. 3294-3299.
25. Nahta R., Hung M.C., Esteva F.J. // Cancer Res. 2004. V. 64. № 7. P. 2343-2346.
26. Friedman L.M., Rinon A., Schechter B., Lyass L., Lavi S., Ba-cus S.S., Sela M., Yarden Y. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. № 6. P. 1915-1920.
27. Ivanova J.L., Edelweiss E.F., Leonova O.G., Balandin T.G., Popenko V.I., Deyev S.M. // Biochimie. 2012. V. 94. № 8.
P. 1833-1836.
28. Миронова К.Е., Черных О.Н., Рябова А.В., Стремовский О.А., Прошкина Г.М., Деев С.М. // Биохимия. 2014. T. 79. № 12. С. 1698-1704.
