CC BY
55
УДК 591.315:599.89
Варианты и вариабельность дробления эмбрионов человека
Ю. К. Доронин1*, И. В. Сенечкин2, Л. В. Хилькевич2, М. А. Курцер2
'Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 119234, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 12
2Перинатальный медицинский центр, отделение лечения бесплодия и ЭКО, 117209, Москва,
Севастопольский просп., 24, корп. 1
*E-mail: ljh_rjycn@mail.ru
Поступила в редакцию 08.09.2015
Принята к печати 25.04.2016
РЕФЕРАТ С целью выяснения природы вариабельности дробления проанализированы цейтраферные видеозаписи доимплантационного развития эмбрионов человека, аккумулированные в рамках стандартного протокола культивирования после процедуры внутриклеточной инъекции сперматозоида. Детально изучены топографические особенности и временные параметры дробления, определены продолжительности циклов и прослежена генеалогия бластомеров 2-8-клеточных эмбрионов человека. Обнаружено, что 4-клеточные эмбрионы распределяются в четыре группы в соответствии с ориентацией и последовательностью плоскостей второго дробления. Динамика развития эмбрионов с разными вариантами второго деления дробления существенно отличается как параметрами циклов дробления, так и продолжительностями циклов бластомеров. Анализ последовательностей делений бластомеров человека позволил предположить, что в итоге дробления элиминируются влияния зиготических детерминантов, после чего бластомеры приобретают способность к собственным синтезам и регуляциям, к поляризации и формированию функциональных контактов и, в конечном итоге, к собственным специфическим дифференциациям. Полученные с помощью неинвазивной методологии сведения о раннем развитии эмбрионов человека дополняют и расширяют представления о событиях эмбриогенеза плацентарных млекопитающих и могут найти применение в практике репродуктивных технологий.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА анализ цейтраферной видеозаписи, дробление, генеалогия бластомеров, эмбрионы человека.
ВВЕДЕНИЕ
Последние десятилетия в связи с бурным развитием и коммерциализацией технологий «вспоможения зачатию» (репродуктивных технологий) доимпланта-ционные зародыши человека стали предметом самого пристального внимания в буквальном смысле этих слов. Этические нормы и юридические ограничения позволяют использование только неинвазивных методов изучения концептусов, т.е. только микроскопические наблюдения. Итогом тщательных феноменологических исследований стала система оценок морфологии и темпов развития ранних эмбрионов человека in vitro, позволяющая с большей или меньшей степенью уверенности предсказывать появление имплантационно-компетентных («качественных») бластоцист [1, 2]. Внедрение в практику репродуктивной медицины инкубаторов, оснащенных устройством непрерывной видеорегистрации, существенно расширило возможности диагностики и прогнозирования качества эмбрионов [3-5]. В настоящее вре-
мя в архивах центров репродуктивной биологии человека накоплен огромный фактический материал, тщательный анализ которого может не только усовершенствовать прогностические возможности мор-фокинетического подхода к выявлению перспективных эмбрионов, но и углубить общие представления о раннем развитии плацентарных млекопитающих.
Первая (меридиональная) борозда дробления поляризованной зиготы плацентарных млекопитающих врезается на анимальном полюсе (в непосредственной близости к полярному тельцу) и распространяется от анимального к вегетативному полюсу [6-10]. Борозды дробления бластомеров 2-клеточных эмбрионов ортогональны первой борозде дробления и распространяются в плоскостях, приблизительно совпадающих с экваториальной и меридиональной плоскостями зиготы. Соответственно возможны четыре варианта дробления бластомеров 2-клеточных эмбрионов: оба бластомера делятся экваториально (Е) или меридионально (М) (варианты ЕЕ или ММ),
либо первое деление меридиональное, а второе - экваториальное (вариант ME) и наоборот (вариант ЕМ).
Перечисленные сочетания вторых делений дробления описаны у эмбрионов мышей, причем варианты 4-клеточных зародышей различаются «фенотипами». При МЕ- или ЕМ-делениях бластомеры формируют тетраэдрическую структуру (т.е. проецируются на вершины воображаемого тетраэдра). В результате ЕЕ- или ММ-делений бластомеры распределяются в виде «пластинки» или «розетки» [11, 12]. Согласно каноническим описаниям, 4-клеточный эмбрион человека в отличие от 4-клеточных эмбрионов мышей формируется в результате последовательных меридиональных и экваториальных делений бластомеров 2-клеточных эмбрионов и соответственно приобретает тетраэдрическую форму [6, 10, 13]. Между тем, существование принципиальных отличий, в том числе в способах формирования 4-клеточ-ных эмбрионов, на столь ранних (филогенетически древних) базисных этапах эмбриогенеза лабораторных млекопитающих и человека кажется маловероятным.
Возникновение вариантов 4-клеточных эмбрионов в результате вторых делений дробления представляется важным событием раннего онтогенеза. Различия в сегрегации ооплазмы сопряжены с различиями динамического паттерна последующего развития эмбрионов [14, 15], которое, вопреки этому, в норме завершается формированием однотипной финальной структуры, т.е. бластоцисты. Иными словами, этот феномен следует полагать одной из причин вариабельности последующего развития и соответственно наиболее ранним проявлением регуляционной способности эмбрионов млекопитающих.
В соответствии с представленными выше посылками целью этого исследования стал (1) детальный анализ топографических особенностей второго деления дробления культивируемых эмбрионов человека; и (2) анализ вариаций временных параметров последующих этапов дробления у эмбрионов, различающихся вариантами второго деления дробления. Сопоставление генеалогии бластомеров с последовательностью их делений позволило предположить роль дробления, предопределяющую нормальное развитие событий компактизации и кавитации эмбрионов.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалом исследования послужили цейтра-ферные видеорегистрации развития 101 эмбриона человека (микроскоп Primo Vision, помещенный в термостат Thermo; видеозахват через каждые 15 мин), полученные в рамках стандартного протокола культивирования от 20 анонимных пациенток в воз-
расте от 27 до 44 лет (в среднем 34.7 г). Ориентацию первых трех делений дробления относительно ани-мально-вегетативной оси зиготы и последовательные моменты делений зиготы и каждого бластомера вплоть до 16-клеточной стадии развития определяли, просматривая кадры цейтраферной съемки отдельных эмбрионов. Параллельно прослеживали генеалогию бластомеров. На основании этих реги-страций 4-клеточные эмбрионы классифицировали в соответствии с вариантами делений второго цикла дробления и рассчитывали продолжительности зи-готического периода (от оплодотворения до деления зиготы) и циклов дробления, т.е. разницы времен наступления третьего и первого делений бластомеров (второй цикл дробления), седьмого и третьего делений (третий цикл дробления) и 15-го и седьмого делений (четвертый цикл дробления). Определяли также продолжительности периодов, не сопровождающихся клеточными делениями (разницы времен наступления второго и первого, четвертого и третьего, восьмого и седьмого делений), и периодов клеточных делений (разницы времен третьего и второго, седьмого и четвертого, 15-го и восьмого делений) второго, третьего и четвертого циклов дробления (см. рис. 2). Эти же измерения позволили вычислить продолжительности циклов отдельных бластомеров как разницы моментов делений соответствующих материнских и дочерних бластомеров. На основании этих данных можно восстанавливать и сопоставлять генеалогию бластомеров до наступления 16-кле-точной стадии, используя в качестве маркировки бластомеров длительность их циклов. Результаты измерений анализировали и сравнивали с помощью непараметрических методов вариационной статистики с использованием пакетов программ Stadia (А.П. Кулаичев, МГУ им. М.В. Ломоносова) и Statistica v6 (StаtSoft). По истечении стандартного срока культивирования диагностировали стадии развития зародышей в соответствии с принятой классификацией [16, 17].
Уже в период первых делений дробления 33 эмбриона обнаружили разнообразные аномалии развития: чрезмерную фрагментацию, чрезвычайно короткие или длительные клеточные циклы (десятки минут или двое и более суток, вплоть до полного отсутствия цитотомии на протяжении всего периода наблюдений), слияния бластомеров вскоре после деления, гигантские внутриклеточные вакуоли и внеклеточные полости у 4-8-клеточных эмбрионов. Эти зародыши были исключены из рассмотрения, но в отдельных случаях поддающиеся определению параметры их первых циклов сопоставляли с соответствующими параметрами у эмбрионов, развивавшихся без органических нарушений.
Рис. 1. Становление универсальной тетраэдрической формы 4-клеточных эмбрионов в результате последовательных экваториальных (ЕЕ), меридиональных (ММ) и меридионального и экваториального (МЕ) делений во втором цикле дробления. Вариант экваториального и меридионального деления (не представлен) отличается от варианта МЕ только последовательностью делений. Время после внутриклеточной инъекции сперматозоида (ч:мин) указано в поле изображений. Звездочкой обозначено второе полярное тельце
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Взаимоотношения делящихся бластомеров
Варианты ЕЕ-, ММ-, МЕ- и ЕМ-делений бластомеров обнаружены у 10.3, 19.1, 27.9 и 42.6% 2-клеточных эмбрионов, развивавшихся без структурных аномалий ^ = 68). В случае МЕ- или ЕМ-делений в силу ортогональности плоскостей деления бластомеров 2-клеточного зародыша две пары сестринских клеток оказываются ориентированными почти взаимно перпендикулярно, а 4-клеточный эмбрион приобретает близкую к тетраэдру конфигурацию. Со временем геометрическая правильность такого тетраэдра совершенствуется за счет медленных перемещений сестринских пар бластомеров (рис. 1). В результате ЕЕ- или ММ-делений образуются своего рода «пла-
стинка» или «розетка» бластомеров. И в этих случаях сестринские пары бластомеров смещаются, ориентируясь взаимно перпендикулярно. В результате, «пластинка» или «розетка» также принимают форму тетраэдра (рис. 1). Таким образом, форма 4-клеточ-ных эмбрионов человека становится однотипной вне зависимости от ориентации предшествующих борозд дробления. Смещения клеточных пар, вероятнее всего, связаны с оптимизацией формы 4-клеточных зародышей в результате уравнивания механических напряжений, возникающих в ограниченном объеме зародыша после делений бластомеров. Ассоциация сестринских бластомеров, вероятно, связана с длительно сохраняющимися цитоплазматическими мостиками [8, 11, 18]. Длительный контакт между сестринскими бластомерами способствует появлению
клеточных кластеров - компактному размещению потомков бластомеров 2-, 4- и 8-клеточных зародышей, образование которых мы наблюдали при восстановлении генеалогии бластомеров.
Частоты встречаемости вариантов ЕЕ, ММ, МЕ и ЕМ у эмбрионов со структурными дефектами (30.3, 15.2, 24.2 и 30.3% соответственно; N = 33) не отличаются от частот у эмбрионов, развивавшихся без структурных аномалий (х2 = 6.471, Р = 0.091), но не соответствуют распределению, характерному для последних (х2 = 15.130, Р = 0.002). Это связано с тем, что доли ММ-, МЕ- и ЕМ-вариантов второго дробления в сравниваемых группах эмбрионов одинаковы (значения х2 для соответствующих альтернативных сравнений равны 0.17, 0.09, 0.65; Р = 0.682, 0.763 и 0.419 соответственно). Частота ЕЕ-вариантов деления у аномальных эмбрионов имеет явную тенденцию к превышению (почти втрое) частоты у нормальных эмбрионов (х2 = 4.30, Р = 0.038; с поправкой Йейтса Р = 0.072). Вероятно, следует полагать, что ЕЕ-эмбрионы склонны к органическим нарушениям развития в большей мере, чем эмбрионы с иными вариантами вторых делений дробления. Такая же тенденция отмечена у ЕЕ-эмбрионов мышей [19].
Циклы и траектории дробления
Варианты делений бластомеров во втором цикле дробления небезразличны для последующего развития. Для ЕЕ-эмбрионов характерна сглаженная «волнообразная» временная траектория развития. У ММ-, МЕ- и ЕМ-эмбрионов ярче выражена «ступенеобразная» траектория (рис. 2). Усредненные временные траектории (см. рис. 2) различаются между собой (парный критерий Вилкоксона; значимость различий (Р) между ЕЕ- и ММ-, ЕЕ- и ЕМ-, ММ- и МЕ-, ММ- и ЕМ-вариантами равны 0.001; значимость различий между ЕЕ- и ЕМ-вариантами - 0.002; между МЕ и ЕМ - 0.023).
Различия продолжительности циклов дробления становятся явными в третьем цикле дробления и усугубляются в 4-м. Наиболее продолжительны циклы у ЕЕ-, наименее - у ММ-эмбрионов. ЕМ-и МЕ-эмбрионы занимают промежуточное положение. Удлинение полных циклов дробления связано, главным образом, с удлинением периодов клеточных делений. Соответственно частота делений максимальна у ММ- и минимальна у ЕЕ-эмбрионов (табл. 1). ММ-эмбрионы достигают стадии 16 клеток через 80.5 ± 4.85 ч (среднее ± стандартное отклонение); ЕМ-эмбрионы - через 87.7 ± 9.47 ч, а МЕи ЕЕ-эмбрионы - через 94.8 ± 11.29 и 98.1 ± 5.05 ч (различия средних величин статистически значимы за исключением различий для ЕЕ- и МЕ-групп (Р = 0.197); критерий Ван-дер-Вардена).
Рис. 2. Траектории дробления отдельных эмбрионов, сгруппированные в соответствии с порядком и ориентацией плоскостей делений во втором цикле дробления (ЕЕ, ММ, МЕ и ЕМ). Зеленые, красные и желтые линии в МЕ и ЕМ группах - траектории эмбрионов с высоким (1), низким (2) и промежуточным (3) темпами дробления. Пунктирные линии - усредненные траектории дробления эмбрионов каждой из различающихся темпом развития групп. Сплошные линии с маркерами - усредненные траектории развития для каждого из вариантов 4-клеточных эмбрионов. Горизонтальная ось - число бластомеров в эмбрионе. Вертикальная ось - время после внутриклеточной инъекции сперматозоида, ч
Вариабельность траекторий развития у МЕи ЕМ-эмбрионов заметно выше, чем у ЕЕ- и ММ-эмбрионов (см. рис. 2; сравните соответствующие значения стандартных отклонений, представленные в табл. 1). МЕ- и ЕМ-эмбрионы можно распределить на три группы в соответствии со сходством траекторий. Усредненные траектории развития как МЕ-, так и ЕМ-эмбрионов из разных групп значимо различаются между собой (Р = 0.0007 для всех вариантов сравнений, парный критерий Вилкоксона). Эмбрионы второй группы отличаются большей продолжительностью циклов. Циклы дробления у эмбрионов третьих групп могут быть сравнимыми или превышать по продолжительности соответствующие циклы эмбрионов из первых групп, а в отдельных случаях - циклы эмбрионов из вторых групп (см. детали в табл. 2).
МЕ-эмбрионы первой, второй и третьей групп достигают 16-клеточной стадии развития через 85.1 ± 4.28 (среднее значение ± стандартное отклонение), 110.5 ± 6.10 и 94.6 ± 2.57 ч; ЕМ-эмбрионы - через
Таблица 1. Временные параметры циклов дробления (среднее значение и стандартное отклонение, ч) эмбрионов с различными вариантами последовательных делений бластомеров 2-клеточных зародышей
ЕЕ ММ МЕ ЕМ
Численность и проспективные стадии развития зародышей В5(2), В4(1), В3(1), В1(3) В5(7), В4(3), В3(2), В1(1) В5(3), В4(5), В3(2), В2(2), В1(5), М(2) В5(8), В4(6), В3(5), В2(4), В1(5), М(1)
Зиготический период 28.6 ± 2.701 26.7 ± 1.441 28.2 ± 3.96 28.5 ± 3.61
Полная продолжительность циклов цикл 2 13.1 ± 2.52 12.1 ± 1.05 12.4 ± 1.22 12.8 ± 1.85
цикл 3 24.4 ± 5.722'3'4 17.4 ± 3.332 18.1 ± 5.583 19.4 ± 4.964
цикл 4 32.1 ± 8.675,6 24.3 ± 3.065' 7' 8 36.0 ± 8.127' 9 26.9 ± 4.576' 8' 9
Период без делений цикл 2 11.9 ± 1.33 11. 6 ± 1.12 11.5 ± 1.16 11.9 ± 1.48
цикл 3 14.3 ± 2.81 14.1 ± 2.78 13.2 ± 1.88 14.3 ± 3.72
цикл 4 12.1 ± 3.3610'11 17.5 ± 4.0510 16.8 ± 7.04 17.3 ± 4.6711
Период делений бластомеров цикл 2 1.1 ± 1.60 0.5 ± 0.3112'13 0.9 ± 0.5512 1.0 ± 0.8913
цикл 3 10.0 ± 4.57й'15'16 3.3 ± 2.0814'17 4.9 ± 5.0715 5.1 ± 2.9916'17
цикл 4 20.0 ± 6.8718'19 6.8 ± 2.4718'20 19.2 ± 5.9320'21 9.6 ± 5.2919'21
Среднее время между последовательными делениями клеток цикл 2 0.6 ± 0.80 0.2 ± 0.15 0.4 ± 0.28 0.5 ± 0.45
цикл 3 2.5 ± 1.14 0.8 ± 0.52 1.2 ± 1.27 1.3 ± 0.75
цикл 4 2.5 ± 0.86 0.9 ± 0.31 2.4 ± 0.74 1.2 ± 0.66
Примечание. Одинаковыми надстрочными цифрами указаны статистически значимые различия средних значений (критерий Ван-дер-Вардена, Р < 0.05).
*В - стадия бластоцисты; М - стадия морулы; цифрами указаны градации эмбрионов на стадии бластоцисты; в скобках указана численность эмбрионов, достигших указанной стадии.
"Средние значения различаются между собой так же, как средние значения продолжительностей периодов делений бластомеров.
74.9 ± 3.10, 102.1 ± 5.20 и 88.8 ± 3.05 ч соответственно. Различия этих показателей статистически значимы (критерий Ван-дер-Вардена, Р = 0.001, 0.024 и 0.001). В то же время усредненные траектории развития МЕ- и ЕМ-эмбрионов первой, второй и третьей групп не различаются (парный критерий Вилкоксона; Р = 0.256, 0.158 и 0.112 соответственно).
К завершению срока регистрации МЕ- и ЕМ-эмбрионы из разных групп достигли разных стадий развития (табл. 2). Первые группы объединяют эмбрионы, сформировавшие развитые бластоцисты (градации 4 и 5). Вторые группы включают медленно развивавшиеся эмбрионы, которые достигли стадии морулы или начинающей кавитировать бластоцисты. Третьи группы разнородны, поскольку к концу наблюдений составляющие их эмбрионы имеют весь спектр бластоцист, хотя большую часть составляют бластоцисты градаций 2 и 3 (табл. 2). Сопоставление альтернативных распределений (численности эмбрионов, достигших градаций 5 и 4, с численностью более ранних эмбрионов в конце срока регистраций) показывает явное доминирование как МЕ-, так и ЕМ-эмбрионов в группе 1 и соответственно доминирова-
ние отстающих в развитии зародышей в группе 2 (двусторонний точный критерий Фишера, Р = 0.021 и 0.001). Такое же сопоставление групп 1 и 3 показало значимое различие альтернативных распределений у ЕМ-эмбрионов (Р = 0.019), но сходство у МЕ-эмбрионов (Р = 0.277).
Срок развития ММ-эмбрионов до 16-клеточной стадии занимает промежуточное положение между показателями для МЕ- и ЕМ-эмбрионов из первых групп, значимо короче первого показателя (критерий Ван-дер-Вардена, Р = 0.017), но длиннее второго (Р = 0.001). Усредненная траектория дробления ММ-эмбрионов отличается от траектории у МЕи ЕМ-эмбрионов из первых групп (парный критерий Вилкоксона, Р = 0.001 и 0.000 соответственно). Альтернативное распределение (продвинутые против отстающих в развитии) в группе ММ не отличается от аналогичных распределений в первых группах МЕ- и ЕМ-эмбрионов (точный критерий Фишера, Р = 0.590 и 0.148), но отличается от распределений во вторых группах (Р = 0.015 для обоих сравнений).
Усредненные параметры дробления (и соответственно траектории развития в период дробления)
Таблица 2. Временные параметры циклов дробления (среднее значение, стандартное отклонение, ч) МЕ- и ЕМ-эмбрионов с различными темпами развития (группы 1, 2 и 3)
МЕ ЕМ
Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 1 Группа 2 Группа 3
Численность и проспективные стадии развития зародышей В5(2), В4(4), В3(1), В1(1) В2(2), В1(2), М(1) В5(1), В4(1), В3(1), В1(2), М(1) В5(5), В4(2) В1(4), М(1) В5(3), В4(4), В3(5), В2(4), В1(1)
Зиготический период 25.5 ± 2.0112 33.3 ± 3.2913 27.7 ± 2.012,3 25.1±2.191,2 32.9 ± 3.601,3 28.7 ± 2.532,3
Полная продолжительность цикла цикл 2 11.3 ± 0.6245 13.3 ± 0.944 13.1 ± 0.875 11.7±1.254 15.0 ± 0.6345 12.7 ± 1.815
цикл 3 15.3 ± 3.288 18.4 ± 1.21 21.7 ± 8.228 16.3±1.948 25.7 ± 6.0889 18.8 ± 3.949
цикл 4 33.0 ± 3.6811 45.5 ± 6.49111 32.1 ± 7.9112 21.9 ± 3.1113,14 28.5 ± 4.5013 28.5 ± 3.6214
Период без делений цикл 2 10.5 ± 0.976,7 12.4 ± 0.516 12.2 ± 0.647 10.8 ± 0.416 14.2 ± 0.5667 11.6 ± 1.217
цикл 3 11.9 ± 0.8791° 14.6 ± 2.519 13.9 ± 1.0810 12.3 ± 1.4910 19.6 ± 4.9910,11 13.6 ± 2.4711
цикл 4 15.6 ±4.29 21.3 ± 9.22 14.8 ± 7.57 15.6 ± 1.74 15.1 ± 6.65 18.6 ± 4.65
Период делений бластомеров цикл 2 0.8 ± 0.60 0.9 ± 0.57 0.93 ± 0.56 0.9 ± 1.01 0.76 ± 0.25 1.08 ± 0.98
цикл 3 3.4 ± 2.89 3.9 ± 2.18 7.75 ± 7.92 4.0 ± 1.4112 6.08 ± 2.1612 5.21 ± 3.59
цикл 4 17.5 ± 2.81 24.2 ± 9.63 17.3 ± 2.66 6.2 ± 2.9815 13.4 ± 6.0015 9.95 ± 5.19
Обозначения те же, что и в табл. 1.
Таблица 3. Продолжительности и сопоставления циклов бластомеров у эмбрионов с различными вариантами второго деления дробления
Бластомеры Средние значения ± стандартное отклонение
ЕЕ (Ы = 7) ММ (Ы = 13) МЕ (Ы = 19) ЕМ (Ы = 29)
1 11.9 ± 1.29° 11.6 ±1.13° 11.7 ± 1.09° 11.9 ± 1.46°
2 13.1 ± 2.51° 12.0 ± 1.09° 12.5 ± 1.21° 12.9 ± 1.83°
1:1 17.6 ± 6.20ъ 14.9 ± 2.76ъ,с 14.6 ± 2.16ь,° 15.5 ± 4.01Ъл<!
1:2 21.1 ± 6.151,®,ь 16.6 ± 3.206,ъ 15.5 ± 2.581АМ 18.2 ± 5.349Ае
2:1 17.7 ± 2.86 2,7,° 15.0 ± 3.4674 14.2 ± 2.442Л°Ае 16.3 ± 3.60™",'
2:2 24.4 ± 9.303А8,С 16.2 ± 3.475Ас4 17.9 ± 5.663,°,е 18.6 ± 4.334,54-
1:1:1 23.6 ± 5.00^ 21.8 ± 3.6415,е- 25.3 ± 6.9— 24.4 ± 5.1515,д,^,к,!
1:1:2 29.7 ± 10.71й 23.8 ± 3.9912,16«Ак 32.4 ± 9.71 28.0 ± 5.8916,д,т,",Р,?
1:2:1 22.4 ± 5.36^ 21.5 ± 4.13д,!,™," 23.0 ± 6.87 24.3 ± 5.32т,г,'
1:2:2 32.2 ± 12.502°,',д 22.7 ± 3.6717,2°'' 28.1 ± 9.74т 27.1 ± 5.5517,к,г,'и
2:1:1 25.4 ± 9.17л 21.4 ± 3.81318,нр 26.0 ± 7.8813,к,' 24.5 ± 4.4318,",(да
2:1:2 33.8 ± 11.382122^,к 24.3 ± 3.67 19,21-т,р,ч 30.3 ± 10.76 д,",?,г 27.6 ± 4.7819,22,к,з,и,у,г
2:2:1 20.2 ± 3.77к,1 21.2 ± 3.26 к,',г 22.8 ± 6.30'« 21.7 ± 5.94',?,",^
2:2:2 26.5 ± 10.22' 23.8 ± 3.33",",г 28.7 ± 6.3414,р,* 25.7 ± 5.01',г
Примечание. Одинаковые надстрочные буквы указывают на статистически значимые различия (Р < 0.05, парный критерий Вилкоксона) длительностей циклов бластомеров у эмбрионов каждой из групп (различия значений в столбцах). Одинаковые надстрочные цифры указывают на статистически значимые различия (Р < 0.05, критерий Ван-дер-Вардена) длительностей соответствующих циклов у эмбрионов из разных групп (различия значений по строкам).
ЕЕ
мл 1U3
Л I t Л4
1;Ш
ММ
ME
EM
-9
2-11-.1-Л
Рис. 3. Генеалогия бластомеров ЕЕ-, ММ-, МЕ- и ЕМ-эмбрионов. Вертикальная ось - время от момента внутриклеточной инъекции спермия, ч. Последовательность цифр отражает порядок появления бластомеров: меньшая цифра кодирует бластомеры с менее продолжительным циклом. Вертикальные линии соответствуют средним значениям продолжительностей циклов бластомеров. Z - зигота
МЕ- и ЕМ-эмбрионов первых групп, так же как ММ-эмбрионов (т.е., в совокупности, параметры быстро дробящихся зародышей), хорошо соответствуют прогностическим критериям успешно развивающихся зародышей (см. табл. 1 и 2).
Генеалогия и циклы бластомеров
Продолжительности циклов бластомеров у 4-и 8-клеточных эмбрионов с разными вариантами второго деления дробления, в целом, различны (критерий Крускала-Уоллиса, P < 0.000 в обоих случаях). Наиболее короткие циклы свойственны ММ-эмбрионам, наиболее длительные - ЕЕ-эмбрионам. Промежуточное положение занимают МЕ- и ЕМ-
80
60
40
20
80
60
40
20
0 100
80
60
40
20
0
4 5 6 7
8 9 10
2 13 14 15
Рис. 4. Распределения моментов делений бластомеров 4- (левые диаграммы) и 8-клеточных (правые диаграммы) ММ-, МЕ-, ЕМ-эмбрионов. Горизонтальные оси -последовательные деления дробления. Отличающиеся цветом столбцы - частоты делений отдельных бласто-меров в % от совокупной частоты делений в каждом из последовательных делений (вертикальные оси). Цветовой код различающихся происхождением бла-стомер представлен в поле правого верхнего рисунка
эмбрионы, у которых циклы соответствующих бластомеров (особенно на 8-клеточной стадии) достаточно близки между собой (см. табл. 3). Циклы бластомеров первых групп МЕ- и ЕМ-эмбрионов короче, чем соответствующие циклы у эмбрионов из вторых и третьих групп (значения продолжитель-ностей циклов и их статистические сравнения представлены в табл. 4).
В силу генеалогической иерархии время деления того или иного бластомера складывается из продол-
0
Таблица 4. Продолжительности циклов бластомеров (средние значения, стандартное отклонение, ч) и их сопоставления у МЕ- и ЕМ-эмбрионов с различными темпами развития (группы 1, 2 и 3)
Бластомеры МЕ ЕМ
Группа 1 (Ы = 8) Группа 2 (Ы = 5) Группа 3 (Ы = 6) Группа 1 (Ы = 7) Группа 2 (Ы = 5) Группа 3 (Ы = 17)
1 11.0 ± 1.211,г,° 12.4 ±0.511а 12.2 ± 0.59 г,° 10.9 ±0.461а 14.2 ± 0.591,г,° 11.7 ± 1.15г,°
2 11.7 ± 1.1134а 13.3 ± 0.943,0 13.1 ± 0.854,0 11.9 ± 1.333-а 15.0 ± 0.663-4-а 12.7 ± 1.804,0
1:1 13.1 ± 2.105Аъ 16.5 ± 1.775 15.1 ± 0,818ъ 13.2 ± 1.905-9-ъ-с 21.0 ± 6.445-10-ъ 14.9 ± 2.06Ь9-10-ъ-с
1:2 13.8 ± 2.436Аъ-с 17.5 ± 2.476 16.1 ± 1.259-ъ 15.2 ± 2.146-ъ 25.6 ± 6.956-11-ъ 17.3 ± 3.7611-ъ
2:1 12.4 ± 0.927-10-с4 15.5 ± 2.797 15.5 ± 2.2410-с 14.2 ± 1.407й 20.9 ± 4.437-1г-с 15.8 ± 2.851г4
2:2 14.9 ± 3.131311-а 18.2 ± 1.53 21.7 ± 8.2411>с 15.8 ± 2.068-с4 23.0 ± 4.898-13-с 18.4 ± 3.9613-с4
1:1:1 20.0 ± 4.0612'17'е'1'9 31.9 ± 5.951гъ,с,л 26.9 ± 5.45174 20.4 ± 1.8314-г1-е 24.3 ± 5.07^ 26.0 ± 5.4014-г1е-/
1:1:2 27.3 ± 6.7813,'-н,к 42.9 ± 9.1513г0ъ^ 30.5 ± 7.15г0Ае-/ 23.1 ± 3.0715'гг^д 31.1 ± 6.1815А/ 29.2 ± 5.72вгг-я,н
1:2:1 20.1 ± 2.98« 27.2 ± 11.5е-9-к 23.5 ± 4.37е« 19.9 ± 2.7916>г3Ак 25.1 ± 3.3716-д 25.9 ± 5.69гз-д-к-1
1:2:2 25.8 ± 7.43-"-™ 32.9 ± 14.7/>9 27.1 ± 7.63д 21.5 ± 3.1617,г4,н'1 28.3 ± 4.6817-9 29 0 ± 5 14^4-е'к,т,п,р
2:1:1 19.9 ± 2.6214'18'к'п'р'4 34.9 ± 7.1814-г1-к 26.7 ± 5.7018-г1Ак 20.6 ± 3.1918,г5,/,т 26.8 ± 5.9718Ак 25.4 ± 3.54г5'т'4
2:1:2 21.9 ± 3.5615-19-п-Г 42.9 ± 9.9915-гг-с-к-к-1 30.9 ± 6.8919-ггл! 22.4 ± 2.9819-гб-к-т-п 28.8 ± 6.3119А1 29.4 ± 3.34гблм,г»
2:2:1 23.2 ± 5.00?-» 27.8 ± 5.17гзА/А™ 18.2 ± 6.02гзлк-!т 19.0 ± 2.20г7-9'1'п'Р 19.4 ± 10.43/-к-1-т 23.6 ± 4.89г7,л"п,Г"'
2:2:2 27.3 ± 5.3016-д'™'4г'» 34.8 ± 4.6716-г4-т 25.7 ± 6.02г4-т 21.2 ± 2.92г0,г8,р 28.0 ± 6.86ег0-е-т 26.8 ± 4.18 г8-Р'»'(
Обозначения те же, что и в табл. 3.
жительности цикла делящегося бластомера и про-должительностей циклов предшествующих ему бластомеров. Неравенство циклов сестринских бластомеров (рис. 3) является событием, «структурирующим» периоды делений бластомеров в каждом цикле дробления и траектории дробления в целом.
Замена временных параметров траектории дробления последовательностью (порядком) делений бластомеров (опосредующих сроки существования линий бластомеров, см. рис. 3) позволяет выявить вариабельность циклов отдельных бластомеров в составе различных эмбрионов. Распределения, связывающие частоты делений сходных по происхождению бластомеров с последовательностью их деления в третьем и четвертом циклах траекторий дробления, значимо отличаются от соответствующих равновероятных как для 4-клеточных ЕЕ-, ММ-, МЕ- и ЕМ-эмбрионов (х2 равны: 20.0, 40.3, 84.0 и 93.1 соответственно; пороговое значение х2 (Р < 0.05) равно 16.9), так и для 8-клеточных ММ-, МЕ- и ЕМ-эмбрионов (X2 равны: 79.4, 98.9 и 133.8 соответственно; пороговое значение х2 равно 66.3). Распределение для 8-клеточ-ных ЕЕ-эмбрионов не отличается от равновероятного (X2 = 56.0, Р > 0.250), что связано с малочисленностью выборки таких эмбрионов.
У 4-клеточных МЕ-эмбрионов бластомер 1 : 1 делится раньше остальных в 78.9% случаев (х2 = 31.7, Р < 0.000), а бластомер 2 : 2 - в 84.2% (х2 = 40.6, Р < 0.000). Бластомеры 1 : 1 : 1, 2 : 2 : 2 и 1 : 2 : 2 значимо чаще делятся восьмыми, 15-ми и 14-ми (36.8,
42.1 и 36.8%; х2 = 12.6, 26.1 и 15.1; Р < 0.050, < 0.001 и 0.050 соответственно). Бластомеры 1 : 1 и 2 : 2 у 72.4 и 65.5% ЕМ-эмбрионов делятся четвертыми и седьмыми (х2 = 40.6 и 34.6, Р < 0.000); бластомер 1 : 1 :
1 - восьмым и девятым (в 34.5% случаев, х2 = 36.9 и 22.0, Р < 0.000 и < 0.005), бластомеры 1 : 1 : 2 и 2 : 2 :
2 - 14-ми и 15-ми (в 31.0 и 34.5%, х2 = 35.8, Р < 0.000) (см. рис. 4). У ММ-эмбрионов первыми и последними делятся бластомеры 1 : 1 и 2 : 2 (69.2%, х2 = 16.8, Р < 0.025) и бластомеры 2 : 2 : 1 и 2 : 2 : 2 (в 38.5% случаях, х2 = 15.9 и 18.4, Р < 0.050 и < 0.025 соответственно).
Таким образом, на протяжении третьего и четвертого циклов дробления в составе эмбрионов появляются и возрастают в численности бластомеры, у которых, вопреки сходству происхождения, существенно различны последовательности делений (т.е. сроки существования линий бластомеров до моментов их делений). У подавляющего большинства 4-клеточных эмбрионов два бластомера преемственно делятся первыми и последними, в то время как последовательности делений двух других бластомеров переменны. У 8-клеточных эмбрионов вероятность преемственного раннего или позднего делений бла-стомеров снижается, но увеличивается количество бластомеров, момент деления которых варьирует у разных эмбрионов. Если такая тенденция продолжается в пятом и шестом циклах дробления, то последовательность делений всех бластомеров - 16-и 32-клеточных - станет стохастичной. Поскольку
эмбрионы раньше или позже, но достигли финальной стадии развития (бластоцисты), можно полагать, что обсуждаемый феномен представляет собой одно из проявлений регуляционности бластомеров и зародышей в целом, возрастающей по мере дробления. Возрастание регуляционности, по определению, предполагает расширение спектра потенциальных дифференцировок. Соответственно можно ожидать расширение потенциальных возможностей к диф-ференцировкам у бластомеров 8-клеточных и, тем более, 16- и 32-клеточных эмбрионов.
Традиционно считается, что ооцит и зигота тоти-потенты. Однако по цитологическим критериям ооцит и зигота, наследующая структуру ооцита, представляют собой высокоспециализированные клетки. Помимо характерной морфологии и специфических синтезов, специализация зиготы проявляется в поляризованности, обеспеченной неравномерным распределением в объеме (и по протяженности кортикального слоя) клеточных органелл и комплекса специфических регуляторных макромолекул [18-20 и др.]. Мы предполагаем, что только после элиминации специфических особенностей организации зиготы и освобождения от влияний зиготических детерминантов бластомеры приобретают способность к собственным синтезам и регуляциям, к поляризации и формированию функциональных контактов и, в конечном итоге, к собственным специфическим дифференциациям [21-23]. На молекулярно-генети-ческом уровне события, освобождающие бластомеры от «диктата зиготы» в период первых делений дробления, исследованы слабо и, вероятнее всего, сопряжены с регуляциями клеточных циклов [24, 25].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
У плацентарных млекопитающих, в отличие от низших позвоночных, поляризованность («предразмет-ка») зиготы достаточно лабильна, что предопределяет вариабельность временных параметров раннего развития и при несовершенстве или недостаточности этой предразметки - довольно высокий уровень аномалий раннего развития. В результате реализации всех возможных комбинаций меридиональных и экваториальных борозд при дроблении 2-клеточных эмбрионов человека (так же как эмбрионов мышей и, вероятно, иных видов плацентарных млекопитающих) формируются четыре варианта 4-клеточных
эмбрионов. Бластомеры эмбрионов, относящихся к разным вариантам, включают в свой состав существенно разные части зиготы, приобретая таким образом разные «дозы» детерминантов. Сегрегация зиготической цитоплазмы и детерминантов продолжается в следующих делениях дробления. Это, в свою очередь, находит отражение в существенной вариабельности временных параметров (циклов бла-стомеров, циклов дробления и траектории дробления в целом) в следующих раундах дробления каждого из вариантов 4-клеточных эмбрионов. Вариабельность, связанная со степенью «совершенства» организации зиготы, интерферирует с вариабельностью, привносимой способом ее сегрегации, что проявляется в траекториях дробления. Примером могут служить траектории развития МЕ- и ЕМ-эмбрионов с существенно разными темпами дробления (первая, вторая и третья группы). По предварительной оценке частоты формирования имплантационно-компетент-ных бластоцист, восходящих к каждому из вариантов 4-клеточных эмбрионов, различаются. Из этого следует, что вариант формирования 4-клеточных эмбрионов следует учитывать при раннем прогнозе перспективности отдельных зародышей.
Замена временных показателей на порядковые (последовательности делений бластомеров в траектории дробления или, иными словами, опосредованные сроки существования линий бластомеров) позволила обнаружить еще одну форму вариабельности, связанную с особенностями собственно процесса дробления: изменчивость моментов вступления в следующий цикл дробления сходных по происхождению бластомеров в составе разных эмбрионов. Мы предполагаем, что это явление связано с градуальным снижением эффектов детерминантов в результате последовательной элиминации специфической организации зиготы в ее фрагментах (т.е. бластомерах). Достигаемая таким образом дедифференциация бла-стомеров предшествует и, возможно, разрешает осуществление их собственной экспрессии, регуляции и, в конечном итоге, собственных дифференцировок. В большей или меньшей мере успешная дедиффе-ренциация бластомеров предопределяет большее или меньшее временное смещение событий асимметричных делений и компактизации, что, возможно, сказывается на соотношениях внутренней клеточной массы и муральной трофэктодермы в бластоцистах. •
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Human preimplantation embryo selection. Reproductive medicine and assisted reproductive techniques / Eds K. Elder, J. Cohen. Informa Helthcare, 2007. 379 p.
2. van den Bergh M., Ebner T., Elder K. Atlas of oocytes, zygotes
and embryos in reproductive medicine. N.Y.: Cambridge University Press, 2012. 237 p. 3. Pribenszky C., Losonczi E., Molnar M., Lang Z., Matyas S., Rajczy K., Molnar K., Kovacs P., Nagy P., Conceicao J., et al. // Reprod. BioMed. Online. 2010. V. 20. P. 371-379.
4. Kirkegaard K., Agerholm I.E., Ingerslev H.J. // Hum. Reprod. 2012. V. 27. № 5. P. 1277-1285.
5. Herrero J., Meseguer M. // Fertil. Steril. 2013. V. 99. P. 10301034.
6. Gulyas B.J. // J. Exp. Zool. 1975. V. 193. P. 235-248.
7. Graham C.F., Deussen Z.A. // J. Embryol. Exp. Morph. 1978. V. 48. P. 53-72.
8. Gardner R.L. // Development. 1997. V. 124. P. 289-301.
9. Cooke S., Tyler J.P.P., Driscoll G.L. // Hum. Reprod. 2003. V. 18. P. 2397-2405.
10. Edwards R.G., Hansis C. // Reprod. BioMed. Online. 2005. V. 11. № 2. P. 206-218.
11. Gardner R.L. // Hum. Reprod. 2002. V. 17. № 12. P. 3178-3189.
12. Piotrowska-Nitsche K., Zernicka-Goetz M. // Mech. Dev. 2005. V. 122. P. 487-500.
13. Edwards R.G. // Reprod. BioMed. Online. 2003. V. 6. № 1. P. 97-113
14. Edwards R.G., Beard H.K. // Mol. Hum. Reprod. 1997. V. 3. № 10. P. 863-905.
15. Zernicka-Goetz M., Morris S.A., Bruce A.W. // Nat. Rev. Genet. 2009. V. 10. P. 467-477.
16. Gardner D.K., Schoolcraft W.B. // Towards reproductive certainty: Fertility and genetics beyond 1999 / Eds R. Jansen, D. Mortimer. Carnforth: Parthenon Publ., 1999. P. 378-388.
17. Gardner D.K., Stevens J., Sheehan C.B., Schoolcraft W.B. // Human preimplantation embryo selection: Reproductive medicine & assisted reproductive techniques series / Eds K. Elder, J. Cohen. Informa Healthcare, Informa UK Ltd., 2007. P. 79-87.
18. Goodall H., Johnson M.H. // J. Embryol. Exp. Morph. 1984. V. 79. P. 53-76.
19. Bischoff M., Parfitt D.-E., Zernicka-Goetz M. // Development. 2008. V. 135. P. 953-962.
20. Kloc M., Ghobrial R.M., Borsuk E., Kubiak J.Z. // Mouse development - from oocyte to stem cells / Ed. J.Z. Kubiak. Berlin, Haidelberg: Springer-Verlag, 2012. P. 23-44.
21. Marikawa Y., Alarcon V.B. // Mol. Reprod. Dev. 2009. V. 76. № 11. P. 1019-1032.
22. Zhang P., Zucchelli M., Bruce S., Hambiliki F., Stavreus-Evers A., Levkov L., Skottman H., Kerkelä E., Kere J., Hovatta O. // PLoS One. 2009. V. 4. № 11. e7844.
23. Cockburn K., Rossant J. // J. Clin. Invest. 2010. V. 120. № 4. P. 995-1003.
24. Kiessling A.A., Bletsa R., Desmarais B., Mara C., Kallianidis K., Loutradis D. // J. Assist. Reprod. Genet. 2010. V. 27. № 6.
P. 265-276.
25. Duronio R.J. // Genes Dev. 2012. V. 26. P. 746-750.
