CC BY
16УДК 616-009.863-056.7-07
ВАЛИДАЦИЯ НЕОБХОДИМОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ КОМПЛЕКСНОГО ПОДХОДА ПРИ ДИАГНОСТИКЕ НАСЛЕДСТВЕННОГО АНГИООТЁКА
ГУРЬЯНОВА ИРИНА ЕВГЕНЬЕВНА
к.б.н., заведующий лабораторией, Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии, Минск, Республика Беларусь
ЖАРАНКОВА ЮЛИЯ СЕРГЕЕВНА
врач-детский онколог-гематолог, врач-детский аллерголог-иммунолог, Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии, Минск, Республика Беларусь
КАЗАК ВИКТОРИЯ ИГОРЕВНА
младший научный сотрудник, Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии, Минск, Республика Беларусь
БЕЛЕВЦЕВ МИХАИЛ ВЛАДИМИРОВИЧ
к.б.н., доцент, заместитель директора по научной работе, Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии, Минск, Республика
Беларусь
Аннотация. Наследственный ангиоотёк (НАО) - редкое и угрожающее жизни пациентов заболевание, которое возникает в среднем у одного из 30 000 человек. Патофизиологическая основа НАО - это прежде всего сосудистая реакция на чрезмерный местный синтез брадикинина. Симптомы НАО включают отёки различных частей тела, в том числе отёки лица, рук, ног, брюшной полости и гортани. У пациентов с НАО часто встречаются острые абдоминальные боли, имитирующие клиническую картину «острого живота», ввиду чего могут проводиться ненужные оперативные вмешательства. Наиболее опасными являются отёки верхних дыхательных путей, которые могут привести к удушью и смерти, если вовремя не применить адекватную терапию. Приступы НАО могут маскироваться под ангиоотёки, возникшие по причине аллергических реакций, аутоиммунных и лимфопролиферативных заболеваний, и др., ввиду чего пациенты с НАО могут долго оставаться без верного диагноза и, следовательно, без эффективной терапии.
Ключевые слова. Наследственный ангиоотёк, SERPING1, НАО, ингибитор С1-эстеразы, молекулярная генеалогия.
Введение. Наследственный ангиоотёк (НАО) - редкое генетическое заболевание, проявляющееся в виде повторяющихся отёков слизистой оболочки, поражающие практически любые участки тела: конечности, лицо, стенки кишечника, оболочки головного мозга, гортань и др. [1]. Спектр локализации, кратность и тяжесть приступов НАО имеют широкую вариабельность как среди пациентов из разных семей или же членов одной семьи, так и у одного и того же пациента в различные этапы жизни [2].
В 99% всех случаев НАО связан с недостаточностью (количественной - тип I или функциональной - тип II) ингибитора С1-эстеразы, вызванной аллельными вариантами в гене SERPING1, кодирующем ингибитор С1-эстеразы (OMIM #606860) [3]. Предполагаемая распространенность пациентов с НАО ввиду дефицита ингибитора С1 -эстеразы составляет 1:10 000-1:50 000, без расовых и половых различий [4]. В 1% описанных случаев НАО не сопровождается недостаточностью ингибитора С1-эстеразы, причиной которых являются определённые нарушения в генах FXII, PLG, ANGPT1, KNG1, MYOF и HS3ST6 [5-7].
ОФ "Международный научно-исследовательский центр "Endless Light in Science"
При постановке диагноза НАО скрининговым тестом является определение компонента системы комплемента С4, затем выполняют уточняющие тесты: определение количества ингибитора С1-эстеразы и его функциональной активности [1]. На сегодняшний день все аллельные варианты, ассоциированные с НАО, выявлены в генах с низкой пенетрантностью, в результате чего у носителя патогенетического нарушения первый приступ НАО может развиться без каких-либо клинических предпосылок и в любом возрасте. НАО ввиду дефицита ингибитора С1-эстеразы, как правило, дебютирует до 20 лет, а НАО без дефицита ингибитора С1-эстеразы после 25-30 лет [5,8]. Среди европейской популяции медиана дебюта НАО ввиду дефицита ингибитора С1-эстеразы приходится на 8-12 летний возраст, однако описаны случаи дебюта как и в 1 год, так и после 40-60 лет [8-10].
Учитывая, что образцы сыворотки и плазмы крови чувствительны к условиям хранения и транспортировки, наиболее точным инструментом диагностики НАО является молекулярно-генетическое исследование, которое также удобно для выявления родственников на доклинической стадии или при необходимости удаленной транспортировки образцов [11]. Кроме этого, генетическое тестирование пациентов с предположительным НАО без дефицита ингибитора С1-эстеразы - единственный инструмент, позволяющий установить точный диагноз [1].
Таким образом, использование комплексного подхода будет способствовать эффективному решению диагностических, прогностических и классификационных задач при постановке диагноза НАО. Рассмотрим на примере трех клинических случаев.
Результаты исследования. Случай №1: в консультативно-поликлиническое отделение Центра детской онкологии, гематологии и иммунологии обратилась мама восьмилетнего мальчика (пробанд, ГО 001) с жалобами на повторяющиеся у ребенка отёки ушных раковин. Со слов матери, у пробанда отёки манифестировали в возрасте двух лет. Семейный анамнез отягощен: известно о семи субъектах в четырёх поколениях с рецидивирующими ангиоотёками различной локализации. Пробанду выполнили тесты по определению компонентов системы комплемента С3, С4 и ингибитора С1-эстеразы. Результаты тестов соответствовали картине НАО тип I (0,9 г/л (интервал нормы: 0,9-1,8 г/л); 0,06 г/л (интервал нормы: 0,1-0,4 г/л); и 0,0595 г/л (интервал нормы: 0,21-0,39 г/л), соответственно). Далее провели молекулярно-генетическое исследование гена 8ЕКРШ01, в результате чего выявили гетерозиготную замену нуклеотида Т на нуклеотид С в области сплайс-сайта третьего экзона: с. 550+2 Т—»С, ге112666115 (рисунок 1 и 2). После выявления патогенетического аллельного варианта, пробанду (ГО 001) начали выполнение молекулярно-генеалогического анализа (рисунок 3).
L1'-. «>Х ИИ ми t««i IKI ПЧ1 )Ж ••:< «•»» «ж «HI tt* #;■« 441 *<n ft'» oij •>« •»• «*
1 • 1 1 1 1 1 1 1 1 1 a 1 1 1 1 1 1 ■ 1 1 1 1 1 1 1 • 1 1 1 ■ 1 1 1 1 ■ 1 1 1 . - 1 1 • 1 1 1 ■ 1 1 1 1 1
1« «а> ш •• м «1 w Ш' «I м< м «1 «« «j <»1 •< . v .. . . « u а ш a, . i„ ы ш ш ш ш », u, ». u Ц» Ц1 U1 Ш UJ Ц4 Ш ш Ш
Рисунок 1. - Визуализированные в программе Sequencing Analysis 5.2 результаты секвенирования по Сэнгеру третьего экзона у пациента ID 001
Рисунок 2. - Визуализация сравнения результатов секвенирования у пациента ГО 001 и референсной последовательности нуклеотидов в программе BioEdit
Рисунок 3. - Генеалогическое дерево семьи пациента ГО 001. Образцы ДНК без отличий в референсной последовательности исследуемой области обозначены образцы с
детектированным с. 550+2 Т^С закрашены черным. Диагональным штрихом окрашены родственники с клиническими проявлениями НАО, но не участвующие в генетическом
исследовании.
По результатам генетического исследования восьми кровных родственников пробанда, выявили характерный для их семьи аллельный вариант в гене 8ЕКРШ01 у пяти симптомных (1957 г.р., 1983 г.р., 1979 г.р., 1975 г.р., 2002 г.р.) и одного бессимптомного родственника 2014 г.р.; у двух бессимптомных родственников 1957 и 1978 г.р. отличий от референсной последовательности в интересующем регионе не выявлено. Клинические данные пациентов с НАО семьи пациента ГО 001 представлены в таблице 1. Таблица 1. - Клинические данные пациентов с НАО семьи пациента ГО 001
ПНП * Полны х лет (январь 2023) Отёк Оценка «тяжести» течения НАО (BYGUM) [12] Возраст начала атак Среднее количество приступов в год
кожных покровов гортани внутренн их органов Первых Тяжёлых Всех Тяжёлых
ID 001 13 да нет да 4 2 нет 9 0
ID 022 20 да да да 10 4 16 9 5
ID 008 44 да да да 9 1 14 10 4
ID 009 65 да да да 9 1 6 15 10
ID 015 8 нет нет нет досимптом-но нет нет нет нет
ID 022 39 да да да 7 20 24 20 6
ID 029 47 да да да 9 3 8 50 12
П Примечание - *ПНП — порядковый номер пациента
Как видно из таблицы 1, у пяти пациентов дебют заболевания пришёлся на возраст до 4 лет, а у пациента ID 022 - в 20 лет. У пациента ID 015 к 2023 году в возрасте восьми лет дебют НАО ещё не случился. Оценка степени «тяжести» по общепринятой шкале BYGUM [12] у симпномных пациентов из указанной семьи варьирует от 4 до 10 баллов (медиана 9 баллов). Среднее количество всех приступов в год составило от 9 до 50 (медиана 12,5), из классифицированных как «тяжёлые» от 0 до 12 в год (медиана 5,5).
Случай №2: в консультативно-поликлиническое отделение Центра детской онкологии, гематологии и иммунологии обратилась бабушка четырнадцатилетней девушки (пробанд, ID 003) с жалобами на повторяющиеся у ребенка отёки стоп. Отягощающим фактором была недавняя смерть матери пробанда в возрасте 32 лет от отёка гортани. Со слов бабушки пробанда, помимо матери отёки больше ни у кого в семье не присутствовали. Пробанду выполнили тесты по определению компонентов системы комплемента С3, С4 и ингибитора С1-эстеразы. Результаты тестов соответствовали картине НАО тип I (0,9 г/л (интервал нормы: 0,9-1,8 г/л); 0,069 г/л (интервал нормы: 0,2-0,5 г/л) и 0,072 г/л (интервал нормы: 0,21-0,39 г/л), соответственно). Пробанду выполнили молекулярно-генетическое исследование гена SERPING1 и выявили гетерозиготную замену нуклеотида G на нуклеотид А в 1478 положении по кодирующей последовательности, приводящую к изменению аминокислоты в восьмом экзоне: с. 1478 G^A, p. Gly 493 Glu, CM022845 (рисунок 4 и 5). После выявления патогенетического аллельного варианта, пробанду (ID 003) начали выполнение молекулярно-генеалогического анализа (рисунок 6).
Г*> Ов t*tl •••}« 1««Т «»«.О :»'»» СО**- t не 2С ¿9>0 ¿»SI t»*4 m? i»0 >00-> >01( 9<yt* K>«£
1 1 1 1 1 г с т т с л»« 2Ч-» л tu >м 1 Г 1 AT а S 4П Z4I 1« ■ О 2*1 ■ я«« . . 1 1 1 1 1 1 1 1 1 PC ViVT«T«T о :4ч хм i«t :м jm * wi sal xti i«i aw*
M -JL :-—и:—^ А J m Jl у л кгёЫШ
Рисунок 4. - Визуализированные в программе Sequencing Analysis 5.2 результаты секвенирования по Сэнгеру восьмого экзона у пациента ID 003
Рисунок 5. - Визуализация сравнения результатов секвенирования у пациента ГО 003 и референсной последовательности нуклеотидов в программе BioEdit
Рисунок 6. - Генеалогическое дерево пациента ID 003. Образцы ДНК без отличий в референсной последовательности исследуемой области обозначены «wt/wt», образцы с детектированным с. 1478 G^A закрашены черным. Диагональным штрихом окрашены родственники с клиническими проявлениями НАО, но не участвующие в генетическом
исследовании
По результатам генетического исследования восьми кровных родственников пробанда, выявлено характерное для их семьи генетическое нарушение у пяти бессимптомных родственников в трёх поколениях (1951 г.р., 1957 г.р., 1979 г.р., 2012 г.р., 2005 г.р.) и одного бессимптомного родственника 2014 г.р.; у трёх бессимптомных родственников 1949 г.р., 1986 и 2013 г.р. отличий от референсной последовательности в интересующем регионе не выявлено (рисунок 6). После оглашения результатов генетического тестирования пациенты ID 025 и ID 010 сообщили, что, возможно, в возрасте 20-22 лет у них были незначительные клинические проявления НАО в области живота, но больше отёков, с их слов, не случалось. Пациент ID 020 сообщил, что в возрасте 29 лет у него случались незначительные отёки рук, которым он не придал значения. За время осуществления клинического наблюдения, только в возрасте 39 лет у пациента ID 020 отёки стали рецидивирующими, от 5 до 9 в год, большей частью проявляющиеся отёками кожных покровов и абдоминальными приступами. Приступов, классифицируемых как «тяжёлые», у данного пациента к 44 годам не зафиксировано. Что касается пробанда, то к 26 летнему возрасту у неё среднее количество отёков в год равняется 24, из которых 12 классифицируются как «тяжёлые».
Случай №3: в консультативно-поликлиническое отделение Центра детской онкологии, гематологии и иммунологии обратилась мама пятилетнего мальчика (пробанда, ID 069) с жалобами, не связанными с рецидивирующими ангиоотёками. Однако врача-гематолога насторожило, что в анамнезе мальчика значился однократный отёк одной голени в возрасте одного года, и однократный отёк одного глаза в возрасте пяти лет. Пробанду выполнили тесты по определению компонентов системы комплемента С3, С4 и ингибитора С1-эстеразы. Результаты тестов показали, что уровень компонента системы комплемента С3 был в норме, С4 снижен незначительно, а уровень ингибитора С1-эстеразы почти на 50% ниже от нижних
ОФ "Международный научно-исследовательский центр "Endless Light in Science"
пределов интервалов нормы (1,42 г/л (интервал нормы: 0,9-1,8 г/л); 0,08 г/л (интервал нормы: 0,1-0,4 г/л) и 0,118 г/л (интервал нормы: 0,21-0,39 г/л), соответственно). Пробанду выполнили
аз_3340_0667_Рбвб_Р70Д_07Д4__Р76Й_0701_ОООО_Р01Э_оеое_ФОД7_РФ76_ФвЗД_ЭЯ4_о
.......................I
САТС С С СТТТТССССАТТСАССАТР 3<?7__3^.1_3^.3__3^.7_З^З_3^11_3^13_3^13_3^17__3?!
1СОО .1.111
1104 д
I йМША
молекулярно-генетическое исследование гена 8ЕКРШ01 и выявили гетерозиготную замену нуклеотида С на нуклеотид G в 512 положении по кодирующей, приводящую к изменению аминокислоты в третьем экзоне: с. 512 С^О, р. Рго171А^ (рисунок 7 и 8). Детектированный аллельный вариант ранее не был описан в литературе, поэтому его анализировали с применением компьютерной программы предсказания патогенности PolyPhen2 [13].
Рисунок 7. - Визуализированные в программе Sequencing Analysis 5.2 результаты секвенирования по Сэнгеру третьего экзона у пациента ID 069
iiDiii« + вшт?ime®™pai™ фмЕ¥ Siäri
LL | Г 1 I 1 | T T ■ r 1 | T r 1 T | 1 1 32 0 f T T | T T 1 330 ' 1 T Г 1 I | I I 11 340 350 Т | Т Т Т , | 360 fit T|TTTt|Ttt 37 0 ' 1 ' зао , Т Т | ■ Г Т 1 т
FR fiG ДД GfiSGSfiGG GGSG5 ЙЙ й GG с | ттс д G Д G Д G ТШ д G G G ш с
Ехоп. fiG ДД GfiSGSSGG GGSG5 ЙЙ й GG ТТТТ^И с д G Д G Д G тш д G G G с
Г ÄG ДД GÄÄGÄÄGG GGSG5 ЙЙ Й GG TTTI^H G д G Д G Д G тВ д G G у G р Ш с
R ЙС ДД GfifiGÄfiGG GGÄGS ЙЙ й GG TTTI^B С ттс G Д С Д G д G G и G с
Рисунок 8. - Визуализация сравнения результатов секвенирования у пациента ГО 069 и референсной последовательности нуклеотидов в программе BioEdit
Рисунок 9. - Визуализация проверки патогенности замены аминокислоты Pro на аминокислоту Arg в 171 положении гена SERPING1
Результаты предсказания патогенности показали, что изменение аминокислоты Pro на аминокислоту Arg в 171 положении гена SERPING1 имеет большое патогенное значение (рисунок 9). После выявления патогенетического аллельного варианта, пробанду (ID 069)
I 15.12.1987/" "Ч ID 028-3
05.09.2017/^ГЛ И- ID 028-1
начали выполнение молекулярно-генеалогического анализа (рисунок 10). Со слов матери, и она, и отец пробанда многократно испытывали сильные аллергические реакции в течении всей жизни.
Рисунок 10. - Генеалогическое дерево пациента ID 069. Образцы ДНК без отличий в референсной последовательности исследуемой области обозначены «wt/wt», обозначение пробанда с детектированным с. 512 C^G закрашено черным.
По результатам генетического исследования, ни у отца, ни у матери пробанда аллельный вариант с. 512 C^G не выявлен. Подтверждением отсутствия у родителей пробанда НАО также послужили результаты тестов по определению компонентов системы комплемента С3, С4 и ингибитора С1-эстеразы, которые находились в диапазоне нормы. Таким образом, выявленный аллельный вариант у пациента ID 069 классифицировали как de novo. Позже молекулярно-генетический анализ выполнили родной бессимптомной сестре пробанда, который также показал отсутствие в образце её ДНК аллельного варианта с. 512 C^G.
Заключение. Данные примеры показывают, что спектр локализации, кратность и тяжесть приступов НАО имеют широкую вариабельность как среди пациентов из разных семей, так и среди членов одной семьи. Кроме того, одно и то же генетическое нарушение может приводить к абсолютно разному проявлению заболевания, варьируя от бессимптомных случаев до пациентов, страдающих от ежемесячных тяжёлых и угрожающих жизни приступов. Таким образом, и низкая пенетрантность генов, и смешанная клиническая картина пациентов с НАО могут способствовать упущению истинного семейного анамнеза, что в целом может повлиять на достоверность диагностики НАО. В связи с этим, при диагностике необходимо использовать комплекс из критериев клинической картины и из результатов лабораторных исследований, дабы не допустить ложноположительного диагноза у пациентов с рецидивирующими отёками, возникшими по причине активации тучных клеток или ложноотрицательного диагноза у пациентов с НАО.
■ 29.05.2014 ID 069
ЛИТЕРАТУРА
1. Maurer, M. The international WAO/EAACI guideline for the management of hereditary angioedema - The 2021 revision and update / M. Maurer [et al.] // Allergy. - 2022. - Vol. 77, iss. 7. - P.1961-1990.
2. Bova, M. Hereditary and Acquired Angioedema: Heterogeneity of Pathogenesis and Clinical Phenotypes / M. Bova [et al.] // International Archives of Allergy and Immunology. - 2018. - № 175(3). - P. 126-135.
3. Maas, C. Hereditary angioedema: insights into inflammation and allergy / C. Maas, A. López-Lera // Mol. Immunol. - 2019. - Vol. 112. - P. 378-386.
4. Jindal, A.K. Hereditary Angioedema: Diagnostic Algorithm and Current Treatment Concepts/ A.K. Jindal, A. Bishnoi, S. Dogra // Indian Dermatol Online J. - 2021. - №12(6). -P.796-804.
5. Bork, K. Clinical features of genetically characterized types of hereditary angioedema with normal C1 inhibitor: a systematic review of qualitative Evidence / K. Bork [et al.] // Orphanet J Rare Dis. - 2020. - Vol. 289 (15). - P. 1-14.
6. Ariano, A. A myoferlin gain-of-function variant associates with a new type of hereditary angioedema / A. Ariano [et al.] // Allergy. - 2020. - № 75(11). - P. 2989-2992.
7. Bork, K. Novel hereditary angioedema linked with a heparan sulfate 3-O-sulfotransferase 6 gene mutation / K. Bork [et al.] // J Allergy Clin Immunol. - 2021. - № 21.
8. Zanichelli, A. Improvement in diagnostic delays over time in patients with hereditary angioedema: findings from the Icatibant Outcome Survey / A. Zanichelli [et al.] // Clinical and translational allergy. - 2018. - Vol. 8.
9. Longhurst, H. Hereditary angio-oedema / H. Longhurst, M. Cicardi // Lancet. - 2012. - P. 474-481.
10. Guryanova, I.E. Demographic characteristics of patients with genetically confirmed hereditary angioedema in the Republic of Belarus / I.E. Guryanova [et al.] // Immunopathology, allergology, infectology. - 2022. - №2. - С. 12-18.
11. Germenis, A. E. International consensus on the use of genetics in the management of hereditary angioedema / A. E. Germenis [et al.] // The J. of Allergy and Clin. Immunol. In Pract. -2019. - Vol. 8, № 3. - P. 901-911.
12. Bygum, А. Mutational spectrum and phenotypes in Danish families with hereditary angioedema because of C1 inhibitor deficiency / A. Bygum [et al.] // Allergy. - 2011. - Vol. 66, № 1. - P. 76-84.
13. PolyPhen-2: prediction of functional effects of human nsSNPs [Electronic resource]. - Mode of access: http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/. - Data of access: 19.01.2023
