CC BY
17УДК 615.322:582.736:615.074 https://doi.org/10.29296/25877313-2021-03-03
© Коллектив авторов, 2021
ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММЫ ФЛАВОНОИДОВ В ТРАВЕ АСТРАГАЛА ШЕРСТИСТОЦВЕТКОВОГО СASTRAGALUS DASYANTHUS L.)
Т.Д. Позднякова
к.фарм.н.,
Орловский государственный университет имени И.С. Тургенева (г. Орел, Россия) E-mail: pozdnyakova.tatyana.72@mail.ru Р.А. Бубенчиков д.фарм.н.,
АО «Научно-производственное объединение «Микроген» Министерства здравоохранения Российской Федерации (Москва) Е.С. Кулешова
К.6.Н.,
Орловский государственный университет имени И.С. Тургенева (г. Орел, Россия)
Основной группой действующих веществ астрагала шерстистоцветкового (Astragalus dasyanthus L.) являются флавоноиды, среди которых преобладает гиперозид. Разработка достаточно точной и простой методики количественного определения содержания флавоноидов, а также ее валидация являются актуальной проблемой.
Цель работы. Валидация методики количественного определения суммы флавоноидов в траве астрагала шерстистоцветкового. Материал и методы. Объектом исследования явилась трава астрагала шерстистоцветкового. Определены оптимальные условия экстрагирования суммы флавоноидов из сырья: степень измельчения сырья - 1 мм, экстрагент- спирт этиловый 70%-ный, соотношение сырье-экстрагент 1:100, нагревание в течение 45 мин. При изучении условий спектрофотометрирования установлено, что оптимальным является использование 2 мл 5%-ного раствора алюминия хлорида. Устойчивое окрашивание извлечений из сырья с алюминия хлоридом наступает через 15 мин и сохраняется в течение 1,5 ч, что достаточно для проведения анализа. Результаты. Валидация методики проведена по параметрам линейности, повторяемости, воспроизводимости и правильности методики. Установлено, что в пределах измерений концентраций (начиная с оптической плотности 0,33 до оптической плотности 0,89) зависимость содержания гиперозида от массы навески сырья носит линейный характер. Повторяемость методики определяли на одном образце сырья в шести повторностях. Критерий приемлемости, выражаемый величиной относительности стандартного отклонения, составил 4,38%, что свидетельствует о прецизионности методики в условиях повторяемости. Определение воспроизводимости методики выполняли два исследователя. Изучение проводили на трех образцах в трех повторностях. Относительное стандартное отклонение составило 4,67%, что указывает на прецизионность методики в условиях воспроизводимости. Правильность методики устанавливали измерением содержания гиперозида в растворах, полученных путем добавления необходимого количества стандартного раствора гиперозида (0,25; 0,5 мл) к исследуемому раствору. В разработанной методике процент восстановления колеблется от 98,15 до 102,35%, его средняя величина составляет 100,36%, а также отсутствует систематическая ошибка, относительная неопределенность при доверительной вероятности 0,95 не превышает 2,89%. Выводы. Разработанная методика количественного определения флавоноидов в траве астаргала шерстистоцветкового может быть использована для стандартизации сырья «Трава астрагала шерстистоцветкового» по содержанию флавоноидов. Ключевые слова: астрагал шершстоцветковый, флавоноиды, спектрофотометрический метод, валидация методики.
Для цитирования: Позднякова Т.А., Бубенчиков Р.А., Кулешова Е.С. Валидация методики количественного определения суммы флавоноидов в траве астрагала шерстистоцветкового (Astragalus dasyanthus L.). Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2021;24(3):20-26. https://doi.org/10.29296/25877313-2021-03-03
Как показывает анализ литературных источников, основной группой действующих веществ астрагала шерстистоцветкового (Astragalus dasyanthus L.) являются флавоноиды, а преобладающим соединением данной группы - гиперозид [1, 2]. В связи с этим рациональным является стандартизация лекарственного растительного сырья травы астрагала шерстистоцветкового по содержанию флавоноидов.
Однако известные методики определения количественного содержания флавоноидов в траве астрагала шерстистоцветкового не были валидированы [1, 3], а в настоящее время это обязательное требование нормативной документации. Поэтому разработка достаточно точной и простой методики количественного определения содержания флавоноидов, а также ее валидация являются актуальной задачей.
Цель работы - валидация усовершенствованной методики количественного определения суммы флавоноидов в траве астрагала шерстисто-цветкового.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Объектом исследования явилась трава астрагала шерстистоцветкового, заготовленная в 2019— 2020 гг. на территории Курской области в период массового цветения растения. Траву высушивали до воздушно-сухого состояния и измельчали до размера частиц 1 мм.
При разработке методики определения количественного содержания флавоноидов в траве астрагала шерстистоцветкового использовали спек-трофотометрический метод, основанный на реакции комплексообразования с алюминия хлоридом, при котором происходит батохромный сдвиг полосы поглощения флавоноидов с 330-350 до 390-410 нм [1]. При добавлении к спирто-водным извлечениям из травы астрагала шерстистоцветкового раствора алюминия хлорида в спектре полученных растворов появлялся максимум поглощения при 405 нм, который совпадал с максимумом поглощения гиперозида с алюминия хлоридом, поэтому осуществляли анализ при данной длине волны. Применение в качестве контроля исследуемого извлечения без алюминия хлорида позволило исключить стадию очистки извлечений от экстрактивных веществ. Для получения более воспроизводимых результатов реакцию комплексообразования проводили в кислой среде [1].
При получении извлечений из травы астрагала шерстистоцветкового были установлены следующие условия экстрагирования суммы флавоноидов из сырья: степень измельчения сырья - 1 мм, экстра-гент - спирт этиловый 70%-ный, соотношение сы-рье-экстрагент 1:100, нагревание в течение 45 мин. Изучая условия комплексообразования, установили, что оптимальным является использование 2 мл 5%-ного раствора алюминия хлорида.
Приготовление раствора стандартного образца (СО) гиперозида. Около 0,02 г (точная навеска) СО гиперозида помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 35 мл спирта этилового 70%-ного и растворяют при периодическом помешивании, доводят объем раствора тем же спиртом до метки и перемешивают (раствор А СО гиперозида).
Далее 1 мл раствора А СО гиперозида помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл,
прибавляют 2 мл алюминия хлорида раствора 5%-ного в спирте этиловом 70%-ном и через 10 мин - 2 капли кислоты уксусной разведенной. Объем раствора доводят тем же спиртом до метки (раствор Б СО гиперозида).
Приготовление алюминия хлорида раствора 5%-ного в спирте этиловом 70%-ном. 5,0 г алюминия хлорида растворяют в 40 мл спирта этилового 70%-ного в мерной колбе вместимостью 100 мл, доводят объем раствора тем же спиртом до метки и перемешивают.
Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 1 мм. Около 1,0 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, прибавляют 100 мл 70%-ного спирта этилового и взвешивают с погрешностью ±0,01 г. Колбу присоединяют к обратному водяному холодильнику, нагревают на кипящей водяной бане в течение 45 мин, периодически встряхивая для смывания частиц сырья со стенок. Колбу с содержимым охлаждают до комнатной температуры, взвешивают и при необходимости доводят до первоначальной массы 70%-ным спиртом этиловым. Извлечение пропускают через бумажный фильтр, смоченный тем же спиртом, отбрасывая первые 10 мл фильтрата (раствор А испытуемого раствора).
Затем 2 мл раствора А испытуемого раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 2 мл алюминия хлорида раствора 5%-ного в спирте этиловом 70%-ном и через 10 мин -2 капли кислоты уксусной разведенной. Объем раствора доводят тем же спиртом до метки и оставляют на 15 мин (раствор Б испытуемого раствора).
Оптическую плотность образующегося комплекса измеряют на спектрофотометре при длине волны 405±5 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 2 мл раствора А испытуемого раствора, 2 капель кислоты уксусной разведенной и доведенный спиртом этиловым 70%-ным до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл.
Параллельно измеряют оптическую плотность раствора Б СО гиперозида в тех же условиях. Раствором сравнения служит раствор, состоящий из 1 мл раствора А СО гиперозида, 2 капель кислоты уксусной разведенной и доведенный спиртом этиловым 70%-ным до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл [1].
Содержание суммы флавоноидов в процентах (х) в пересчете на гиперозид в абсолютно сухом сырье вычисляют по формуле
X =
Л-ЮО-25-о0-1-Р-100-100 Д, • я • 2 • 50 • 25 • 100 • (100 - Ж)
где А - оптическая плотность раствора Б испытуемого раствора; А0 - оптическая плотность раствора Б СО гиперозида; а - навеска сырья, г; а0 -навеска СО гиперозида, г; Р - содержание основного вещества в СО гиперозида, %; Ж - влажность сырья, %.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Валидация методики проводилась по параметрам линейности, повторяемости, воспроизводимости и правильности методики [4-6].
Линейность методики определяли, используя пять уровней концентраций от теоретического содержания суммы флавоноидов. Сначала был приготовлен исходный раствор СО гиперозида (ООО «Фитопанацея») с концентрацией 0,05%. Затем из него готовили разбавленные растворы. Для этого в мерные колбы вместимостью 25 мл помещали по 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5 мл полученного раствора гиперозида, прибавляли 2 мл раствора алюминия хлорида 5%-ного в спирте этиловом 70%-ном, перемешивали, подкисляли 2 каплями кислоты уксусной разведенной, доводили объем тем же растворителем до метки и снова перемешивали. Через 15 мин измеряли оптическую плотность раствора на СФ-2000 при длине волны 405 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм в сравнении с контрольным опытом и строили график зависимости оптической плотности от концентрации гиперозида (рис. 1).
Критерием приемлемости линейности является коэффициент корреляции. Если его величина близка к единице, то совокупность данных можно описать прямой линией. Коэффициент корреляции, рассчитанный по полученным экспериментальным данным, составил 0,99923 (табл. 1, рис. 1), т.е. зависимость оптической плотности от концентрации имеет линейный характер.
Для установления диапазона использования разработанной методики получали извлечения спиртом этиловым 70%-ным из навесок массой 0,75; 1,0; 1,25; 1,5; 1,75 г и в полученных извлечениях определяли содержание флавоноидов в пересчете на гиперозид. Далее строили график зави-
симости оптическои плотности от массы навески сырья (рис. 2). Величина коэффициента корреляции составила 0,99850, что удовлетворяет требованиям (табл. 2).
Таблица 1. Результаты статистической обработки данных, полученных при изучении линейной зависимости вида у=Ьх+а оптической плотности растворов от концентрации гиперозида
X У Ь а Я
4 0,511 0,59504 1,08867 0,03873 0,99923
Рис. 1. Зависимость оптической плотности растворов от концентрации гиперозида
Рис. 2. Зависимость оптической плотности исследуемых извлечений из травы астрагала шерстистоцветкового от массы навески сырья
Таблица 2. Результаты статистической обработки данных, полученных при изучении линейной зависимости вида у=Ьх+а оптической плотности исследуемых извлечений от массы навески сырья
1" X У Ь а Я
4 1,25002 0,60588 0,54603 0,07667 0,99850
Таблица 3. Результаты количественного определения суммы флавоноидов в траве астрагала шерстисгоцветкового
№ п/п Содержание флавоноидов в пересчете на гиперозид, % Метрологические характеристики
1 2,18 хср = 2Д5
2 2,15 &с2 = 0,0013
3 2,19 &сср = 0,0367
4 2,1 Ах = 0,09
5 2,12 -^отн =4,38%
6 2,18 хср ± Ахср = 2,15±0,09
На основании полученных результатов установлено, что в пределах измерений концентраций (начиная с оптической плотности 0,33 до оптической плотности 0,89) зависимость содержания гиперозида от массы навески сырья носит линейный характер. Значение коэффициента а=0,07667 (табл. 2) говорит о статистически незначительном вкладе других биологически активных веществ, содержащихся в сырье, в количественное содержание суммы флавоноидов, что свидетельствует о достаточной специфичности методики.
Повторяемость методики определяли на одном образце сырья в 6 повторностях (табл. 3).
Критерий приемлемости выражался величиной относительного стандартного отклонения, которое не должно превышать 10%. Он составил 4,38%, что свидетельствует о прецизионности методики в условиях повторяемости.
Воспроизводимость методики определяли два исследователя. Изучение проводили на трех образцах в трех повторностях. Критерий приемлемости выражается величиной относительного стандартного отклонения, которое не должно превышать 15%. В результате исследований относительное стандартное отклонение составило 4,67%, что указывает на прецизионность методики в условиях воспроизводимости (табл. 4).
Правильность методики устанавливали измерением содержания гиперозида в растворах, полученных путем добавления необходимого количества стандартного раствора гиперозида (0,25; 0,5 мл) к исследуемому раствору. Критерий приемлемости - средний процент восстановления при использовании растворов заданных концентраций, скорректированный на 100%, и его средняя величина должна находиться в пределах 100±5% (табл. 5).
В разработанной методике процент восстановления колеблется от 98,15 до 102,35% (табл. 5), его средняя величина составляет 100,36%. В методике отсутствует систематическая ошибка, относительная неопределенность при доверительной вероятности 0,95 не превышает 2,89%.
Таблица 4. Определение воспроизводимости методики
Повторность Аналитик Содержание суммы флавоноидов в пересчете на гиперозид в траве астрагала шерстисгоцветкового, %
Образец №1 Образец №2 Образец №3
1 2 3 4 5
1 1 2,18 1,64 1,86
2 1 2,15 1,66 1,9
3 1 2,19 1,59 1,88
4 2 2,11 1,62 1,83
5 2 2,14 1,65 1,85
6 2 2,09 1,6 1,8
Среднее значение 2,14 1,63 1,85
Относительное стандартное отклонение, (1180%) 4,65 4,43 4,94
Таблица 5. Определение правильности методики (результаты опытов с добавками)
№ п/п Содержание гиперозида, мг Добавлено СО гиперозида, мг Ожидаемое содержание, мг Полученное содержание, мг Найдено относительно введенного, % Статистические характеристики
1 0,436 0,125 0,561 0,558 99,55 Хсредаее = 100,36 5^ = 1,5785 Я* = 1,2561 АХ = 2,90 Еош= 2,89% Хср ±АХ = 100,36±2,89
2 0,436 0,125 0,561 0,563 100,41
3 0,436 0,125 0,561 0,567 101,07
4 0,436 0,175 0,611 0,605 99,09
5 0,436 0,175 0,611 0,618 101,18
6 0,436 0,175 0,611 0,614 100,51
7 0,436 0,225 0,661 0,667 102,35
8 0,436 0,225 0,661 0,649 98,15
9 0,436 0,225 0,661 0,667 100,92
Среднее значение выхода - 100,36%
Таблица 6. Метрологическая характеристика метода
№ п/п X и X Р,% АХ р огн
1 2,18 2,15 2,19 2,11 2,14 5 2,15 0,00103 0,03209 95 2,78 0,09 4,19
2 1.64 1,66 1,59 1,62 1.65 5 1,63 0,00077 0,02775 95 2,78 0,08 4,91
3 1,86 1,90 1,88 1,83 1,85 5 1,86 0,00073 0,02702 95 2,78 0,08 4,30
4 2,02 2,05 2,04 2,09 2,03 5 2,05 0,00073 0,02702 95 2,78 0,08 3,90
5 1,88 1,87 1,89 1.92 1.93 5 1,90 0,00067 0,02588 95 2,78 0,07 3,68
Предложенной методикой проанализировано пять партий сырья. Результаты анализов свидетельствуют, что содержание гиперозида находится в пределах от 1,59 до 2,19%. В связи с этим рекомендуем оставить норму содержания гиперозида в траве астрагала шерстистоцветкового не менее 1,3% (табл. 6).
Ошибка единичного определения с 95% вероятности не превышает 4,91%.
ВЫВОДЫ
1. Определены оптимальные параметры методики количественного определения содержания флавоноидов в траве астаргала шерстистоцветкового.
2. Установлены параметры линейности, повторяемости, воспроизводимости и правильности разработанной методики.
3. Разработанная методика количественного определения флавоноидов в траве астаргала шерстистоцветкового может быть использована для стандартизации сырья «Трава астрагала шерстистоцветкового» по содержанию флавоноидов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Позднякова Т.А., Бубенчиков Р.А. Разработка методики количественного определения флавоноидов в траве астрагала шерстистоцветкового {Astragalus dasyanths L.). Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2018; 6:10-15.
2. Буданцев А.Л. Растительные ресурсы России: Дикорастущие цветковые растения, их компонентный состав и биологическая активность. Т.З. Семейства Fabaceae Apiacea. СПб. М.: Товарищество научных изданий КМК, 2010; 610 с.
3. Блинова К.Ф., Баланкова Л.Г. К фотохимическому изучению некоторых представителей рода астрагала Ast-ragalusL. Вопросы фармакогнозии. 1968; 5:113-123.
4. ГОСТ Р ИСО 5725-3-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений». Часть 3. Промежуточные показатели прецизионности стандартного метода измерений. М.: Госстандарт. 28 с.
5. Мешковский А.П. Валидация аналитических методов. Сб. «Современные требования к организации и деятельности контрольно-аналитических лабораторий отделов контроля качества фармацевтических предприятий». М., 2002; 26-30.
6. Основные принципы проведения валидации на фармацевтическом производстве. Под ред. проф. В.В. Береговых. М.: «Издательский дом «Русский врач», 2005; 73-97.
Поступила после доработки 10 февраля 2021 г.
VALIDATION OF THE METHOD OF QUANTITATIVE DETERMINATION OF THE AMOUNT OF FLAVONOIDS IN THE HERB ASTRAGALUS DASYANTHUS L.
© Authors, 2021 T.A. Pozdnyakova
Ph.D. (Pharm.), Oryol State University named after I.S. Turgenev (Oryol, Russia) E-mail: pozdnyakova.tatyana.72@mail.ru R.A. Bubenchikov
Dr.Sc. (Pharm.), JSC «Scientific and Production Association «Microgen» of the Ministry of Health of the Russian Federation (Moscow) E.S. Kuleshova
Ph.D. (Biol.), Oryol State University named after I.S. Turgenev (Oryol, Russia)
The main group of active substances of Astragalus dasyanthus are flavonoids, among which hyperoside predominates. Therefore, we made an attempt to standardize the raw Astragalus dasyanthus woolly flowering in the content of flavonoids, in terms of hyperoside. The development of a fairly accurate and simple method for the quantitative determination of flavonoid content, as well as its validation, is an urgent problem. Therefore, the aim of our work was to validate the method for quantitative determination of the amount of flavonoids in the herb of Astragalus dasyanthus.
Material and methods. The object of the study was herb Astragalus dasyanthus, harvested in 2019 - 2020 in the Kursk region during the period of mass flowering of the plant. The herb was dried to an air-dry state and ground to a particle size of 1 mm. When developing the methodology, optimal conditions were established for extracting the sum of flavonoids from raw materials: the degree of grinding of the raw material is 1 mm, the extractant is ethyl alcohol 70%, the ratio of raw material to extractant 1: 100, heating for 45 minutes. When studying the conditions of spectrophotometry, it was found that the use of 2 ml of a 5% solution of aluminum chloride is optimal. Results. Validation of the methodology was carried out according to the parameters of linearity, repeatability, reproducibility and correctness of the methodology. Based on the results obtained, it was found that within the concentration measurements (starting from an optical density of 0,33 to an optical density of 0,89), the dependence of the content of hyperoside on the mass of a sample of raw materials is linear.
Repeatability of the method was determined on one sample of raw materials in 6 replicates. The acceptance criterion was expressed by the standard deviation relative value, which should not exceed 10%. It amounted to 4,38%, which testifies to the precision of the technique under repeatability conditions. Determination of reproducibility of the method was performed by 2 researchers. The study was carried out on 3 samples in 3 replicates. As a result of our studies, the relative standard deviation was 4,67%, which indicates the precision of the technique under reproducibility conditions. The correctness of the technique was established by measuring the content of hyperoside in solutions obtained by adding the required amount of a standard solution of hyperoside (0,25 ml, 0,5 ml) to the test solution. In the developed methodology, the recovery percentage ranges from 9,15% to 102,35%, its average value is 100,36%. There is no systematic error in the methodology, the relative uncertainty at a confidence level of 0,95 does not exceed 2,89%.
Conclusion. The developed method of quantitative determination of flavonoids in the herb of Astragalus dasyanthus can be used for standardization of raw materials «Herb Astragalus dasyanthus» the content of flavonoids.
Key words: Astragalus dasyanthus L, flavonoids, spectrophotometry method, validation of the method.
For citation: Pozdnyakova T.A., Bubenchikov R.A., Kuleshova E.S. Validation of the method of quantitative determination of the amount of flavonoids in the herb Astragalus dasyanthus L. Problems of biological, medical and pharmaceutical chemistry. 2021;24(3):20-26. https://doi.org/10.29296/25877313-2021-03-03
REFERENCES
1. Pozdnjakova T.A., Bubenchikov R.A. Razrabotka metodiki kolichestvennogo opredelenija flavonoidov v trave astragala sherstistocvetkovogo (Astragalus dasyanths L.). Voprosy biologicheskoj, medicinskoj i farmacevticheskoj himii. 2018; 6:10-15.
2. Budancev A.L. Rastitel'nye resursy Rossii: Dikorastushhie cvetkovye rastenija, ih komponentnyj sostav i biologicheskaja aktivnost'. T.3. Semejstva Fabaceae Apiacea. SPb. M.: Tovarishhestvo nauchnyh izdanij KMK, 2010; 610 s.
3. Blinova K.F., Balankova L.G. Kfitohimicheskomu izucheniju nekotoryh predstavitelej roda astragala Astragalus L. Voprosy farmakognozii. 1968; 5:113-123.
4. GOST R ISO 5725-3-2002 «Tochnost' (pravil'nost' i precizionnost') metodov i rezul'tatov izmerenij». Chast' 3. Promezhutochnye pokazateli precizionnosti standartnogo metoda izmerenij. M.: Gosstandart. 28 s.
5. Meshkovskij A. P. Validacija analiticheskih metodov. Sb. «Sovremennye trebovanija k organizacii i dejatel'nosti kontrol'no-analiticheskih laboratorij otdelov kontrolja kachestva farmacevticheskih predprijatij». M., 2002; 26-30.
6. Osnovnye principy provedenija validacii na farmacevticheskom proizvodstve. Pod red. prof. V.V. Beregovyh. M.: «Izdatel'skij dom «Russkij vrach», 2005; 73-97.
Лекарственные препараты, разработанные ВИЛАР
Алпизарин (таблетки, мазь), per. №№ 85/507/2; 85/507/10; 85/507/16 - противовирусное средство, получаемое из травы копеечника альпийского (Hedysarum alpinum L.) или копеечника желтеющего (Hedysarum flavenscens Rerel et Schmalh). По сравнению с ацикловиром обладает более широким спектром действия.
Аммифурин (таблетки, спиртовым раствор), per. №№ 83/914/9; 70/151/47; 70/151/48 - фотосенсибилизирующее средство, получаемое из плодов амми большой (Ammi majus L.).
Анмарин (линимент, гель, лосьон (раствор)), per. №№ 90/248/1; 95/178/5; 90/248/4 - антифунгальное, противогрибковое средство, получаемое из плодов амми большой (Ammi majus L.).
Гипорамин (таблетки, мазь, суппозитории, лиофилизат), per. №№ 98/305/1; 98/305/10; 98/305/12 - противовирусное средство , получаемое из листьев облепихи крушиновидной (Hippophae rhamnoides L.).
Глицирам (таблетки, гранулы), per. №№ 76/252/7; 70/730/48; 88/542/3 - оказывает противовоспалительное стимулирующее действие на кору надпочечников, умеренно отхаркивающее средство, получаемое из корней и корневищ солодки голой (Glycyrrhiza glabra L.) и солодки уральской (Glycyrrhiza uralensis Fisch.).
Тел. контакта: 8(495)388-55-09; 8(495)388-61-09; 8(495)712-10-45 Fax: 8(495)712-09-18; e-mail: vilarnii.ru; www.vilarnii.ru
