CC BY
272
№ 4 - 2013 г.
14.00.00 медицинские и фармацевтические науки
УДК 615.322:547.913
ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЭФИРНЫХ МАСЕЛ В РАСТИТЕЛЬНОМ ПРЕПАРАТЕ
КЛИМАСЕД
В. К. Яковенко, Е. А. Хохлова
Национальный фармацевтический университет (г. Харьков, Украина)
Разработана методика идентификации эфирных масел методом тонкослойной хроматографии для комбинированного лекарственного растительного препарата Климасед. В результате исследований определены оптимальные условия проведения хроматографического анализа, изучены валидационные характеристики — специфичность, робасность и прецизионность. Методом тонкослойной хроматографии подтверждена идентичность эфирных масел присутствующих в исходном растительном сырье и эфирных масел в составе готового лекарственного препарата. Валидированная методика идентификации была включена в «Методы контроля качества» лекарственного препарата Климасед.
Ключевые слова: эфирные масла, тонкослойная хроматография, валидация, лекарственное растительное сырье, Климасед.
Яковенко Владимир Константинович — кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры промышленной фармации и экономики Национального фармацевтического университета, г. Харьков, Украина, рабочий телефон: +38 (057) 757-55-49, e-mail: [email protected]
Хохлова Екатерина Александровна — ассистент кафедры качества, стандартизации и сертификации лекарств Национального фармацевтического университета, г. Харьков, Украина, рабочий телефон:+38(057) 731-92-76, e-mail: [email protected]
Введение. Стандартизация многокомпонентных лекарственных растительных препаратов (ЛРП) является сложной аналитической задачей [4, 8]. При оценке качества и установлении спецификаций на ЛРП рекомендуется использовать показатели, которые могли бы обеспечить их безопасность и эффективность. Одним из таких показателей является идентификация [1, 2]. Важной частью системы обеспечения и контроля качества является процесс валидации. Использование валидированных методик — это уверенность в достоверности полученных результатов [2, 3, 8].
Материалы и методы. Объектом нашего исследования был комплексный ЛРП Климасед, который содержит жидкий экстракт (1 : 3) из смеси лекарственного растительного сырья
(ЛРС): пассифлоры трава, липы цветы, душицы трава, шалфея листья, мелиссы трава, вспомогательное вещество — этанол 40 %; лекарственная форма — капли оральные (серия № 010312, производитель ООО «ГКП Фармацевтическая фабрика», г. Житомир, Украина). Климасед применяется в комплексной терапии предменструального синдрома, нарушений менструального цикла, климактерического синдрома, при артериальной гипертензии заболеваниях нервной системы (головная боль, неврастения, бессонница, астеническое состояние).
Для идентификации Климаседа нами были выбраны группы биологически активных веществ (БАВ), содержащиеся в ЛРС, которое входит в состав препарата — флавоноиды (пассифлоры трава, цветки липы), эфирные масла (душицы трава, шалфея листья, мелиссы трава, цветки липы) и алкалоиды (пассифлоры трава) [3, 5-7, 9]. Разработка методик на данные классы БАВ и включение их в спецификации на препарат обеспечивает специфичность определения.
Целью данной работы была разработка и валидация методики идентификации эфирных масел в составе препарата Климасед.
Как метод идентификации эфирных масел нами была выбрана тонкослойная хроматография (ТСХ). Метод является фармакопейным, простым, экономически доступным и традиционно используется для идентификации ЛРС и ЛРП [1, 3, 7].
При проведении эксперимента использовали достоверные стандартные образцы - тимол и цинеол; ТСХ-пластинки - Silica gel 60 F254 (Merck, Germany), 1.05729, 25 TLC plates и Sorbfil ПТСХ-АФ-А; ТУ 26-11-17-89, (Sorbfil Imid Ltd, Россия, Краснодар). Использовали индивидуальные извлечения травы пассифлоры, цветков липы, травы душицы, листьев шалфея, травы мелиссы, приготовленные с использованием 40 % этанола в концентрации, соответствующей их содержанию в препарате «Климасед». В качестве сырья для приготовления извлечений использовали аутентичное ЛРС, соответствующее требованиям ведущих фармакопей [3, 7]. Реактивы готовили в соответствии с требованиями Государственной фармакопеи Украины [3].
Результаты исследований и обсуждение результатов. При разработке методики идентификации были определены оптимальные условия проведения хроматографического анализа, изучены валидационные характеристики методики, такие как специфичность, робасность и прецизионность.
Определение специфичности методики идентификации эфирных масел препарата «Климасед» проводили на одной пластинке в сравнении с выбранными веществами-маркерами (тимол и цинеол) и индивидуальными спирто-водными извлечениями исходных компонентов Климасед.
В исследуемой подвижной фазе: толуол Р — этилацетат Р (19 : 1) после опрыскивания пластинки ванилина реактивом Р и высушивания при температуре 100 °С-105 °С в течение 3-5 мин в средней части хроматограммы веществ-маркеров выявляются голубая зона (цинеол), выше нее розовая зона (тимол). В средней части хроматограммы извлечения травы душицы в порядке возрастания Rf выявляются слабо выраженная фиолотевая зона (карвакрол) и розовая зона (тимол). В средней части хроматограммы извлечения листьев шалфея выявляются голубая зона (цинеол) и выше нее слабовыраженные сине-фиолетовые зоны. В средней части хроматограммы извлечений травы мелиссы и цветков липы выявляются сине-фиолетовая зона (цитраль) и выше нее
слабовыраженная голубая зона (цитронеллаль). Также на хроматограммах извлечений исходного ЛРС препарата Климасед выявляются и другие зоны.
На рисунке приведена хроматограмма определения эфирных масел в препарате Климасед в сравнении с веществами-маркерами.
Анализируя результаты хроматограммы, которая приведена на рисунке, можно сделать вывод, что в препарат Климасед переходят эфирные масла, которые характерны для исходного ЛРС: для травы шалфея — цинеол; для травы душицы — тимол; для травы мелиссы и цветков липы сине-фиолетовая зона, расположенная между зонами, что отвечают цинеолу и тимолу. Зоны веществ-маркеров и испытуемого образца были четко разделены, идентичны по цвету окрашивания, размещены параллельно, что свидетельствует о специфичности определения данных компонентов в готовом продукте.
Т
1 :
Хроматограмма определения эфирных масел в препарате Климасед в сравнении
со стандартными образцами: 1 — испытуемый раствор препарата Климасед; 2 — раствор сравнения (смесь цинеола и тимола), в порядке возрастания Rf
При определении робастности методики идентификации эфирных масел в препарате Климасед оценивали влияние условий проведения хроматографирования (сорбенты аналогичных пластин различных производителей, тип и насыщение хроматографической камеры, длина полосы разделения, разные условия высушивания) на конечный результат.
Установлено, что хроматограммы, полученные на пластинках производства Sorbfil и Merck, дают сопоставимые результаты и могут быть использованы при проведении анализа. Оптимальные условия хроматографирования приведены в методике.
При определении прецизионности полученных результатов, сравнивали соответствующие значения Rf маркерных веществ на хроматограмме препарата Климасед, полученные в разные дни, на разных пластинках.
Полученные результаты показали, что, при определении прецизионности результатов анализа, зоны, которые проявились на хроматограммах препарата Климасед, полученные в разные дни, на разных пластинках были четко разделены, идентичны по их количеству и окрашиванию. Метрологические характеристики определения зон (Rf) веществ-маркеров в испытуемом образце составили для цинеола: Rf сер. = 0,426; RSD = 2,26 %; для тимола: Rf сер. = 0,529; RSD = 1,91 %.
Валидированная методика определения эфирных маселв препарате «Климасед» приведена ниже.
Определение проводят методом ТСХ, с использованием ТСХ пластинок на силикагеле (Merck или Sorbfil), размером 5*15 см [3].
Испытуемый раствор: к остатку в колбе, полученному из 50 мл препарата «Климасед» после определения содержания этанола [3], добавляют петролейный эфир Р. К раствору эфирных масел в петролейном эфире Р, добавляют 5 г натрия сульфата безводного Р, взбалтывают на протяжении 5 мин и фильтруют через бумажный фильтр «красная лента». Полученный раствор упаривают на водяной бане при температуре 65-75 °С до объема 2 мл.
Раствор сравнения: 1 мг тимола Р и 2 мкл цинеола Р растворяют в ацетоне Р и доводят объем раствора ацетоном Р до 10,0 мл.
На линию старта хроматографической пластинки наносят 10 мкл испытуемого раствора (на расстоянии не менее 1,5 см от края) и 5 мкл раствора сравнения (на расстоянии 1,5 см). Пластинку с нанесенными пробами помещают в камеру со смесью растворителей толуол Р — этилацетат Р (19:1). Когда фронт растворителей пройдет 12 см от линии старта, пластинку вынимают из камеры и сушат на воздухе в вытяжном шкафу 10 мин. Пластинку опрыскивают ванилина реактивом Р, нагревают при температуре 100-105 °С в течение 35 мин и оценивают при дневном свете.
На хроматограмме раствора сравнения выявляются голубая зона (цинеол) и розовая зона (тимол).
На хроматограмме испытуемого раствора должны выявляться зона голубого окрашивания и зона розового окрашивания на уровне соответствующих зон на хроматограмме раствора-сравнения (цинеол и тимол), также должна выявляться зона сине-фиолетового окрашивания между цинеолом и тимолом. На хроматограмме испытуемого раствора могут выявляться и другие, менее выраженные зоны.
Выводы. Разработанная методика идентификации эфирных масел в лекарственном препарате Климасед соответствует требованиям Государственной фармакопеи Украины по основным валидационным показателям. Проведение идентификации эфирных масел, флавоноидов и алколоидов обеспечивают специфичность определения компонентов препарата Климасед при его стандартизации. Разработанные методики идентификации включены в «Методы контроля качества» при разработке аналитической нормативной документации на препарат.
Список литературы
1. Аналитическая химия в создании, стандартизации и контроле качества лекарственных средств : в 3-х т. на русском языке / Под ред. член.-кор. НАН Украины В. П. Георгиевского. — Изд. «НТМТ», 2011. — Т. 2. — 474 с.
2. Валидация аналитических методик для производителей лекарств : типовое руководство предприятия по производству лекарственных средств / Под ред. В. В. Береговых. — М. : Литтерра, 2008. — 132 с.
3. Державна фармакопея Украши / Державне пщприемство «Науково-експертний фармакопейний центр». — 1-е вид. — Харюв : Р1РЕГ, 2001. — 556 с. ; доп. 1, 2004. — 520 с. доп. 2, 2008. — 620 с. ; доп. 3, 2009. — 280 с.; доп. 4, 2011. — 540 с.
4. Сур С. В. Методолопя ощнки якост рослинних лiкарських засобiв на пiдставi результатiв, одержаних за допомогою сучасних аналiтичних методiв / С. В. Сур // Фармацевтичний журнал. — 2002. — № 6. — С. 64-71.
5. Яковенко В. К. Дослщження яюсного складу препарату комплексно! дп «Кшмасед» / В. К. Яковенко // Запорожский медицинский журнал. — 2011. — Т. 13, № 1. — С. 98-101.
6. Barnes J. Herbal Medicines / Barnes J., Anderson L., Phillipson D. — 3-rd ed. — L-n : PhP, 2007. — 710 p.
7. European Pharmacopoeia. - 6 th ed. — Strasbourg : Council of Europe, 2007. - 3261 p.
8. Reich E. Validation of High-Performance Thin-Layer Chromatographic Methods for the Identification of Botanicals in a cGMP / E. Reich, A. Schibli, A. Debatt // Journal of AOAC International. — 2008. — Vol. 91, N 1. — P. 13-20.
VALIDATION OF IDENTIFICATION TECHNIQUE OF ETHEREAL OILS IN VEGETABLE PREPARATION
KLIMASED
V. K. Yakovenko, E. A. Khokhlova
National pharmaceutical university (the Ukraine, Kharkov)
The identification technique of essential oils by a method of thin-layer chromatography is developed for the combined medicinal vegetable preparation Klimased. Optimum conditions for performing stratographic analysis are defined, validation characteristics — specificity, robust and precision are studied as a result of researches. Identity of essential oils in initial vegetable raw materials and essential oils as a part of a ready medicinal preparation is confirmed by the method of thin-layer chromatography. Validated technique of identification was included in «Methods of quality control» of medicinal preparation Klimased.
Keywords: essential oils, thin-layer chromatography, validation, medicinal vegetable raw materials, Klimased.
About authors:
Yakovenko Vladimir Konstantinovich — candidate of pharmaceutical sciences, assistant professor of industrial pharmaceutics and economy chair at National pharmaceutical university, Kharkov, the Ukraine, office phone: +38 (057) 757-55-49, e-mail: [email protected]
Khokhlova Ekaterina Aleksandrovna — assistant of chair of quality, standardization and certification of drugs at National pharmaceutical university, Kharkov, the Ukraine, office phone: + 38(057) 731-92-76, e-mail: [email protected]
List of the Literature:
1. Analytical chemistry in creation, standardization and quality control of correspondent member of NAS the Ukraine V. P. Georgiyevsky. — Prod. «NTMT», 2011. — V. 2. — 474 P.
2. Validation of analytical techniques for drugs producers: the sample guide of the enterprise to production of medicines / Under the editorship of V. V. Beregovykh. — M: Litterra, 2008. — 132 P.
3. State pharmacopeia of Ukraine / State enterprise «Scientific and Expert Farmakopeyny Center». — First look. — M: RIREG, 2001. — 556 P.; Additional 1, 2004. — 520 P., additional 2, 2008. — 620 P.; Additional 3, 2009. — 280 P.; Additional 4, 2011. — 540 P.
4. Sur S. V. Methodology of assessment of quality of herbal remedies on the basis of the results received by means of modern analytical methods / S. V. Sur // Pharmaceutical magazine. — 2002. — № 6. — P. 64-71.
5. Yakovenko V. K. Research of qualitative structure of «Klimased» complex action / V. K.Yakovenko // Zaporozhye medical magazine. — 2011. — V. 13, № 1. — P. 98-101.
6. Barnes J. Herbal Medicines / Barnes J., Anderson L., Phillipson D. — 3-rd ed. — L-n : PhP, 2007. — 710 p.
7. European Pharmacopoeia. - 6 th ed. — Strasbourg : Council of Europe, 2007. - 3261 p.
8. Reich E. Validation of High-Performance Thin-Layer Chromatographic Methods for the Identification of Botanicals in a cGMP / E. Reich, A. Schibli, A. Debatt // Journal of AOAC International. — 2008. — Vol. 91, N 1. — P. 13-20.
