CC BY
6
[гиена и санитария 6/2011
О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2011 УДК 614.72:616-056.43
Л. В. Хрипач, А. К. Маковецкая, В. Н. Федосеева, 3. И. Коганова, Е. В. Железняк, Т. Д. Князева, О. В. Миславский
УВЕЛИЧЕНИЕ СЫВОРОТОЧНОЙ АКТИВНОСТИ ДНКазы ПРИ ГИПЕРСЕНСИБИЛИЗАЦИИ К ПЫЛЬЦЕВЫМ АЛЛЕРГЕНАМ
ФГБУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А. Н. Сыеина Минзлравсоцразвития России, Москва
У жителей Москвы с аллергическими заболеваниями проведен факторный анализ перекрестной сенсибилизации к 24 распространенным аллергенам и корреляционный анализ взаимосвязи между показателями гиперчувствительности к аллергенам и биохимическими показателями состояния организма (интенсивность хемилюминесценции сыворотки, содержание SH-групп, активность лизосомальных ферментов). Найдена достоверная связь между содержанием в сыворотке специфических lgE-антител к пыльцевым аллергенам и активностью сывороточной кислой ДНКазы (г = 0,498; р = 0,009; п = 67). Выявленная закономерность может быть положена в основу разработки теста для дифференциальной диагностики поллинозов и свидетельствует о возможных различиях между бальными поллинозами и больными с другими аллергическими заболеваниями по уровню апоптоза и цитогенетических повреждений.
Ключевые слова: специфические lgE-антитела, факторный анализ, перекрестная сенсибилизация, окислительный стресс, лизосомальные ферменты, корреляционный анализ, поллинозы, ДНКаза
L. V. Khripach, А. К. Makovetskaya, V. N. Fedoseyeva, Z. I. Koganova, E. V. Zheleznyak, T. D. Knyazeva. О. V. Mislavskv — ENHANCED SERUM DNAASE ACTIVITY IN HYPERSENSITIZATION TO POLLEN ALLERGENS
Factor analysis of cross-sensitization to 24 common allergens and correlation analysis of the relationship between the hypersensitivity to the allergens and some biochemical markers (the intensity of serum chemiluminescence, the content of SH-groups, and the activity of lysosomal enzymes) of the health status were carried out in a sample of Moscow residents with allergic diseases. A significant correlation war found between the serum levels of specific IgE antibodies to pollen allergens and the activity of serum acid DNAase (R = 0.498; p = 0.009; N = 67). The revealed regularity may be used to devise a test for the differential diagnosis ofpollenoses and suggests that there are possible differences in the levels of apoptosis and cytogenetic damages between patients with pollenoses and those with other allergic diseases.
Key words: specific IgE antibodies, factor analysis, cross-sensitization, oxidative stress, lysosomal enzymes, correlation analysis, pollenoses, DNAase
Известно, что уровень цитогенетических повреждений у людей с хроническими аллергическими заболеваниями повышен [3, 8, 16]. В связи с этим представляет определенный интерес достоверная связь между содержанием в сыворотке крови специфических ^Е-антител к пыльцевым аллергенам и активностью сывороточной кислой ДНКазы (ДНКаза II, ЕС 3.1.22.1), найденная нами при обследовании жителей Москвы с аллергическими заболеваниями.
Представленные в данной статье результаты являются фрагментом плановой НИР лаборатории биохимии с группой иммунологии, основной задачей которой стало изучение влияния загрязнений городского атмосферного воздуха на биохимические и иммунологические показатели состояния организма жителей Москвы — как практически здоровых, так и имеющих хронические заболевания. При выполнении этой основной задачи был проведен и анализ взаимосвязи изучаемых медико-биологических показателей, позволяющий определить внутреннюю структуру разрабатываемой системы биомаркеров и уточнить механизмы влияния факторов окружающей среды на состояние здоровья населения. Результаты оценки взаимосвязей между показателями гиперчувствительности и другими показателями состояния имму-
Хрипач Л. В. — д-р биол. наук, зав. лаб. биохимии с группой иммунологии (Ikhripach@mail.ru); Маковецкая А. К. — канд. мед. наук, ст. науч. сотр. лаб. биохимии с группой иммунологии (imec@rarnbler.ru); Федосеева В. Н. — д-р биол. мук, проф., ст. науч. сотр. лаб. биохимии с группой иммунологии (уп08@ yandex.ru); Коганова 3. И. — канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. биохимии с группой иммунологии; Железняк Е. В. — мл. науч. сотр. лаб. биохимии с группой иммунологии (soltdog@mail.ru); Князева Т. Д. — канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. биохимии с группой иммунологии (katiana@mail.ru); Миславский О. В. — канд. фарм. наук, науч. сотр. лаб. биохимии с группой иммунологии (o.mislavsky@rambler.ru)
нитета у обследованных жителей Москвы с аллергическими заболеваниями опубликованы ранее [4].
Материалы и методы
Обследованы 67 жителей Москвы (28 мужчин и 39 женщин) в возрасте от 18 до 65 лет, страдающих аллергическими заболеваниями различной этиологии (бронхиальная астма, поллинозы, пищевая аллергия и т. д.). В пробах сыворотки у больных определяли содержание специфических IgE-антител к 24 наиболее распространенным аллергенам и ряд биохимических показателей состояния организма.
Содержание в сыворотке специфических IgE-антител определяли методом иммуноферментного анализа и выражали в общепринятых условных единицах (баллах), соответствующих классам скарификационных кожных проб. Использовали коммерческие препараты следующих аллергенов: пыльцевых (тимофеевка, береза, полынь), бытовых (домашняя пыль, клещи, Dermatophagoides farinae и Dermatophagoides pteronyssinus, бумажная пыль, перо, эпидермис кошки, эпидермис собаки), бактериально-грибковых (стафилококк Staph, aureus, плесневые грибы Aspergillus fu-migatus, Penicillum notatum, Candida albicans, Neisseria per-flavia), пищевых (молоко, яйцо, баранина, свинина, курица, рыба, цитрусовые плоды, гречка, рис, мука).
Определяли следующие биохимические показатели повреждения тканей организма:
• интенсивность люминолзависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ), индуцированной перекисью водорода [10, 11];
• содержание SH-групп по образованию окрашенного комплекса с дитионитробензойной кислотой [14];
• активность P-N-ацетилглюкозаминидазы по скорости расщепления пара-нитрофенил^-ацетилгюкозаминида [6];
• активность кислой ДНКазы по скорости образования продуктов гидролиза ДНК из тимуса теленка ("Sigma", кет. № D150I) [5];
• активность катепсина D по скорости расщепления гемоглобина ("Sigma", кат. № Н2625) [I].
Математический анализ результатов проводили с помощью компьютерной программы Statistica v. 7.0.
Результаты и обсуждение
Факторный анализ показателей сенсибилизации к изучавшимся аллергенам
На рис. 1 представлены результаты факторного анализа содержания специфических IgE-антител к 24 изучавшимся аллергенам у жителей Москвы с аллергическими заболеваниями. Факторный анализ позволяет быстро найти коррелирующие между собой переменные в большом объеме исходных данных, выделить их в виде отдельных факторов и классифицировать анализируемые переменные по их расположению на графиках факторных нагрузок. В данном случае график факторных нагрузок на рис. 1 имеет также и биологический смысл, поскольку сортировка показателей сенсибилизации по коэффициентам парной корреляции соответствует принятому в аллергологии понятию сравнения уровня их перекрестной сенсибилизации.
Явление перекрестной сенсибилизации между аллергенами одного и того же класса или разных классов объясняется наличием у перекрестно реагирующих белков общих антигенных детерминант и в настоящее время интенсивно изучается клиницистами-аллергологами путем определения доли пациентов с сенсибилизацией к обоим сравниваемым аллергенам — в частности, при сочетан-ных проявлениях пищевой аллергии и поллинозов [2, 7]. Многомерные методы математического анализа показателей сенсибилизации (факторный, кластерный, многомерное шкалирование) в аллергологии пока практически не используются, хотя они дают большой выигрыш по сравнению с исторически сложившимся подходом попарного сравнения переменных и позволяют за один шаг получить полную структуру взаимосвязей внутри изучаемого множества отдельных показателей.
Как это видно из представленного на рис. 1 графика факторных нагрузок, наиболее высокий уровень перекрестной сенсибилизации у лиц с аллергическими заболеваниями выявляли для бытовых аллергенов (домашняя пыль, клещи, эпидермис кошки и собаки), составивших ядро первого извлекаемого фактора. Второй извлекаемый фактор представлен пищевыми аллергенами с наиболее высоким уровнем перекрестной сенсибилизации между аллергенами зерновых культур (фечиха, пшеничная мука и рис). Несмотря на то что показатели гиперчувствительности вводили в факторный анализ как независимые переменные, на графике факторных нагрузок отчетливо видны четыре ареала экспериментальных точек, соответствующих принятому аллергологами разделению аллергенов на классы, внутри которых уровень перекрестной сенсибилизации выше, чем между классами.
Интересным нюансом полученных результатов является атипично высокая факторная нагрузка по второму (пищевому) фактору для содержания IgE-антител к Aspergillus fumigatus, который в отличие от остальных изучавшихся плесневых грибов поступает в организм с пищей — поврежденными плодами
граната, моркови и томатов. Это свидетельствует о том, что в развитии перекрестной сенсибилизации кроме сходства антигенных детерминант аллергенов большую роль играют наследуемые изменения проницаемости и других характеристик тканей-мишеней, определяющие индивидуальную чувствительность людей к определенным аллерго-опасным факторам.
Взаимосвязь показателей гиперсенсибилизации с биохимическими показателями состояния организма обследуемых лиц
Для проведения корреляционного анализа связей между показателями гиперчувствительности к аллергенам и биохимическими показателями состояния организма исходная система 24 маркеров гиперчувствительности была редуцирована, с тем чтобы избежать появления случайных достоверных связей из-за проблемы множественных сравнений Бонфсррони. В соответствии с общепринятой классификацией аллергенов и вышеприведенными результатами факторного анализа рассчитаны суммарные баллы содержания в сыворотке специфических ^Е-антител к пыльцевым, бытовым, бактериально-грибковым и пищевым аллергенам.
В таблице приведены коэффициенты корреляции между этими интегральными показателями сенсибилизации и биохимическими показателями состояния организма у обследованных лиц. Как это видно из таблицы, нз 20 изученных корреляционных связей только одна оказалась достоверной — между суммарным содержанием ^Е-антител к пыльцевым аллергенам и сывороточной активностью ДНКаз (г = 0,408; р = 0,009); соответствующее регрессионное уравнение с интервалами предикции показано на рис. 2. В то же время ни содержание ^Е-антител к пыльцевым аллергенам, ни уровень ^Е-антител к другим аллергенам (пищевые, бытовые и бактериально-грибковые) не коррелировали с сывороточной активностью других ли-зосомальных ферментов — Р-Ы-ацетилглюкозаминидазы и катепсина О (протеиназы), а также с показателями окислительного стресса (интенсивность хемилюминесценции сыворотки и содержание в ней БН-групп).
1 -,
0,8-
0,6-
0,4
0,2-
0-
-0,2-
-0,4
С Мука .Гречка •
Рис Цитрус
Рыба
Aspergillus
Курица
Баранина / /
• • * ■•■>■'
Молоко Свинина .,"/
Яйцо /
■ Полынь \ Тимофеевка
/ Staphylococcus i.....•••.....
.;Перо
Береза
.. Neisseria';'-.
Penicillum /
•
Candida./ 1 У Бумага
Собака"--... •• Кошка ДП1 •
Клещ •
ДП2
-0,2
-0,1
1
0,1
I
0,2
0,3
0,4 0,5
0,6
I
0,7
—I 0,8
Рис. 1. Результаты факторного анализа содержания специфических ^Е-антител к 24 изучавшимся аллергенам у жителей Москвы с аллергическими заболеваниями. По оси абсцисс — фактор 1: по оси ординат — факгор 2. Пунктиром выделены границы классов аллергенов (слева направо: пищевые, пыльцевые, бактериально-грибковые, бытовые аллергены). ДП1, ДП2 — два коммерческих препарата аллергенов домашней пыли.
^игиена и санитария 6/2011
Коэффициенты корреляции между содержанием в сыворотке специфических ^Е-аитител н биохимическими показателями состояния организма у жителей Москвы с аллергическими заболеваниями (п = 67)
Биохимические показатели сыворотки, M±Sl>') Содержание в сыворотке специфических IgE-антител, баллы'0
к пыльцевым аллергенам (0-6) к бытовым аллергенам (0-13) к аллергенам грибов (0-5) к пищевым аллергенам (0-14)
Лизосомальные ферменты:
B-N- ацетилглюкозаминидаза 27,3 ± 13,9 нмоль/мин/л г = 0,126; р = 0,364 г- -0,192; р = 0,164 /- =-0,089; р = 0,519 г =-0,244; р = 0,075
Катепсин D 2,98 ± 1,72 нмоль/мин/мл г = 080; р = 0,621 г = 0,113;/» = 0,483 г = 0,056; р = 0,734 г = 0,089; р = 0,579
ДНКаза 2,76 ± 0,39 мкмоль/мин/мл г = 0,408; р = 0,009 г =-0,062; р = 0,702 г = -0,088; р = 0,588 г = -0,106; р = 0,515
интенсивность ЛЗХЛ 5,04 ± 0,30 имп/мин"
содержание 5Я-групп 346 ± 69 нМ
г = -0,204; /> = 0,118 г = 0,004; р = 0,983
г = 0,066; р = 0,616 г = -0,308; р = 0,068
г = 0,232; р = 0,075 г = -0,027; р = 0,877
/■ = 0,180; р = 0,168 г = -0,159; р = 0,353
Примечание." — среднее значение ± стандартное отклонение; 61 — в скобках указаны диапазоны изменения показателя в данной выборке (минимум—максимум); ■> -— десятичные логарифмы исходных значений.
Известно, что пыльца представляет собой зародышевые клетки с высоким содержанием ДНК, РНК и катаболических ферментов — протеиназ, ДНКаз и РНКаз. Некоторые из очищенных аллергенов пыльцы оказались не структурными белками, а каталитически активными катаболическими ферментами; в частности, показано, что Р-экспансины луговых трав относятся к классу папаинзависимых протеиназ, а основной аллерген тимофеевки Phi р Vb —к классу РНКаз [13, 15].
Обнаруженный нами эффект повышения сывороточной активности ДНКазы в крови у больных поллинозами с достоверной связью между активностью ДНКазы и содержанием в крови специфических пыльцевых IgE-антител до сих пор не описан. Возможны два способа интерпретации этого эффекта:
• в кровь больных поллинозами попадают ДНКазы пыльцы;
DNAse=2,6198+0,1277х; 0,95 Pred.lnt.
о-1 •-2
Рис. 2. Достоверная рорессионная связь между суммарным содержанием специфических ^Е-антител к пыльцевым аллергенам (в баллах) и сывороточной активностью ДНКаз (в мкмоль/мин на I мл сыворотки) у жителей Москвы с аллергическими заболеваниями. По оси абсцисс — специфические ^Е-антитела; по оси ординат — ДНКаза.
Сплошная линия — линейная аппроксимация, пунктирные — интервалы предикции.
• в кровь больных поллинозами попадают фрагменты ДНК пыльцы, в ответ на присутствие которых фагоциты секре-тируют собственные лизосомальные ДНКазы. Выявленная закономерность может быть положена в основу разработки дополнительного теста для дифференциальной диагностики поллинозов и представляет интерес с точки зрения генетической токсикологии. Присутствие в тканях организма повышенной активности внеклеточных ДНКаз теоретически может влиять на процессы, связанные с повреждением ДНК и апоптозом. Известно, что эндонуклеазы играют одну из главных ролей в программируемой гибели клеток при формировании тканей, старении и других физиологических процессах. В частности, высокоактивные эндонуклеазы пыльцы обеспечивают процессы гаметогенеза и параллельно протекающих изменений в близлежащих тканях растения [19, 20]. Опубликованы данные о противоопухолевых эффектах очищенных ДНКаз и РНКаз различного происхождения в опытах на животных и культурах опухолевых клеток, в том числе ну-клеаз, выделенных из пыльцы сосны Pinus negra [17, 18].
В то же время поллиноз до сих пор не изучен цитогене-тиками как отдельная нозологическая форма. Как правило, цитогенетическне исследования проводятся среди больных атонической бронхиальной астмой или в смешанных выборках; данные по сравнительному анализу уровня повреждения хромосом у пациентов с поллинозами и больных другими аллергическими заболеваниями пока не опубликованы. Для исследований в этом направлении оптимальными являются методы оценки генетических повреждений в клетках тканей-мишеней пыльцевых аллергенов — назального и буккаль-ного эпителия, которые активно разрабатываются в нашем институте [3, 9, 12].
Л итература
1. Алексеенко Л. П. // Современные методы в биохимии. — М., 1977, —С. 205—215.
2. Балаболкин И. И., Соснина О. Б., КсензоваЛ. Д. и др. // Педиатрия. — 2010. — Т. 89, № 4. — С. 28—31.
3. Бяхова М. М. Сычева Д. П.. Ревазова Ю. А. и др. // Вести. Рос. Восн.-мед. акад. — 2008. — № (23), прил. 2, ч. 1. — С. 35—36.
4. Маконецкая А. К., Федосеева В. Н„ Миславский О. В. II Гиг. и сан. —2010, —№ 1, —С. 11—12.
5. Покровский А. А., Арчаков А. И., Любилщева О. Н. // Биохимия. — 1967. — Т. 32, № 4. — С. 824—827.
6. Покровский А. А., Кравченко Л. В.. Тутельян В. А. II Биохимия. — 1971. — Т. 36, № 4. — С. 690-696.
7. РаманюкЛ. И., Кузнецова Л. В. // 1ммунол. та алергол.: наука i практика. — 2009. — № 4. — С. 69—72.
8. Семенов А. В., Пигалов А. П., Семенов В. В., Кошпаева Е. С. //Пульмонология. — 2004. — № 1, —С. 105—109.
9. Сычева Л. П., Иванов С. И., Коваленко М. А. и др. // Гиг. и сан, —2010,—№ 1. —С. 7—10.
10. Хрипач Л. В. // Гиг. и сан. — 2002. — № 2. — С. 72—76.
11. Шестаков В. А., Бойчевская Н. О., Шерстнев М. П. // Вопр. мед. химии. — 1979. — № 2. — С. 132—137.
12. Юрченко В. В., Кривцова Е. К., Подольная М. А. // Гиг. и сан. — 2008. — № 6. — С. 53—56.
13. Bufe A., Schramm G.. Keown М. S. et al. // FEES Lett. — 1995. — Vol. 363. —P. 6—12.
14. Ellman G. L. II Arch. Biochem. — 1959. — Vol. 82. — P. 70— 77.
15. Grobe K., Becker W M„ Schlaak M.. Petersen A. II Eur. J. Biochem. — 1999. — Vol. 263. — P. 33—40.
16. Herrström P., Brau /., Holmen A.. Högstedt B. II Mutat. Res. — 1998. — Vol. 405, № 1. — P. 35-40.
17. Lipovova P.. Podzimek T., Orctova L. et al. II Neoplasma. — 2008. — Vol. 55, № 2. — P. 158—164.
18. Makarov A. A., Ilinskaya O. N. // FEES Lett. — 2003. — Vol. 540, — P. 15—20.
19. Xu K, Hanson M. R. II Plant Physiol. — 2000. — Vol. 122. — P. 1323—1333.
20. Zaina G., Morassutti C„ De Amicis F. et al. // Gene. — 2003. — Vol. 15. — P. 43—50.
nociyniui« 15.54.11
О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ. 2011 УДК 616.8-053.31-02:615.91.092.9
В. С. Рукавишников, Л. М. Соседова, Е. А. Капустина
ОЦЕНКА БИОЛОГИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ ДЕЙСТВИЯ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ НА ПОТОМСТВО БЕЛЫХ КРЫС
Ангарский филиал УРАМН ВСНЦ экологии человека СО РАМН — НИИ медицины труда и экологии человека, Ангарск
Представлены результаты экспериментальных исследований влияния интоксикации белых крыс-самцов ви-нилхлоридом uiu сулемой на функционачьное состояние нервной системы их потомства. У новорожденного потомства выявлено отставание развития сенсорно-двигательных реакций. У половозрелого потомства установлено нарушение целостной структуры поведения, характеризующееся изменением двигательной активности, ориентировочно-исследовательских реакций и тревожности. Обнаружены нарушения проведения импульса в нервно-мышечном аппарате задних конечностей белых крыс и морфологические изменения структуры нервной ткани.
Ключевые слова: белые крысы, виничхпорид, сулема, потомство, нервная система
V. S. Rukavishnikov, L. М. Sosedova, Е. A. Kapustina — EVALUATION OF THE BIOLOGICAL EFFECTS OF CHEMICAL SUBSTANCES ON ALBINO RAT OFFSPRING
The paper provides the results of experimental studies of the impact of vinyl chloride or sublimate intoxication in male albino rats on the functional state of the nervous system of their offspring. Retarded sensorimotor development was revealed in the neonatal offspring. The pubertal offspring showed behavioral pattern disintegrity that was characterized by changes in motor activity and orientative-exploratory responses and by anxiety. There was abnormal impulse conduction in the neuromuscular apparatus of the hind legs of albino rats and morphological changes in the structure of nervous tissue.
Key words: albino rats, vinyl chloride, sublimate, offspring, nervous system
В настоящее время изучено влияние на репродуктивную функцию только 8% токсикантов [4]. Чрезвычайно важной и актуальной на современном этапе становится проблема проявления воздействия химических токсикантов в последующих поколениях [4, 10].
С данной проблемой тесно переплетаются вопросы изучения в популяции мутационного груза, характеризующего частоту наследственно обусловленной патологии, связанной с влиянием факторов окружающей среды. Разработка подходов к оценке мутационного груза — одна из основных задач при определении реальной мутагенной нагрузки на население. Чувствительные к средовым факторам структурные нарушения хромосом в половых клетках будут сказываться и фенотипически проявляться в следующих поколениях потомков [10]. Генетическое типирование с целью анализа по-пуляционной структуры предусматривает изучение мутаций у большого числа индивидуумов с помощью достаточно трудоемких методов, позволяющих обнаружить специфические изменения в структуре ДНК картированием с использованием редуктаз, изучения белков методами двухмерного электрофореза и др. [2, 8]. Значение для мониторинга мутаций в половых клетках имеют так называемые сторожевые фенотипы, характеризующие клиническое проявление мутантно-го гена у индивидуума, рожденного от здоровых родителей. Большинство медицинских генетиков сходятся во мнении о наличии около 40 нарушений, рассматриваемых в качестве
"сторожевых". К последним относятся врожденная катаракта, полидактилия, ахондроплазия и др. [8].
Вместе с тем к индикаторным фенотипам, помимо "сторожевых", диагностика которых сопряжена с рядом объективных и субъективных трудностей, могут быть отнесены и нарушения психоневрологического статуса. Нервная система, являясь интегральной, одна из первых реагирует на малейшие изменения физиологических функций организма и, по нашему мнению, в полной мере характеризует функциональное состояние в целом. Распространенность нервно-психических нарушений в популяции может быть использована для идентификации генетических нарушений в половых клетках, возникающих при воздействии химических факторов среды. Высказать данную гипотезу позволяют результаты собственных исследований [6, 11] и данные литературы [3, 7], анализ которых дал основание предположить наличие химического мутационного груза у последующих поколений, родители которых подвергались неблагоприятному химическому воздействию. Для подтверждения этой гипотезы проведены экспериментальные исследования, цель которых — изучение влияния интоксикации промышленными химическими факторами (винилхлорид и
Рукавишников В. С. — чл.-кор. РАМН, проф., д-р мед. наук, дир. (IMT@IRMAIL.RU); Соседова Л. М. —д-р мед. наук, проф., зав. лаб. токсикологии (IMT@IRMAIL.RU); Капустина Е. А. — канд. мед. наук, науч. сотр. лаб. токсикологии (tox lab@mail.ru)
