CC BY
149
В.А. Калюжин
УТИЛИЗАЦИЯ ТЕХНОГЕННЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ АБОРИГЕННОЙ МИКРОФЛОРОЙ
Актуальна проблема детоксикации отходов и утечек техногенных органических соединений. Рассматривается возможность биологической утилизации органических соединений алифатического, карбоциклического и гетероциклического рядов представителями естественной микрофлоры загрязненных ценозов. Результаты работы апробированы в промышленных масштабах в естественных климатических условиях. Установлен состав и количество факторов веществ, оптимизирующих процесс очистки. Отмечен ряд растений, эффективных для восстановления растительного покрова мест загрязнений.
Ключевые слова: автоселекция; нефтезагрязненная территория; детоксикация отходов; очистка; нефтеусваивающие микроорганизмы.
Существует большое количество производств, где используют и вырабатывают различные органические вещества. Так, например, на нефтеперерабатывающих и нефтехимических производствах нефть и природный газ перерабатываются в нефтепродукты, спирты, альдегиды, карбоновые кислоты, арены, терпены, нефтяные фуран, пиридин и другие соединения. На фармацевтических предприятиях и предприятиях бытовой химии вышеперечисленные органические вещества подвергаются дополнительной переработке, что приводит к расширению перечня производимых органических веществ. Так как в органической химии почти ни одна реакция не протекает с теоретическим выходом целевого продукта, то на предприятиях органического синтеза неизбежно образование отходов, которые необходимо утилизировать. Кроме того, на подобных предприятиях возможна их утечка с последующим загрязнением окружающей среды.
Целью работы является изучение возможности утилизации органических веществ алифатического, карбо-циклического и гетероциклического рядов естественной микрофлорой загрязненных территорий.
Материалы и методы
В проделанной работе проводилась биологическая деструкция следующих органических соединений:
1. Соединения алифатического ряда: углеводородная составляющая нефти и нефтешламов российских и вьетнамских месторождений, одноатомные спирты, эфиры, соединения с одной трехатомной функцией (карбоновые кислоты, сложные эфиры кислот, пищевые жиры и масла), соединения с двумя и большим числом функций (гликоли, многоатомные спирты и их эфиры, углеводы и их полимеры).
2. Карбоциклические соединения: ароматические соединения (бензол, толуол, ксилолы, фенол, метилфе-нолы, ди-триоксифенолы, ароматические эфиры, кето-ны, полициклические соединения), алициклические соединения и их производные (нафтены, терпены, циклические спирты).
3. Гетероциклические соединения: пяти-, шестичленные и полициклические гетероциклы - фуран, тио-фен, пиридин, хинолин и др.
Данные вещества в составе питательных сред выступали в роли единственного источника углерода и энергии в составе разработанных комплексных питательных сред, содержащих, кроме азота, фосфора и калия, набор микроэлементов (Бе, Си, 2п, Со, Мо, Мп,
V, В). В экспериментах изучали утилизацию как отдельных соединений, так и их смесей. Культивирование микроорганизмов, осуществляющих деструкцию приведенных соединений, проводилось в периодическом культивировании (на плотной и жидкой среде) и непрерывном режимах (в хемостате и турбидостате в аэробных условиях). Для изучения способности микро-боценноза к азотфиксации проведен ряд экспериментов без внесения дополнительных источников азота в состав питательных сред (патент). В экспериментах использовалась естественная микрофлора, выделенная из активного ила очистных сооружений, нефтезагрязнен-ных грунтов, сточных вод химических предприятий и др.). В экспериментах были использованы среды с концентрацией нефти и нефтепродуктов от 10 г до 400 г/кг грунта, высушенного до постоянного веса.
Количественное определение содержания органических веществ проводилось с помощью методов инфракрасной спектрометрии, перманганатометрии и гравиметрического анализа [1-3].
После завершения биодеструкции органических веществ проводилось биотестирование очищенных объектов. В качестве объектов биотестов использовались представители флоры и фауны: хлорелла, представители семейства злаковых, гречишных, бобовых, сложноцветных (20 видов), простейшие, дождевые черви, дрозофилы, рыбы, лягушки, крысы.
Опыты проводили с 5-10-кратным повтором.
Результаты и обсуждения
В проделанной работе было установлено, что все перечисленные органические соединения усваиваются микроорганизмами в виде источника углерода и энергии. В результате работы разработаны способы дезактивации некоторых соединений, в частности углеводородов нефти, которые доведены до уровня промышленного внедрения. Так, в различных регионах России и СНГ по разработанным технологиям удалось очистить от нефти и нефтепродуктов несколько сот гектаров замазученных территорий.
Анализ загрязненных территорий показал высокое содержание естественной микрофлоры в грунте, что позволило провести работы по селекции с целью выделения наиболее эффективных деструкторов нефти. Селекция велась в протоке на установке, работающей в режиме хемостата. Скорость протока ступенчато повышалась с 0,01 до 0,1 ч-1.
В предварительных опытах была установлена азот-фиксирующая активность микрофлоры. Однако эффек-
тивность этого процесса оказалась недостаточной для поддержания скорости протока выше, чем 0,02ч-1. Вместе с тем было выявлено, что абсолютным лимитирующим фактором является источник фосфора: в средах, где источник фосфора отсутствовал, прироста биомассы не отмечалось. В свою очередь, явная зависимость по источнику калия отмечалась при его концентрациях меньше 10-3 М. Утилизация нефти существенно зависела от концентрации кислорода в среде: индукция дыхательной активности наблюдалась при содержании кислорода в среде более 10-4 М.
Экспериментальным путем было установлено, что в пересчете на молекулярный азот потребляется на деструкцию 1кг нефти: карбомида 8-16 г, или нитрата натрия 10-20 г, или сульфата аммония 10-20 г. В свою очередь, аммиачной селитры, представителя смешанной формы азота, потребляется 6-8 г. Потребность в калии в пересчете на К20 и фосфора в пересчете на Р205 составляет 1-2 г.
Полученная в хемостате наиболее активная группа нефтеусваивающих микроорганизмов, после проверки на патогенность, выращивалась на микробиологической плантации. При специальной обработке за 1015 сут из небольшого количества инокулята (50-100 г) можно вырастить 1-2 т микроорганизмов [4, 5].
Необходимым элементом обработки является вспашка загрязненного участка. Вспашку необходимо проводить одновременно с внесением всех компонентов. Тем самым достигается перемешивание внесенных веществ с грунтом и обеспечивается аэрация за счет снижения гравиметрической плотности. Используя эти принципы, можно в приполярных регионах за летний период снизить содержание нефти до нормативного уровня.
На очищаемых территориях также необходимо восстанавливать растительный покров. Было установлено, что фитотоксичность нефти зависит от возраста разлива. Так, при посеве на свежий разлив, возраст которого 1-10 сут при содержании нефти свыше 12% по весу от сухого веса торфа, отмечается полная гибель семян растений. При меньшем содержании нефти семена прорастают. Были выделены две основные группы растений, толерантных к нефти: в первую группу входят пырей сизый, донник белый, костер прямой, полевица белая. Их всходы появляются через 5-7 сут после посева при температуре 10-15°С. Вторая группа - много-колосник ситниковый, щавель кормовой, гречиха многолетняя, житняк гребенчатый, пырей даурский, галега. Их всходы появились через 8-12 сут.
На разливах, находившихся при температуре
+10 15 °С в течение 75 сут, установлено образование
проростков при содержании нефти до 25%. Проросли семена следующих видов: многоколосник ситниковый, щавель кормовой, пырей сизый, костер прямой, овес. Было установлено, что летом на разливе из нефти за 70-80 сут испарились углеводороды с содержанием углерода до С16 и температурой кипения ниже 350°С. В дополнительных опытах было установлено, что именно низко и средне кипящая фракция нефти обладает максимальной фитотоксичностью.
На опытной территории также были проведены опыты по восстановлению древесных форм. Проводи-
лась посадка черенков представителей рода Betula, Ca-lex, Picea, Abies, Populus. Установлено, что через 1520 сут после посадки черенки ивы дали свежие побеги и сформировали корневую систему. Тем самым была показана возможность восстановления древостоя на рекультивируемых территориях растений. Представители других родов погибли.
В дополнительных опытах проводили восстановление растительности в водоемах. После рекультивации водоема вносили как представителей однолетних водорослей, так и высших цветковых форм. Была установлена удовлетворительная приживаемость изученных видов. С целью улучшения среды обитания растений в грунт и воду вносили также микроэлементы в различной дозировке. Однако дополнительная добавка ионов Zn, Fe, Co, Mn, Mo не дала значимого прироста биомассы. Очевидно неочищенная нефть уже содержит микроэлементы.
Особый интерес представляет процесс биодеградации нефтешламов.
К нефтешламам относят некондиционные нефтесодержащие или углеводородосодержащие смеси. Источниками нефтешламов являются:
1. Нефтезагрязненные грунты на кустовых и других промышленных площадках.
2. Грунты, пропитанные нефтью после аварий на нефтепроводах.
3. Донные осадки в нефтенакопительных резервуарах.
4. Твердые или текучие отходы нефтеперерабатывающих и нефтехимических предприятий.
5. Нефтешламы обычно вывозят в шламохранили-ща, где их сжигают или захоранивают.
Однако нефтешламы можно перерабатывать, переводя их в экологически безопасное состояние. Одним из таких способов является биологическая переработка. Поскольку состав и физические характеристики неф-тешламов различны, то для проведения работ по био-ремидиации разработан ряд мероприятий, приводящих к инактивации факторов загрязнителей. В состав изучаемых нефтешламов входили следующие компоненты: углеводороды (нефть, нефтепродукты), вода, соли щелочно-земельных и щелочных металлов из пластовых вод, механические минеральные примеси естественного или технологического происхождения, тяжелые металлы.
Разработаны и использованы на практике способы очистки шламосодержащего грунта непосредственно на технологических площадках, без вывоза с территории:
1. Кустовые площадки. Работа проводилась на 25 кустовых площадках ОАО «Томскнефть» в 2001 г.
2. Нефтебазы. Работы проводились в 1997 г. на двух нефтебазах ОАО «Новосибирскнефтепродукт». Площадь территории 0,9 га.
Разработан способ очистки грунта без вывоза на местах аварий на нефтепроводах. За период 19862002 гг. в качестве апробации очищено более 300 га поверхностного грунта в различных регионах России. Разработан способ очистки высоковязких нефтепродуктов на микробиологических полигонах. Работы проводятся с 1989 г. по настоящее время в различных регионах России.
Разработанные способы позволяют проводить разложение нефтешламов, различающихся по следующим признакам: вязкости, засолённости, природы механических примесей, наличия тяжёлых металлов.
Способ сводится к использованию адаптированных аборигенных культур микроорганизмов. За летний период (50-70 сут) удаётся понизить содержание углеводородов с 200-300 г/кг почвы до 5-10 г/кг. Рекультивация возможна без вывоза грунта с промышленных площадок без остановки производственного процесса. При необходимости вывоза нефтешлама рекультивацию проводят и на специальных полигонах. На 1 га плантации возможна очистка за летний период до 1000-1500 т нефтешлама. Себестоимость очистки 1 т нефтешлама составляет 200-500 руб. Такие площадки могут работать в непрерывном режиме с постоянным удалением очищенного грунта и замещением его загрязнённым. Для поддержания биологической активности возможен подогрев очищаемого нефтешлама. Для удаления тяжелых металлов из нефтешлама используются методы фиторекультивации, обеспечивающие перенос тяжелых металлов в биомассу растений. Собранные растения высушиваются и сжигаются. Золу либо захоранивают в бетонных блоках, либо проводится экстракция цветных металлов. Очищенный грунт, на определенном этапе насыщенный нефтеусваивающими микроорганизмами, может использоваться для обработки нефтяных разливов. Этот способ нами разработан и используется с 1989 г.
Вместе с тем некоторые органические вещества, в отличие от нефти, не удается напрямую разлагать микроорганизмами. К числу таких веществ относится формальдегид. Для дезактивации формальдегида было разработано два подхода. В одном из них формальдегид трансформируется за счет реакции альдольной конденсации в смесь простых сахаров, в другом превращается в гексаметилен-тетраамин за счет взаимодействия с ионами МН4+.
Реакцию альдольной конденсации проводили между водным раствором формальдегида и известковым молоком, где действующим веществом является Са(0Н)2. Концентрация формальдегида составляла 1-100 г на 1 л в пересчете на чистое вещество. При температуре +20_30°С реакция завершалась за 30-60 ч. Конечные продукты реакции относятся к группе сахаров, которые после нейтрализации избытка Са(0Н)2 атмосферным С02 легко усваиваются микроорганизмами.
Проведена автоселекция аборигенных представителей микрофлоры по признаку скорости размножения на средах, содержащих продукты альдольной конденсации формальдегида. Селекция велась в протоке, в режиме турбидостата, при температуре 20°С и рН=6,8 в условиях глубинной аэрации. Концентрация источника углерода и энергии составляла 1 г/л. Концентрация биомассы в ферментере составляла 20 мг/л в пересчете на сухой вес. Исходным объектом селекции была аборигенная полиморфная, по видовому составу, культура. Изначально удельная скорость роста составляла
0,085 ч-1. По истечении 10 сут была достигнута стабильная скорость 0,33 ч-1, что свидетельствует о высокой активности культуры.
При втором способе предварительной обработки формальдегида использовались неорганические соли
аммония. При смешивании расчетных количеств формальдегида и солей аммония (МН4М03; КН4С1; (КН4)2804; (КН4)2НР04) получались представитель гетероциклических соединений - гексамитилентетрамин (уротропин) и соответствующая кислота. Оптимальным веществом для предварительной обработки формальдегида, как было установлено в опытах, является гидрофосфат аммония.
При этом решаются три задачи:
1. Дезактивируется формальдегид.
2. Сохраняется оптимальный уровень рН среды.
3. Достигается обеспечение культуры источником фосфора.
В отличие от раствора КН40Н, который также сохраняет оптимальный рН среды, гидрофосфат аммония является твердым веществом, что облегчает его транспорт и не требуется предохранительных мер, необходимых при работе с аммиаком. В свою очередь, образующийся в результате реакции уротропин утилизируется микроорганизмами.
Биологическая утилизация индивидуальных органических веществ, относящихся к алифатическому, гетероциклическому и карбоциклическим рядам, при концентрации их 0,1-1%, в присутствии источников азота, полностью завершается в течение 4-20 сут. при 20°С. Оптимальными источниками азота являются соли аммония и мочевина. При использовании нитратного азота процесс утилизации замедляется на 20-30%.
Вместе с тем в ряде случаев среды бывают загрязненные смесью различных соединений. Нами была проведена работа по изучению биологической утилизации смеси веществ в водной среде. В состав смеси входили: метанол, изопропиловый спирт, бутанол-2, амиловый спирт, диоксан. Долевые концентрации веществ были одинаковы. Определяли зависимость прироста биомассы микроорганизмов и энергетические расходы на биосинтез их биомассы.
Продолжительность опыта составляла 21 сут. Результаты представлены в табл. 1.
Т а б л и ц а 1
Влияние смеси спиртов и диоксана на рост микроорганизмов
Концентрация смеси веществ, % Концентрация биомассы, г/л Расход энергии на прирост 1 г сухой биомассы, кДж
2 0,86 1635
4 0,41 3430
8 0,062 22580
Из представленных результатов следует, что в интервале концентраций 4-8% наблюдается ингибирование прироста биомассы и возрастают непроизводительные расходы энергии. При этом процесс утилизации органических веществ завершен, т.к. в жидкости после отделения биомассы не было обнаружено присутствие неиспользованных веществ.
Для определения пороговых концентраций, при которых возможна утилизация смеси органических веществ, были проведены опыты с более широким перечнем веществ. Изучалась смесь следующих веществ: этиловый спирт, этиленгликоль, монометиловый эфир этиленгликоля, моноэтиловый эфир этиленгликоля,
ацетон, фенол, диоксан, глицерин, циклогексанол, изоамилацетат, этилацетат, ацетат, цитрат. Долевые концентрации веществ в смеси были одинаковы. Было установлено, что утилизация смеси органических веществ возможна до концентрации 6,4% включительно. При концентрации 8%, роста культуры в опыте, продолжительностью 100 сут, не было отмечено. Очевидно, что, как и в первом опыте, концентрация 8%, является ингибирующей.
Биологическая утилизация органических соединений приводит к очистке водных сред и грунтов от веществ-загрязнителей. Однако при очистке больших объемов необходимо внесение значительного количества источников азота. Неиспользованные в процессе рекультивации источники азота загрязняют очищаемые среды ионами КН4+ и N03. Если исключить из набора веществ, стимулирующих активность микрофлоры, источники азота, то это не только повысит экологическую чистоту проводимых мероприятий, но и снизит себестоимость работ. Это возможно, если микроорганизмы проявляют азотофиксирующую активность.
Были проведены опыты по изучению возможности утилизации органических веществ в средах, не содержащих источник азота.
Эксперименты проводилась в жидких средах при температуре 20...25°С и рН=7. Минеральные добавки содержали источники фосфора, магния, калия и микроэлементы. Измеряемым показателем была концентрация биомассы. Расчетным путем определяли расход энергии на синтез биомассы. Источниками углерода и энергии служили такие вещества, как этиленгликоль, ацетат, пропиловый спирт, фенол, глицерин, этанол, бутанол-2, амиловый спирт, цитрат, сахароза, а также смесь перечисленных спиртов. Концентрация каждого вещества, за исключением фенола, составляла 2%. Концентрация фенола составляла 1 г/л. Было установлено, что во всех вариантах без внесения источника азота наблюдается рост микроорганизмов. Энергетические затраты на синтез 1 г биомассы в расчете на сухой вес представлены в табл. 2.
Т а б л и ц а 2 Энергетические затраты на синтез биомассы в условиях азотфиксации
Из представленных результатов следует, что энергетические расходы на синтез биомассы, на смеси спиртов в 2 раза выше, чем на средах с источником азота (табл. 1). Вместе с тем энергетические расходы на синтез биомассы на каждом из спиртов в отдельности значительно выше, чем на их смеси. В свою очередь
большие расходы энергии на биосинтез являются положительным моментом при проведении работ по очистке различных сред от загрязнителей, т.к. при этом снижается риск вторичного загрязнения избыточной биомассой.
На качественном уровне проведены опыты по изучению возможности азотфиксации на более сложных смесях органических веществ. Изучалась смесь органических веществ в воде следующего состава: этанол, этиленгликоль, ацетон, фенол, диоксан, циклагексанол, изоамилацетат, этилацетат, моноэтиловый эфир эти-ленгликоля, нафталин, толуол, орто- и метаксилол, цитрат натрия, ацетат натрия. Долевое содержание всех веществ было одинаково. Установлено, что микрофлора развивается на данной смеси, если суммарная концентрация веществ не превышает 6% по весу, что на несколько порядков выше, чем уровень ПДК для каждого из перечисленных веществ. Тем самым было показано, что аборигенная культура микроорганизмов способна утилизировать большой перечень органических веществ как в условиях обеспеченности источником азота, так и за счет азотфиксации.
В дополнительных опытах проверялась возможность утилизации органических веществ в условиях засоленности. В качестве источника засоленности использовалась вода мирового океана. Установлено, что утилизация органических веществ и их смесей беспрепятственно протекает и в соленой воде как при введении источника азота, так и за счет азотфиксации.
В следующей серии опытов изучалось разложение изделий, основой которых является полисахарид - целлюлоза. Объектом исследований были: бумага газетная, бумага писчая, хлопчатобумажная ткань, древесина. Деструкция проводилась в водной среде, измеряемым показателем было уменьшение веса объекта; расчетным путем определяли время полураспада изучаемых изделий. Для активации аборигенной микрофлоры использовались минеральные добавки, содержащие источники фосфора, калия, магния. В одной серии опытов добавлялся источник азота, в других - без источника азота. Использовались следующие источники азота: нитратный №N0^ аммонийный - (N^^80^ амидный - (МН2)2С0. Опыты проводились при 20...25°С в течение 21 сут. Результаты представлены в табл. 3.
Т а б л и ц а 3
Влияние условий опыта на период полураспада изделий
Вид изделия Период полураспада в сутках
Без источ- ника азота (ВД^СО (N^>2304 NN03
Бумага писчая 26 238 30 40
Бумага газетная 67 188 90 39
Х/б ткань 292 219 113 148
Древесина 72 103 219 210
Из представленных данных следует, что биодеструкция таких изделий, как бумага писчая и древесина, наиболее быстро протекает в средах без источника азота, очевидно, благодаря азотфиксации. Распад хлопчатобумаж-
Источник углерода и энергии Расход энергии на синтез 1 г биомассы, кДж
Этиленгликоль 20100
Ацетат натрия 14900
Пропанол 12440
Фенол 10920
Глицерин 9900
Этанол 9500
Бутанол-2 7400
Амиловый спирт 7370
Цитрат натрия 4300
Смесь спиртов 3250
Сахароза 1230
ной ткани лучше всего активизируется сульфатом аммония. Газетная бумага наиболее быстро разлагается в присутствии нитратного азота. Очевидно, если необходимо проводить деструкцию смеси целлюлозосодержащих материалов, то необходимо внесение в виде источников азота NaN0з или (ЫИ4)2804 и недопустимо внесение мочевины.
В следующей серии опытов проводили деструкцию композиционных упаковочных водонепроницаемых материалов. Данные материалы представляли бумагу, покрытую либо алюминиевой фольгой, либо полиэтиленом. Выделенные нами культуры во
влажной среде за 15-20 сут полностью разрушали бумажный слой.
Были проведены работы по биодеструкции искусственных полимерных систем. Так, разработан способ удаления лакокрасочных покрытий, нанесенных на алюминий и нержавеющую сталь. После обработки выделенными культурами, через 10-20 сут происходило отслаивание покрытия с 70-90% площади. При этом происходила частичная деструкция полимерной основы красок.
Таким образом, органические вещества произвольного состава могут быть утилизированы и обезврежены аборигенной микрофлорой.
ЛИТЕРАТУРА
1. Пискарева С.К., Барашков К.М., Ольшанова КМ. Аналитическая химия. М.: Высшая школа, 1994. 384 с.
2. Васильев В.П. Аналитическая химия. М.: Высш. шк., 1989. 275 с.
3. ЛурьеЮ.Ю. Справочник по аналитической химии. М.: Химия, 1989. 573 с.
4. Калюжин В.А. Способ очистки воды и почвы от загрязнения нефтью и нефтепродуктами // Патент РФ №2057724 от 10 апреля 1996 г.
5. Калюжин В.А. Способ биологической очистки воды и грунта от органических веществ алифатического, карбоциклического, гетероцикличе-
ского рядов и их смесей произвольного состава // Патент РФ № 2315670 от 27 января 2008 г.
Статья представлена научной редакцией «Биология» 26 сентября 2009 г.
