CC BY
15
ЗООТЕХНИЯ
УДК 599.323.4+546.23
УСТОЙЧИВОСТЬ ФЕРМЕНТНОГО ЗВЕНА АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ ОРГАНОВ И ТКАНЕЙ КРЫС К ТОКСИЧЕСКОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ НА ЭТАПАХ ОНТОГЕНЕЗА
Г. И. Боряев, доктор биол. наук, профессор; Ю. В. Кравченко, канд. биол. наук; Е. Кистанова,* канд. биол. наук, науч. сотруд. 1 степени; М. Н. Невитов, канд. биол. наук, доцент; А. В. Остапчук, канд. биол. наук, доцент.
ФГОУ ВПО «Пензенская ГСХА», т. (8412) 628-151; * Институт биологии и иммунологии размножения Болгарской академии наук, E-mail: Elena@cablebg. net
В статье рассматриваются некоторые аспекты токсичности кадмия и особенности краткосрочной адаптации антиоксидантной системы к введению токсиканта у лабораторных крыс на этапах онтогенеза. Проводилась оценка эффективности селеноргани-ческого соединения селенопирана (СП) - 9-фенил-симметричного октагидроселеноксан-тена. Выявлены различия перераспределения селена в онтогенезе при введении кадмия, установлена высокая эффективность селенопирана как донора селена и препарата, снижающего отрицательные проявления окислительного стресса.
Ключевые слова: кадмий, окислительный стресс, перекисное окисление, лабораторные крысы, селен, ферменты, антиоксидантная система.
В настоящее время в условиях применения интенсивных технологий выращивания скота довольно трудно добиться сохранности высоких показателей как у родительского стада, так и полученного от него потомства. Наблюдается значительная степень загрязнения кормов различными пол-лютантами, среди которых особое место занимают тяжелые металлы. Помимо прямой токсичности, они обладают целым рядом неблагоприятных свойств: аллерген-ность, канцерогенность, провокация окислительных повреждений и т. д. Устойчивость к воздействию поллютантов является важнейшей составляющей в обеспечении репродуктивной функции, так как клетки герминативной ткани чрезвычайно подвержены окислительному стрессу. В формировании устойчивости к свободнорадикальным повреждениям большая роль принадлежит функционированию ферментативного звена антиоксидантной защиты. В свою очередь, структура ферментов-антиоксидантов предусматривает наличие большого числа сульфгидрильных групп, как определяющих пространственную конформацию протеинов (супероксиддисмутаза), так и входящих в состав активного центра фермента (глута-тионредуктаза). Кадмий относится к тяжелым металлам, способным быстро реагиро-
вать с сульфгидрильными группами в водной среде [1], а также замещать цинк в активных центрах ферментов (супероксиддисмутаза) [2].
Целью данной работы было выявление аспектов токсичности кадмия, обусловленных его тиолспецифичностью, и особенностей краткосрочной адаптации антиокси-дантной системы лабораторных крыс к введению токсиканта на этапах онтогенеза. Одновременно проводилась оценка эффективности органического селенсодер-жащего соединения селенопирана (СП) -9-фенил-симметричного октагидроселе-ноксантена [3].
Материалы и методы. Для исследования использовали лабораторных крыс возраста 60 (молодые), 90 (половозрелые) дней и 24 месяцев (старые). В течение 7-дневного эксперимента животные находились на стандартном полусинтетическом рационе. Первая группа - контрольная (К); животным второй группы (Сф в последние 4 дня эксперимента внутрижелудочно вводили водный раствор С^12 в дозе 4 мг/кг живой массы. Животные третьей группы (Бе+Сф в течение 7 дней интрагастрально получали масляный раствор СП в дозе 0,021 мг/100 г живой массы (5,5 мкг Бе/100 г живой массы), а С^!2 вводился аналогич-
но второй группе за 6 часов до введения селенопирана.
На восьмой день животных декапити-ровали и в плазме, эритроцитах, гомогена-тах печени, слизистой тонкого кишечника, миокарда и аорты определяли содержание продуктов перекисного окисления липидов и активность ферментов антиоксидантной защиты. Содержание диеновых конъюгатов (ДК) в плазме крови оценивали методом Z. Placer (1968) в модификации В. Б. Гаври-лова и соавт. [4], ДК в эритроцитах, гомоге-натах тканей - методом Z. Placer (1968) в модификации Ю. А. Владимирова и соавт.
[5] и В. Б. Гаврилова и соавт. [4], малонового диальдегида (МДА) в плазме и гомоге-натах тканей - методом М. Michara и соавт.
[6], МДА в эритроцитах - методом L. Ernster и соавт. [7]. В гемолизатах эритроцитов и гомогенатах тканей определяли активность глутатионредуктазы (ГР) и глута-тионпероксидазы (ГПО) соответственно методами J. Tilbotson (1971) и G. Mille (1959) в модификации Г. Ю. Мальцева и соавт. [8], супероксиддисмутазы (СОД) методом М. Niashikimi (1972) в модификации Г. Ю. Мальцева и А. В. Васильева [9], адаптированным для анализатора открытого типа ФП-901 («Labsystems»). На основании данных по содержанию продуктов ПОЛ и активности антиоксидантных ферментов для каждой исследуемой системы органов был рассчитан общий антиокси-дантный индекс (АОИ) [10] - АОИКроВи (кровь), АОИссс (сердечно-сосудистая система), АОИПИщ (пищеварительная система). Концентрацию селена в плазме, печени и семенниках определяли флюориметриче-ским методом.
Статистическая обработка данных: достоверность отличий значений определяли с помощью двустороннего t-теста Стьюдента; отличия считали достоверными при p<0,05.
Результаты и обсуждение. Введение хлорида кадмия в организм животных разного возраста вызывал в изучаемых органах неоднозначные сдвиги в системе «пе-рекисное окисление липидов - антиокси-дантная защита».
Всасывание кадмия происходит при участии белка-переносчика, секретируемо-го поджелудочной железой, в верхних отделах тонкой кишки, непосредственно в воротную вену [11; 12]. Именно поэтому в печени прооксидантный эффект от введения кадмия был выражен довольно сильно, а в эпителии слизистой оболочки тонкой кишки подобных изменений не отмечалось. Так, содержание ДКпеч (печени) повыша-
лось на 13 % у молодых и на 117 % у старых животных. Концентрация МДАпеч имела другую тенденцию: повышаясь у молодых и взрослых животных на 30 и 16 %, соответственно, у старых снижалась на 25 %. Было обнаружено достоверное увеличение концентрации ДКпл (плазмы) у молодых и старых животных на 43 и 110 % соответственно. Ткани миокарда и аорты подвергаются токсическому действию кадмия опосредованно, после соединения его с белками и поступления в кровь. У молодых животных наблюдалось двукратное повышение МДА аорты. У старых крыс, напротив, достоверно снижалось содержание МДАаорты, но увеличивалась концентрация ДКмиок (миокарда) на 19 %, параллельно с ростом этого продукта в печени и плазме (г=0.643, р<0.05 и г=0.679, р<0.05 соответственно), что с большой долей вероятности является свидетельством поступления ДК в миокард в составе липопротеидов.
Изменение активности основных ферментов антиоксидантной системы (АОС) разных органов носило разнонаправленный характер.
Зафиксировано повышение активности СОДкиш (кишечника) на 22 % у молодых животных, СОДкиш на 25 % и СОДаорты на 33 % у взрослых, а у старых крыс СОДмиок на 19 %.
Отмечалось значительное падение активности ГПОкиш на 38,6 % и ГПОпеч на 26 % у молодых, ГПОэр (эритроцитов) на 17 % у взрослых, ГПОмиок на 24 % у старых крыс. Повышалась активность фермента в миокарде молодых животных на 56 %, в кишечнике и печени взрослых - на 40 и 65 % соответственно, в кишечнике и печени старых - на 26,7 и 41 % соответственно. У старых особей изменение активности ГПО печени положительно коррелировало с концентрацией селена в органе (г=0,773, р<0,01), свидетельствуя о важной роли се-ленозависимой фракции ГПО в этом возрасте.
Тиолспецифичность кадмия в наибольшей степени проявилась в отношении фермента глутатионредуктазы, содержащего цистеин в активном центре. Его активность достоверно снижалась в печени и кишечнике молодых крыс (на 37 и 47 % соответственно), у взрослых - в печени, кишечнике, эритроцитах и аорте (на 14, 35, 32 и 47 % соответственно). У старых особей, напротив, активность ГР достоверно возрастала (в печени на 25,5 %, кишечнике на 43 % и эритроцитах на 23 %).
Введение селенопирана приводило к уменьшению интенсивности ПОЛ у старых животных по сравнению с группой, где ис-
пользовали раствор кадмия: содержание ДК в печени, тонкой кишке, плазме было меньше на 44, 24 и 25 % соответственно, а содержание МДА в плазме и аорте - на 16 и 20 % соответственно. У молодых и взрослых крыс СП предотвращал повышение активности СОДкиш и падение активности ГРпеч, отмеченное в группе (СС), а у молодых крыс активность ГРэр даже повышалась на 54 % по сравнению с группой (СС).
При введении кадмия индекс АОИпищ у молодых животных уменьшался почти в 10 раз за счет снижения активности ГРкиш, ГПОкиш и ГРпеч и в результате повышения концентрации ДК и МДА печени. Показательно то, что у взрослых и старых крыс введение кадмия привело к росту АОИпищ -у взрослых за счет увеличения активности СОДкиш, ГПОкиш и ГПОпеч, а у старых за счет ГПОпеч и ГРкиш.
Значение индекса АОИКроВИ молодых животных при введении кадмия повышалось за счет снижения концентрации МДАэр и некоторого увеличения активности СОДэр. У старых крыс сохранялась тенденция изменения показателей, отмеченная для системы пищеварения. Введение кадмия приводило к снижению значения АОИКРОВИ (в основном в связи с ростом концентрации ДК плазмы и снижением активности ГПОэр).
При подсчете интегрального индекса АОИссс достоверных различий между группами (К) и (СС) всех возрастных групп выявлено не было - это предполагает наличие адаптационных резервов АОС сердечно-сосудистой системы, вне зависимости от возраста обеспечивающих стабильность работы при прооксидантной агрессии.
Интересно, что введение антиоксидан-та (СП) повлияло на значение АОИ только у животных 24-месячного возраста: АОИпищ
увеличивался достоверно как за счет роста активности ГПОпеч и ГРкиш, так и снижения концентрации ДКпеч и ДКтш. Значение АОИКРОВИ также возрастало. Защитное действие се-ленопирана в данном случае реализовалось путем снижения концентрации продуктов ПОЛ плазмы. Аналогичная тенденция сохранялась и в органах сердечнососудистой системы. Введение СП положительно сказалось на величине АОИССС за счет повышения в составе индекса удельного веса ГПОмиок, СОДмиок, ГРаорты и снижения концентрации МДАаорты.
Интересным оказалось перераспределение селена в органах экспериментальных животных при введении кадмия (таблица). Содержание селена в плазме не изменялось у молодых и взрослых особей, но резко снижалось у старых крыс (в 1,8 раза), а в печени уменьшалось только у молодых животных (в 1,9 раза). В семенниках взрослых крыс количество селена достоверно увеличивалось (в 1,4 раза), тогда как у старых и молодых животных снижалось в 1,2 и 1,3 раза соответственно.
Концентрация селена в печени у животных всех возрастных групп при введении СП повышалась по сравнению с группой (СС). В семенниках молодых и взрослых крыс концентрация микроэлемента даже превышала контрольные значения. Селен плазмы достоверно возрастал только у молодых крыс, а в возрасте 24 месяцев введение селенопирана даже не предотвращало его снижения, вызванного кадмием.
Таким образом, настоящее исследование позволило выявить, что адаптация АОС различных органов к токсическому воздействию в процессе онтогенеза изменяется и более успешно протекает у крыс
Изменение концентрации селена в тканях крыс при токсическом воздействии
на этапах онтогенеза, (М±т)
Возраст Группа Содержание селена, нг/г
Семенники Печень Плазма
60 дней К, п=8 81,0±8,50 912±77,0 185±16,3
Сс1, п=8 61,0*±3,00 488***±68,0 182±11,5
Бе+СС, п=7 |90,0**±7,00 |819*±118 |287**±25,4
90 дней К, п=6 82,0±3,00 562±42,0 399±24,5
СС, п=6 117***±6,00 635±65,0 375±30,7
Бе+СС,п=6 147±36,0 698±44,0 369±23,3
24 месяца К, п=6 93,0±4,00 751±12,0 666±11,8
СС, п=6 74,0**±4,00 814±40,0 373***±23,8
Бе+СС,п=6 |95,0***±2,00 948±50,0 378±35,2
"достоверность различий между группами, уровень значимости р<0.05; "достоверность различий между группами, уровень значимости р<0.01; ***достоверность различий между группами, уровень значимости р<0.001; | указана достоверность различий между группами «СС» и «Бе+СС».
возраста 90 дней. У молодых животных в период полового созревания адаптационные реакции АОС характеризуются неустойчивостью и разнонаправленностью, а у старых крыс выявлена устойчивость НАДФ-зависимой системы восстановления окисленного глутатиона к введению кадмия.
Исследование позволило выявить онтогенетические различия перераспределения селена в организме при введении кадмия и подтвердить высокую эффективность селенопирана как донора селена: повышалось как содержание селена в тканях, так и активность ГПО у молодых (аорта), взрослых (миокард и эритроциты) и старых (печень, эритроциты) крыс.
Профилактическое введение экспериментальным животным селенопирана уменьшало проявления окислительного стресса, что выражалось в повышении интегрального индекса антиоксидантной защиты у молодых (системы крови) и старых (пищеварительная, сердечно-сосудистая системы, кровь) животных.
Литература
1. Figueiredo-Pereira, M. Disruption of the intracellular sulfhydryl homeostasis by cadmium-induced oxidative stress leads to protein thiolation and ubiquitination in neuronal cells/ M. Figueiredo-Pereira, S. Yakushin, G. Cohen // J. Biol. Chem. - 1998. - Vol. 273.- № 21.- P. 12703-12709.
2. Vallee, B. L. Biochemical effects of mercury, cadmium, and lead / B. L. Vallee, D. Ulmer // Annu. Rev. Biochem.- 1972.-Vol. 41.- P. 91-129.
3. Селен в биосфере: монография / Г. И. Боряев [и др.]; под общ. ред. А. Ф. Бли-нохватова. - Пенза, 2001. - С. 154-181.
4. Гаврилов, В. Б. Спектрофотометри-ческое определение содержания гидропе-
рекисей липидов в плазме крови / В. Б. Гаврилов, М. И. Мишкорудная // Лаб. дело. -1983. - № 3.- С. 33-35.
5. Владимиров, Ю. А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Ю. А. Владимиров, А. И. Арчаков: монография - М.: Наука, 1972. - 268 с.
6. Michara, M. Thiobarbituric acid value of fresh homogenate of rats as a parameter of lipid peroxidation in aging, CCI4 intoxication and Vit E deficiency / M. Michara, M. Uchi-yama // Biochem. Med. - 1980 - Vol. 23.-P. 302-311.
7. Ernster, L. Microsomal lipid peroxidation / L. Ernster, K. Nordenbrandt // Methods Enzymol. - 1967.- Vol. 10. - P. 575-576.
8. Мальцев, Г. Ю. Оптимизация определения глутатионредуктазы эритроцитов человека на полуавтоматическом анализаторе / Г. Ю Мальцев, Л. А. Орлова // Вопр. мед. химии. - 1994. - № 2. - С. 59-61.
9. Мальцев, Г. Ю. Способ определения активности каталазы и супероксиддисмута-зы эритроцитов человека на анализаторе открытого типа / Г. Ю. Мальцев, А. В. Васильев // Вопр. мед. химии. - 1994. - № 2. -С. 56-58.
10. Мальцев, Г. Ю. Антиоксидантный индекс в мониторинге лечебного питания / Г. Ю. Мальцев, А. В. Васильев // Вопросы питания. - 1999. - № 2. - С. 41-43.
11. Manca, D. Studies on lipid peroxidation in rat tissues following administration of low and moderate doses of cadmium chloride / D. Manca, A. C Ricard, B. Trottier, G. Chevalier // Toxicology. - 1991. - Vol. 67. P. 303-323.
12. Hussain, T. Effects of cadmium on superoxide dismutase and lipide peroxidation in liver and kidney of growing rats, in vivo and in vitro studies / T. Hussain, G. Shukla, S. Chandra // Pharmacol. Toxicol. - 1987. - Vol. 60. P. 355-358.
