CC BY
47
УСТАНОВКА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ И ПОСЛЕСВЕЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ
Е.А. КУЗНЕЦОВА, доцент кафедры физики
Изучение флуоресценции и послесвечения листьев и хлоропластов дает большую информацию для понимания световых стадий фотосинтеза. Эти исследования проводят на различных флуори-метрических установках [1-4].
В данной работе приведено описание созданной нами установки, позволяющей одновременно исследовать кинетические зависимости флуоресценции и послесвечения биологических объектов, изучать термограммы их флуоресценции, а также измерять отношения квантовых выходов составляющих фотолюминесценции.
Рассматриваемая установка создана на базе флуориметра [2] с использованием предложенных в [3] разделения во времени возбуждающего и действующего света, модуляции этих лучей с различной частотой и регистрации люминесценции на частоте модуляции возбуждающего света. Данная установка содержит механический фосфороскоп в виде неподвижного цилиндра 1 (рис. 1) с тремя окнами, внутри которого вращается с частотой 20-40 ст' полый цилиндр (обтюратор) 2 с двумя парами щелей. В центре фосфороскопа в плоской прозрачной кювете расположен исследуемый объект (ИО). При совмещении окон подвижного и неподвижного цилиндров объект засвечивается то мощным действующим светом (ДС) с интенсивностью 2-100 Вт/м2, то слабым возбуждающим светом (ВС) с интенсивностью 0,01-0,03 Вт/м2. Количество и расположение окон в цилиндрах выполнено таким образом, чтобы действующий и возбуждающие лучи были модулированы с одинаковой частотой 40-80 Гц. При частоте вращения обтюратора 40 с-1 время освещения объекта лучами ДС и ВС составляло 1,4 мс, интервал между импульсами ДС и ВС равнялся 1,7 мс, и такое освещение повторялось через 12,5 мс (рис. 2).
Импульсы мощного света ДС вызывают фотоиндуцированное изменение состояния объекта (ИО), т.е. влияют на процессы фотосинтеза, а в промежутках между импульсами ДС слабый свет ВС возбуждает флуоресценцию. В течение второго импульса из каждой пары импульсов ВС производится регистрация люминесценции объекта с помощью фотоэлектронного умножителя (ФЭУ) (см. рис. 1, 2). В указанные интервалы регистрации на ФЭУ попадают одновременно три составляющих люминесценции (.ЛМ): постоянная люминесценция (ФО), переменная флюоресценция (ФП) и миллисекундные компоненты послесвечения (ПС), возникающие после прерывания ДС. Для последующего разделения сигналов ПС и флуоресценции (ФЛ), состоящей из ФО и ФП, применена дополнительная высокочастотная модуляция света ВС с частотой 2,4 кГц. Предназначенный для этого модулятор М (см. рис. 1) в виде диска с прорезями вращался с частотой 50 с-1. В результате каждый сигнал ВС состоял из многих высокочастотных импульсов. Поэтому сигнал ФЛ от объекта был также модулирован с высокой частотой в отличие от сигнала ПС (см. рис. 2). Оптические сигналы ФЛ и ПС поступают на ФЭУ, а от него суммарный электрический сигнал подается на вход усилителя (У) (см. рис. 1). Для снижения уровня шума полоса электрического сигнала была уменьшена до величины, регистрируемой самописцами (несколько герц), с помощью синхронного детектирования с постоянной времени 0,5 с. С этой целью часть света ВС отводилась на фотоприемник (ФП), от которого периодический электрический сигнал подавался через усилитель на ключи синхронного детектора (СД). Самописец КСП, подключенный к выходу СД, регистрировал интенсивность флуоресцен-
ции (ФЛ). Ее постоянная часть, т.е. ФО, является интенсивностью ФЛ в начальный момент освещения светом ДС и ВС.
ДС). Для этого нами было предложено использовать вычитающее устройство - разностный блок (РЕ), на один из входов которого поступал суммарный сигнал люминесценции (ЛМ), т.е. ФЛ и ПС, а на другой - сигнал только ФЛ, снимаемый на выходе СД. Второй самописец КСП, подключенный к выходу РБ, регистрировал сигнал миллисекундных компонент ПС (см. рис. 1).
1дс
1А
1,7
1,4
8,0
*вс
р
мс
Ш
17,1Л.
/2,5
цлЯР0’4
%л
КЬс
мс
Рис. 1. Схема установки для исследования флуоресценции и послесвечения: ВС - источник возбуждаемого света, ДС - источник действующего света, И О - исследуемый объект, Л, и Л2 - кварцевые линзы, Л3 -конденсор с тепловым водяным фильтром, Ф,, Ф2, Ф3 - стеклянные светофильтры, ДЗ - делительное зеркало, ФП - фотоприемник, У -усилитель, СД - синхронный детектор, Д - линейный детектор, РБ - разностный блок, КСП - компенсационные самопишущие потенциометры, М - механический модулятор, ФЭУ - фотоэлектронный умножитель, 1 - неподвижный цилиндр фосфороскопа, 2 -обтюратор, 3 - светопоглощающие уплотнители
На нашей установке одновременно с измерением флуоресценции, т.е. ФО и ФП (от ДС при ВС) измерялось и послесвечение (от ДС в интервалах между импульсами
Рис. 2. Зависимости от времени интенсивностей действующего (1дС) и возбуждающего (1ВС) световых импульсов, попадающих на объект, а также сигналов индуцированной флуоресценции (РФЛ) и послесвечения (/Г/7С), поступающих от объекта в канал регистрации. Время указано в миллисекундах при частоте вращения обтюратора 40 с 1
Использование одного оптического канала (и одного ФЭУ) для одновременной регистрации сигналов ФО, ФП и ПС позволило измерить отношения квантовых выходов Кф0 / Кпс и КФП / Кпс , а также их кинетику. Действительно,
N V
V ___ ФО _ ФО погл
ФО ~ дГ - X >
погл погл ^ ФО
Кфр _ Нфр _ Еф0 упс ^ Рф0 __ Уф0\Ъпс
К пс ^ пс ^пс^фо Рпс УпсМфо где КФО - квантовый выход постоянной флуоресценции ФО, N - число квантов, V -частота света, /погл - интенсивность пог-
лощения света, РФС - интенсивность постоянной флуоресценции; /погл = ЛГПОГЛЛУПОП1, Рфо = Нф0Ь\/ф0, \пс ~ \ФЛ , уф0, упс - ординаты ФО и ПС на лентах самописцев; М'фо > Iхпс > ~ коэффициенты усиления аппаратуры. Заменив в этих формулах ФО на ФП и учитывая, что у.ФП = \хФО, получим
^ФП Уфп^-пс
Кпс Упс^-фо
Эти соотношения позволяют по известным ординатам кривых на лентах самописцев и коэффициентам усиления аппаратуры определить кинетику отношений указанных квантовых выходов.
Созданная установка позволяет исследовать флуоресценцию и послесвечение объектов в зависимости от их температуры, в том числе термограммы флуоресценции, т.е. зависимость постоянной флуоресценции (ФО) от температуры объекта при постоянной скорости нагрева. Для этого предусмотрена термостабилизирующая система, позволяющая держатель с прижатым к нему образом нагревать до температуры в пределах 10-96 °С с погрешностью 0,1 °С при скорости нагрева 0,6-2 град/мин.
Нами были проанализированы характеристики установки и были выполнены условия для получения наибольшего отношения сигнала флуоресценции к шуму; получены конкретные выражения для оптимальных параметров схемы [4], которые были реализованы в данной установке, и были применены различные светопоглощающие уплотнители 3 (см. рис. 1) для предотвращения фоновой засветки. В итоге были достигнуты высокая чувствительность установки, стабильность параметров и хорошая воспроизводимость получаемых результатов. Установка позволяла измерять сигнал флуоресценции зонда атебрина, введенного с концентрацией 10“6 М в суспензию хлоропластов, при отношении сигнала к шуму, равном 30-40.
Таким образом, создана высокочувствительная флуориметрическая установка, позволяющая разделять и одновременно регистрировать сигналы флуоресценции и послесвечения биологических объектов, изучать термограммы их флуоресценции в области 10-96 °С, а также измерять отношение квантовых выходов составляющих фотолюминесценции.
Литература
1. Гольд В.М., Гаевский Н.А., Григорьев Ю.С., Гехман А.В., Попельницкий В.А. Теоретические основы и методы изучения флуоресценции хлорофилла. -Красноярск: Изд. КГУ, 1984. - 82 с.
2. Гун-Аажаев Т., Кукушкин А.К. Исследование взаимодействия двух фотосистем флуоресцентным методом // 8Шс1іа Віоріїузіса. - 1976. - Т. 60, вып. 3. - С. 223-231.
3. Карапетян Н.В., Климов В.В. Установка для измерения кинетики индуцированных светом изменений выхода флуоресценции у фотосинтезирующих организмов // Физиология растений. -1971.-Т. 18, вып. 1.-С. 223-228.
4. Кузнецова Е.А. Оптимизация параметров регистрирующей системы установки для исследования фотолюминесценции биологических объектов // Науч. тр. / МЛТИ. - 1982. - Вып. 145. -С. 81-84.
Аннотация
Установка для исследования флуоресценции и послесвечения биологических объектов, Кузнецова Е.А.
Дано описание установки, позволяющей одновременно исследовать кинетические зависимости флуоресценции и послесвечения биологических объектов, изучать термограммы их флуоресценции, а также измерять отношения квантовых выходов составляющих фотолюминесценции.
