CC BY
87
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ НАУКИ
УДК 581.143.6
Е.Ф. Лейнвебер
канд. с.-х. наук, ведущий научный сотрудник, ФГБНУ «Научно-исследовательская станция шелководства»,
г. Железноводск
Е.Г. Евлагина
научный сотрудник,
ФГБНУ «Научно-исследовательская станция шелководства»,
г. Железноводск
УСОВЕРШЕНСТВОВАННАЯ ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОКЛОНИРОВАНИЯ ШЕЛКОВИЦЫ НА ПРИМЕРЕ ОТЕЧЕСТВЕННОГО СОРТА ПС-885
Аннотация. В статье представлена усовершенствованная технология микроклонирования шелковицы на примере отечественного сорта шелковицы ПС-885: с разработкой способа стерилизации эксплантов и подбором оптимальной питательной среды на основных этапах микроразмножения in vitro для получения оздоровленного посадочного материала.
Ключевые слова: шелковица, клональное микроразмножение, питательная среда, апикальная меристема, антиоксидант.
E.F. Leinweber, Research Station of Sericulture, Zheleznovodsk
E.G. Evlagina, Research Station of Sericulture, Zheleznovodsk
IMPROVED MULBERRY MICROCLONING TECHNOLOGY WITH STUDIES CONDUCTED USING LOCAL
MULBERRY VARIETY PS-885
Abstract. The article gives an insight into the improved mulberry microcloning technology with studies conducted using local mulberry variety PS-885. The way to sterilize explants and to select preferable plant growth medium during the main stages of in vitro microcloning stages has been devised to obtain healthy planting material.
Keywords: mulberry, clonal micropropagation, plant growth medium, apical meristem, anti-oxidizing agent.
Одна из проблем при внедрении нового сорта в практику - невозможность получения большого количества вегетативно размножаемого посадочного материала, но ее можно решить с помощью биотехнологии, которая предлагает селекционерам эффективные методы микроразмножения растений [1, с. 3], такие как клональное микроразмножение. В сущности, эти методы аналогичны вегетативному способу размножения и различаются лишь тем, что весь процесс протекает в условиях in vitro [2, с. 22; 3, с. 11].
Культуры тканей растений выращивают в основном двумя способами: на твердых ага-ризованных питательных средах и в жидких питательных средах. Преимущество каждого из этих способов зависит от многих факторов. Согласно литературным источникам, важный фактор эффективности микроклонального размножения растений - правильный подбор питательной среды, обеспечивающей потребности культуры ткани продуцента в химических компонентах, необходимых для обеспечения оптимального биосинтеза в целом организме. Обязательными компонентами питательных сред служат смеси минеральных солей (макро- и микроэлементов), витамины, фитогормоны, выступающие как факторы регуляции процессов клеточного деления и дифференциации, и так как питание культур тканей гетеротрофно, источник углерода вводится в состав среды в виде сахарозы [4, с. 442; 5, с. 175].
Метод культуры клеток, тканей и органов является общепризнанным и широко применяется во всем мире для решения фундаментальных и прикладных вопросов биологии растений. Микроклональное размножение в современном мире хоть и является довольно распространён-
ным методом, но работы по размножению шелковицы данным способом пока единичны [6, с. 37].
В связи с вышеизложенным, целью нашей работы является усовершенствование технологии микротирожирования шелковицы. В качестве объекта исследования был выбран сорт шелковицы отечественной селекции из коллекционного генофонда ФГБНУ «Научно-исследовательская станция шелководства» - ПС-885, данный сорт относится к виду шелковица белая (Morus alba). Для заготовки эксплантов были взяты верхушечные почки из однолетних побегов 10-летних деревьев в ранневесенний период (март).
Работа по усовершенствованию технологии микроклонирования шелковицы проводилась на важных этапах размножения (рис. 1). Для этого отрабатывали способ стерилизации исходного материала с подбором оптимальных дезинфицирующих средств, изучали влияние различных факторов на процессы морфогенеза, органогенеза и укоренение микропобегов шелковицы в культуре in vitro с модификацией состава питательных сред.
На первом этапе культивирования особое внимание уделили стерильности экспланта, так как от получения первичной культуры тканей или органов зависит весь дальнейший процесс размножения. Согласно мнению многих авторов [1, с. 20; 2, с. 22; 4, с. 441] и из собственного опыта известно, что соблюдение строгой стерильности необходимо в связи со стремительным появлением патогенной микрофлоры на изолированных фрагментах растений (эксплантах).
1 этап
Отбор исходных растений
Сорт шелковицы отечественной селекции - ПС-885, получение эксплантов из верхушечных почек в фазе активного роста
Стерилизация исходного материала (подбор оптимальных дез инфицирующих средств и способа), ст ерилизация литат ельных ср ед.
вычленение эксплантов
2 этап
3 этап
4 этап
Создание оптимальных условий для развития на питательных средах Содержание опытных культур при температуре +25"С под светом флуоресцентной лампы с 16 часовым фотопериодом
Введение в культуру in vitro (морфогенез)
Собственно
микроразмножение (органогенез)
Укоренение микропобегов
Подбор оптимального антиоксиданта для ускорения появления адвентивных почек и микропобегов: аскорбиновая кислота, глутатион
Подбор оптимального ауксина с целью ускорения роста микропобегов: 2,4-дихлор-феноксил-укс\/сной кислоты (2,4-Д), индол-3-масляной кислоты (ИМК), а-нафтилуксусной кислоты (НУК)
Исследование влияния уменьшения концентрации базовой питательной среды Мурасиге-Скуга и добавления о-нафтилуксусной кислоты (НУК) на укоренение микропобегов
Рисунок 1 - Схема эксперимента
При подборе оптимального минерального состава базовой питательной среды была выбрана среда Мурасиге-Скуга с дополнительными ингредиентами (сахароза, агар-агар), в том числе с подбором оптимальных фитогормонов (ауксин - 2,4-дихлорфеноксил-уксусная кислота (2,4-Д), цитокинин - 6-бензиламинопурин (6-БАП)) [7, с. 10-12].
Обобщая полученные результаты, мы пришли к следующим выводам.
1) Наиболее низкая инфицированность и высокая жизнеспособность эксплантов (заготовленных апикальных меристем) - при их обработке 96%-ым этиловым спиртом с экспозицией 30 секунд, а затем в течение 1 минуты в 40%-ом растворе бытового хлорсодержащего вещества «Белизна» с последующей многократной промывкой в течение 45 минут дистиллированной водой.
2) На этапе морфогенеза была отмечена высокая регенерационная активность (высокий уровень образования микропобегов) в средах, содержащих антиоксиданты (аскорбиновая кислота, глутатион). Индукция морфогенеза у эксплантов лучше происходила с добавлением глу-татиона по сравнению со средой, содержащей аскорбиновую кислоту.
3) На стадии органогенеза наилучший результат был получен на среде, содержащей в качестве ауксина индол-3-масляную кислоту (ИМК).
4) Наиболее интенсивное развитие корневой системы и максимальное их количество было на среде с V концентрацией солей Мурасиге-Скуга (укореняемость микропобегов - 100%). В питательной среде с V концентрации солей Мурасиге-Скуга в присутствии 0,5мг/л НУК укореняемость микропобегов также была достаточно высокой - 92,9%.
В итоге выполнения работы определены оптимальный способ стерилизации эксплантов и дезинфицирующие средства, способствующие получению здорового исходного материала, подобраны оптимальные составы питательных сред на каждом этапе микроклонального размножения шелковицы, на примере отечественного сорта шелковицы - ПС-885, для разработки усовершенствованной технологии микроклонирования шелковицы.
Список литературы:
1. Тимофеева О.А., Невмержицкая Ю.Ю. Клональное микроразмножение растений: учебно-методическое пособие. - Казань: Казанский университет, 2012. - 56 с.
2. Высоцкий В.А., Тарашвили З.Т. Микроразмножение здорового посадочного материала ягодных культур // Садоводство. - 1982. - № 2. - С. 22-23.
3. Бутенко Р.Г., Катаева Н.В. Клональное размножение растений. - М.: Наука, 1983. -
97 с.
4. Бартиш И.В., Короховой В.И. Состав культуральной среды и эффективность образования побегов in vitro из листовых эксплантов яблони // Физиология растений. - 1997. - Т. 44, № 3. - С. 440-444.
5. Турдиев Т.Т., Ковальчук И.Ю, Фролов С.Н. Оптимизация минерального и гормонального состава питательных сред для культивирования винограда in vitro // Материалы 2-й международной научной конференции. - Харьков, 2013. - С. 173-178.
6. Эргашев А.-К.Э. Шелковица как объект в биотехнологических исследованиях // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. - М., 1991. - С. 36-39.
7. Евлагина Е.Г., Лейнвебер Е.Ф., Величко М.Ф. Микроразмножение in vitro полиплоидных сортов шелковицы // Актуальные вопросы сельскохозяйственных наук в современных условиях развития страны: сборник научных трудов по итогам международной научно-практической конференции. № 3. - Санкт-Петербург, 2016. - С. 10-12.
