CC BY
66
■ Mil
ш
Новости клеточных технологий. Новые технологии
Усовершенствование методики клонирования эмбрионов приматов
За время развития технологии переноса ядра соматической клетки (ПЯСК) только в марте 2004 года были опубликованы первые результаты по успешному созданию полноценных бластоцист человека и выделению из них линий эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) [1].
Вероятность рождения жизнеспособного потомства после ПЯСК остаётся крайне низкой, но приближается к 1-3% у некоторых видов успешно клонированных животных [2]. Все заявления о клонировании человека на сегодняшний день в научном обществе считаются фикцией [3]. Идея о возможности клонирования приматов может максимально приблизить человечество к возможности клонирования человека как вида и усовершенствования технологии ПЯСК для клеточной терапии и создания индивидуальных банков ЭСК. Приматы могут послужить «про-человеческой» моделью для изучения механизмов репрограммирования ядра соматической клетки, влияния эпигенетических факторов, цитоплазматического наследования, биологии ЭСК, условий оптимального развития эмбрионов до имплантации и после нее.
Первые клонированные приматы были получены методом переноса ядра эмбриональной клетки (бластомеров) несколько лет назад [4, 5] (рис. 1). Все предшествующие попытки клонировать обезьян методом ПЯСК были безуспешны. Только 2 года назад удалось получить блас-тоцисту приматов при ПЯСК с общей вероятностью успеха < 1% [7]. В 2003 году группа Simerly С. сообщила о серьёзных проблемах, связанных с нарушениями расхождения хромосом при делении яйцеклетки приматов после ПЯСК в метафазе II [6] (рис. 2). Группа Hwang Y.J. [1] предложила несколько модификаций протокола ПЯСК, которые привели к успешному созданию человеческих бластоцист. В частности, было предложено производить более мягкое извлечение комплекса хромосомного веретена, энуклеацию до остановки яйцеклетки в метафазе II и некоторые новшества в культуре [1].
В недавней работе, опубликованной в Developmental Biology группа Simerly С. успешно применила инновационную технологию Hwang для решения проблем, связанных с развитием предимплантационных эмбрионов приматов после ПЯСК. Энуклеацию яйцеклеток производили по методу Hwang в пре-метафазе II. Ядра выделяли из аутологичных кумулюсных клеток и аллогенных - линии кожных фиброб-ластов приматов (после 2-4 пассажей). Для контроля производили также перенос ядер клеток бластомеров, выделенных из 16-32-клеточных эмбрионов. Активацию и культивирование эмбрионов выполняли по описанным ранее протоколам. После 4-х дней культивирования бласто-цисты переносили в матку суррогатной матери. С помощью микроскопической техники вели прижизненное наблюдение за эмбрионами. Наилучших результатов добились при использовании протокола электрослияния с одновременной активацией. Так, при переносе аллогенных ядер фиб-робластов получали жизнеспособные бластоцисты в 43% попыток из удачно слившихся. При переносе ядер фиброб-ластов получали эмбрионы с нормальным кариотипом. Однако, при переносе ядер аутологичных кумулюсных клеток не удалось получить ни одной бластоцисты (и только 1 морулу) при использовании 3-х различных протоколов активации. Наблюдали несколько ускоренное развитие эмбриона in vitro по сравнению с оплодотворёнными яйцеклетками. Хорошая внутренняя клеточная масса
обнаруживалась только в двух из 4-х полученных бласто-цист. ЭСК, выделенные из этих бластоцист, прекращали рост в культуре через неделю. Из 135 переносов эмбрионов в матку суррогатной матери (n=25) ни один не завершился развитием беременности. В контроле же - перенос эмбрионов (147 эмбрионов 41 реципиенту), оплодотворённых in vitro, в - 14,6% случаев приводили к развитию беременности. Несмотря на кажущуюся нормальную морфологию ранних эмбрионов, многие ядра быстро развивали анеуплои-дию и дезаггрегацию ДНК, уже в телофазе первого митоза. Нарушалось расхождение хромосом и веретена деления, что подтвердило прошлогодние данные этой же группы [6]. Нарушения деления были выявлены на уровне 4-х, 8-ми и т.д. клеточных стадиях. Аналогичные нарушения в предим-плантационных эмбрионах наблюдали при переносе ядер эмбриональных клеток. Все эти нарушения приводили к быстрой остановке развития эмбриона. В контрольных, партеногенетически развитых эмбрионах, не обнаруживались никакие нарушения аппарата деления. При детальном изучении оказалось, что центросомы при ПЯСК не могут «собирать» микротрубочки веретена деления, в отличие от переноса ядра эмбриональной клетки, где эта сборка не нарушена. Если яйцеклетки химеризовать посредством ПЯСК в сочетании с фертилизацией (которая, собственно, и послужит сигналом к активации деления), то наблюдается успешное начало синтеза ДНК и процесса деления. При межвидовом переносе ядра клеток телёнка в яйцеклетку приматов не было никаких проблем с инициацией процесса деления. При ПЯСК приматов в телячью яйцеклетку наблюдали более благоприятное развитие «фигур деления» по сравнению внутривидовым переносом. При переносе ДНК сперматозоида в энуклеированную яйцеклетку в 80% наблюдений не обнаруживали каких-либо нарушений инициации и первых делений. Тем не менее, при последующих делениях вновь наблюдали хромосомные дефекты, и только в 24% наблюдений удавалось получить абсолютно нормальные 8-ми-клеточные эмбрионы. Наконец, было установлено, что дисфункция формирования митотического веретена связана с недостаточностью специфических белков -NuMA, HSET и Eg5.
Таким образом, приматы являются одним из самых трудных объектов для клонирования. Для нормального развития раннего эмбриона приматов необходимо наличие центросом сперматозоида и комплекса мейотического веретена яйцеклетки. При клонировании других видов животных центросомы привносятся с ядром донорской клетки (крупный рогатый скот) или локализованы в ооплазме (мыши). При ПЯСК в энуклеированную яйцеклетку примата центросомы оказываются «бездействующими», и наблюдается недостаточность белков, ответственных за правильное построение хромосомного веретена деления. Дефекты построения хромосомного веретена деления в интерфазе и при первом митозе являются решающими для дальнейшего неблагоприятного развития эмбрионов. Работа подтвердила жизнеспособность методики ПЯСК Hwang и показала перспективность её применения при будущих попытках клонирования новых видов и создания линий ЭСК. Исследователи установили причины неудачных попыток создания жизнеспособных эмбрионов приматов и разработали оптимальные методы получения бластоцист, готовых для выделения ЭСК или имплантации в матку с последующим созданием клона. Распознавание механизмов развития
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия № 1, 2005
35
I I I I I
I ■ Я I I I
Новости клеточных технологий. Новые технологии
эмбриона после ПЯСК может иметь значение для изучения цитоплазматического наследования и причин развития дефектов в постимплантационном периоде и после рождения жизнеспособных клонов. Только 20% клонированных бла-стоцист (и 50% бластоцист, полученных путём оплодотворения) приматов имеет хорошую внутреннюю клеточную массу, из которой можно выделить жизнеспособные линии ЭСК. Тем не менее, именно эти технологии можно исполь-
зовать для выделения иммуносовместимых ЭСК для клеточной терапии. До сих пор так и не удалось получить по-стимплантационный жизнеспособный эмбрион приматов методом клонирования. Все попытки переноса бластоцист в матку не заканчивались беременностью. Можно предположить, что аналогичные проблемы будут возникать и при попытках репродуктивного клонирования человека.
36
Рис. 1. Бластоциста примата, полученная методом переноса ядра соматической клетки. Из Dev Biol 2004; 276; 2: 237-52 с изменениями.
*hSCNT х Bovine JT's/DNA
Рис. 2. Аномалии развития микротрубочек хромосомного веретена деления при внутривидовом ПЯСК (а). Нормальная картина при внутривидовом переносе ядра клетки примата в ооцит телёнка (б). Окраска микротрубочек (зелёный) и ДНК ядра (синий). Из Dev Biol 2004; 276; 2: 237-52 с изменениями.
Рис. 3. Картина аномального первого митоза в эмбрионе примата, созданного методом ПЯСК (а). Нормальная метафаза (б) и телофаза (в) митоза контрольного партеногенетически развитого эмбриона. Окраска микротрубочек (красный), ядра (синий) и белка Eg5 центросом (зелёный). Из Dev Biol 2004; 276; 2: 237-52 с изменениями.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Hwang Y.J. et al. Evidence of a pluripotent human embryonic stem cell line derived from a cloned blastocyst. Science 2004; 303: 1669-74.
2. Wakayama T., Perry A.C. Cloning of mice. In: Cibelli JB, Lanza RP, Campbell KH (West MD, ed.). Principles of Cloning. San Diego: Academic Press, 2002. Р. 301-41.
3. Schatten G., Prather R., Wilmut I. Cloning claim is science fiction, not science. Science 2003; 299: 344.
4. Meng L. et al. Rhesus monkeys produced by nuclear transfer. Biol Reprod 1997; 57: 454-9.
5. Chan A.W. et al. Clonal propagation of primate offspring by embryo splitting. Science 2000; 287: 317-19.
6. Simerly C. et al. Molecular correlates of primate nuclear transfer failures. Science 2003; 300: 297.
7. Mitalipov S.M. et al. Rhesus monkey embryos produced by nuclear transfer from embryonic blastomeres or somatic cells. Biol Reprod 2002; 66: 1367-73.
Подготовил А.В. Берсенев; по материалам Dev Biol 2004; 276; 2: 237-52.
Поиск оптимального «гестационного окна» для ксенотрансплантации эмбриональных тканей
В условиях острого дефицита донорских органов для трансплантации внимание исследователей все чаще обращается к технологиям органогенеза, заключающимся в создании «мини-органов» или тканей de novo, способных временно или длительно заменить (или поддержать) функцию повреждённых собственных. В качестве источника рядом исследователей рассматриваются и ксеногенные ткани. Первые эксперименты по органогенезу были выполнены Hammerman M.R. с почкой. Как сообщалось ранее, в эксперименте на мышах была показана возможность использования метанефроса 15-тидневных эмбрионов мышей для
создания полноценной почки in vivo, которая смогла бы продлить жизнь животных с острой почечной недостаточностью [1, 2]. В клинической практике также предпринимались попытки применения эмбриональной поджелудочной железы 80 суток гестации. Однако были получены неоднозначные клинические результаты, что приостановило широкое внедрение этой методики [6]. Известно, что алло- или ксеногенный эмбриональный материал, предназначенный для трансплантации взрослому реципиенту, должен находиться в пределах «гестационного коридора», ограниченного, с одной стороны, достаточной (для поддержания фун-
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия № 1, 2005
