CC BY
43
УДК 619.5:6616-085.636
Касяненко О. I., д.вет.н., доцент © E-mail: kas-oxana@mail.ru
Сумсъкий нацюналъний аграрнийутеерситет, м. Сумы, Украта
УДОСКОНАЛЕННЯ ТА РОЗРОБКА ЗАСОБ1В Д1АГНОСТИКИ КАМП1ЛОБАКТЕРЮЗУ ПТИЦ1
У cmammi наведено теоретичне узагалънення й експерименталъне розв'язання науковог проблемы системы контролю камтлобактерюзу птищ на основi розробки д1агностычных 3aco6ie, що регламентуютъ комплекс контролюючих заходгв на етапах вирощування, забою i переробки птищ. Визначено дощлътстъ застосування Memodie видыення та визначення р1вня контам1нацИ м'яса бактер1ями роду Campylobacter зггдно з м1жнародними стандартами. Розроблено поживне щыъне середовище для кулътивування камтлобактерш, що дозволяе забезпечити picm Campylobacter spp. у nocienux концентрацгях 10-109 КУО/мл, а першг ознаки росту виявити через 16 год за мжроаерофтъних умов кулътивування. Запропонована селективна добавка забезпечуе селективну iзоляцт мтрооргатзм1в роду Campylobacter, пригтчуючи picm супутнъог мтрофлори (E. coli, S. enteritidis, L. monocitogenes, P. multocidae, S. aureus, P. vulgaris, P aeruginosa). Модифтовании метод видыення Campylobacter spp. на основi застосування т1огтолевого середовища з селективною добавкою. Застосування розробленог технологи отримання д1агностично1 камтлобактерюзног аглютинуючог сироватки забезпечуе одержання високих mumpie специфгчних антиты. Удосконалет i розроблеш методи i засоби diasnocmuKU в1дпов1даютъ вимогам мгжнародно! нормативно! бази проведения аналтичних дослгдженъ. Резулътати експерименталъних дослгджень використано при складант нормативних документ\в.
Ключов1 слова: diasnocmurn, поживне середовище, селективна добавка, мтрооргашзми, камтлобактерп, д1агностична сироватка, контам1нац1я.
УДК 619.5:6616-085.636
Касьяненко О. И., д.вет.н., доцент Сумскийнационалъныйаграрныйуниверситет, г. Сумы, Украина
УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ И РАЗРАБОТКА СРЕДСТВ ДИАГНОСТИКИ КАМПИЛОБАКТЕРИОЗУ ПТИЦЫ
В статье приведено теоретическое обобщение и экспериментальное решение научной проблемы системы контроля кампилобактериоза птицы на основе разработки диагностических средств, которые регламентируют комплекс контролирующих мероприятий на этапах выращивания, забою и
© Касяненко О. I., 2014
103
переработки птицы. Определенно целесообразность применения методов выделения и определения уровня контаминации мяса бактериями рода Campylobacter согласно международных стандартов. Разработана питательная плотная среда для культивирования кампилобактерий, что позволяет обеспечить рост Campylobacter spp. в посевных концентрациях 10109 КУО/мл, а первые признаки роста обнаружить через 16 год при микроаэрофильных условиях культивирования. Предложенная селективная добавка обеспечивает селективную изоляцию микроорганизмов рода Campylobacter, подавляя рост сопутствующей микрофлоры (E. coli, S. enteritidis, L. monocitogenes, P. multocidae, S. aureus, P. vulgaris, P aeruginosa). Модифицированный метод выделения Campylobacter spp. на основе применения тиогиколевого среды с селективной добавкой. Применение разработанной технологии получения диагностической кампилобактериозной аглютинуючеи сыворотки обеспечивает получение высоких титров специфических антител. Усовершенствованные и разработанные методы и средства диагностики отвечают требованиям международной нормативной базы проведения аналитических исследований. Результаты экспериментальных исследований использованы при составлении нормативных документов.
Ключевые слова: диагностика, питательная среда, селективная добавка, микроорганизмы, кампилобактерии, диагностическая сыворотка, контаминация.
UDC 619.5:6616-085.636
Kasjanenko O. I., doctor of veterinary Sciences, assistant professor Sumy national agrarian university, Sumy, Ukraine
THE IMPROVEMENT AND DEVELOPMENT OF FACILITIES OF
DIAGNOSTIC OF CAMPYLOBACTERIOSIS OF POULTRY
In the article theoretical generalization and experimental decision of scientific problem of the checking of kampilobakteriosis poultry system is resulted on the basis of development of diagnostic facilities which regulate the complex of supervisory measures on the stages of growing, to the backwall and processing of poultry. Certainly expedience of application of methods of selection and determination of level of kontamination of meats by the bacteria of sort of Campylobacter in obedience to international standards. A nourishing dense environment is developed for cultivation of kampylobakters, that allows to provide growth of Campylobacter of spp. in sowing concentrations 10-109 KUO/ml, and to find out the first signs of growth through 16 hours at the mikroaerofil terms of cultivation. Offered selective addition provides the selective isolation of microorganisms of sort of Campylobacter, repressing growth of concomitant microorganisms (E. coli, S. enteritidis, L. monocitogenes, P. multocidae, S. aureus, P. vulgaris, P aeruginosa). Modified method of selection of Campylobacter of spp. on the basis of application of tiogikolevogo environment with selective addition. Application of the developed
104
technology of receipt of diagnostic kampylobakters serum is provided by the receipt of high titles of specific antibodies. The improved and developed methods and facilities of diagnostics answer the requirements of international normative base of leadthrough of analytical researches. Drawn on the results of experimental researches at drafting of normative documents.
Key words: diagnostics, nourishing environment, selective addition, microorganisms, kampilobakteria, diagnostic serum, kontamination.
Вступ. Загальносвггова тенденщя посилення контролю за збудниками зооноз1в пов'язана з щор1чним збшьшенням кщькосп харчових токсикошфекцш серед населения в крашах Свропи та св1ту. Впродовж останшх рок!в в Свропейському Союз! р1зко посилилася увага до проблем мжробюлопчно! безпечност! продукив харчування в тому числ1 i до продукци птах1вництва. Особливий контроль здшснюеться за сальмонелами, кампшобактер!ями i л1стер1ями. Ефектившсть контролюючих заход1в насамперед залежить вщ своечасно! д1агностики даних шфекцш.
Матер1ал i методи. Робота виконувалася протягом 2006-2013 роюв на 6a3i кафедри ветсанекспертизи, мжробюлоги, 300ririeHH та безпеки i якост! продукта тваринництва Сумського национального аграрного ушверситету, окрем1 фрагмента - у Державному науково-контрольному шститут! б1отехнолог11 i штам1в м1кроорган1зм1в (м. Khib), Науково-контрольн1й лаборатор11 ТзОВ НВФ «Бровафарма». Для проведения досл1джень застосовували прилади i д1агностичн1 засоби (тест-системи, реактиви), поживн1 середовища зг1дно з ДСТУ ISO/TS 11133-1:2005, лабораторний посуд i лабораторне обладнання зг1дно з ДСТУ ISO 1042:2005. Готували реактиви та розчини зг1дно з ДСТУ ГОСТ 4919:2008. 1золяцш та щентифкацш камп1лобактер1й i3 харчових продукт1в здшснювали в1дпов1дно до м1жнародного стандарту (ДСТУ ISO 10272-1:2007 Мкробюлопя харчових продукт1в та корм!в для тварин. Горизонтальний метод виявлення та п1драхунку кампшобактерш. Ч. 1. Метод виявлення (ISO 10272-1:2006, DT) [1-4].
Результата дослщження. Основними науковими результатами досл1дження е розробка контролюючих заход1в щодо здшснення мон1торингу Campylobacter spp. В умовах заб1йних цех1в П1вн1чно-сх1дного perioHy Украши ¿зольовано С. jejuni, C. coli, та C. lari i3 тушок та продукт1в забою птиц1 на р1зних технолог1чних етапах переробки здорово! й хворо! птиц1. Патогени ¿золювали з поверхонь тушок та вмкту сл1пих 1золяти Campylobacter spp. були представлен! С. jejuni - 76,36 %, C. coli - 20,93 % та C. lari - 2,70 %. Видшеш штами кампшобактерш мали вигляд грамнегативних пол!морфних, злегка з!гнутих тонких, рухливих паличок. За культивування в р!дких поживних середовищах культури Campylobacter spp. у м!кроаерофшьних умовах за температури 37-42° С через 24-48 год утворюють незначне помутн!ння з пухким осадом на дш проб!рки; на щ!льних - через 48-96 год культивування формують др!бш волог!, блискуч!, прозор! колони матового кольору; в нап!вр!дких - через 24-48 год колони мали вигляд шжних аруватих диск!в пщ
105
поверхнею середовища. Виконано депонування штаму Campylobacter jejuni в Депозитари Национального центру штам1в мжрооргашзм1в Державного науково-контрольного шституту бютехнологп i штам1в м1крооргашзм1в. Це дозволило одержати штам Campylobacter jejuni subspecies jejuni С. 2008 для виготовлення ¿мунобюлопчних препарата.
Здшснено пор1вняльну оцшку ефективност1 методик видшення кампшобактерш з продукцп птах1вництва за чинними м1жнародними стандартами: згщно 3i стандартом ДСТУ ISO 10272-1:2007 Мкробюлопя харчових продукта та корм1в для тварин. Горизонтальний метод виявлення та пщрахунку кампшобактерш (Campylobacter spp.). Ч. 1. Метод виявлення (ISO 10272-1:2006, DT) та методом FDA «Выделение бактерий рода Campylobacter из продовольствия и воды» [Food &Drag Administration, 2001].
Експериментальними дослщженнями встановлено, що за методом FDA picT колонш тест-штам1в був значно швидшим, шж на селективних середовищах за методом ISO нав1ть при низьких дозах контамшаци м'ясного фаршу. Це дозволило одержувати результати в коротш1 термши.
Нами удосконалено метод FDA на основ! застосування тюглжолевого середовища з селективною добавкою (гентамщин сульфат - 2 мг; цефалексин -156 мг; рифампщин - 150 мг ¿з розрахунку на 1 л1тр поживного середовища) як середовища збагачення. Модифжований метод забезпечував виявлення кампшобактерш у дослщжуваних зразках на piBHi 1 КУО/г (для С. jejuni) -вщсутшсть збудника в 25 г продукту, а також збереження стабшьност1 бюлопчних властивостей бактерш Campylobacter spp. Натврщка консистенщя тюглколевого середовища створювала додатков1 мжроаерофшьш умови для росту цих мжрооргашзм1в, що сприяло штенсившшому росту колонш кампшобактерш i виявленню перших ознак ix росту пор1вняно з виЫвом проб харчових продукта у рщю поживш середовища. Отримаш результати свщчать про збереження стабшьност1 властивостей бактерш роду Campylobacter, picT i'x культур мав характерш ознаки. Це дало змогу щентиф1кувати щ мжрооргашзми за характерними морфолопчними ознаками колонш у коротш1 строки (через 16-18 год культивування) та сприяти пщвищенню ефективносп дослщжень.
KpiM того проведено дослщження в пор1вняльному аспект! ефективност1 метод1в кшьккного анал1зу на предмет контамшаци Campylobacter spp. продукци птах1вництва за м1жнародними стандартами. Встановлено, що метод видшення бактерш роду Campylobacter за м1жнародним стандартом FDA, 2001 мае переваги над вщповщним методом дослщжень за ДСТУ ISO 10272-1:2007 у швидкост1 росту колонш за найменших доз контамшаци (10 КУО) i дае змогу одержувати результати за коротш1 термши (через 24 год).
Модифжований нами метод видшення Campylobacter spp. i3 продовольства FDA, 2001 на основ1 застосування тюглжолевого середовища з селективною домшкою (гентамщин сульфат - 2,0 мг; цефалексин - 156 мг; рифампщин - 150 мг) на еташ збагачення контамшованих проб забезпечив отримання чисто! культури Campylobacter spp., високий р1вень чутливост1 при дослщженш проб i3 р1внем контамшаци 1 КУО/г. Запропонований cnoci6
106
видшення м1крооргашзм1в роду Campylobacter i3 харчових продукта затверджений в установленому порядку (Патент Укра!ни 50353).
Ефектившсть мжробюлопчних дослщжень залежить вщ метод1в бактерюлопчних дослщжень та якост! поживних середовищ. Пщб!р та оптим1зацш складових компонента середовища поживного щшьного для культивування Campylobacter spp. проводили за критер1ями забезпечення прискореного росту кампшобактерш, збереження бюлопчних властивостей ¿золята при культивуванш, а також накопичення виходу бактер1ально! маси.
До основного складу дослщно! композици включали: протеозопептон, печшковий та др1жджовий екстракти - як бшкову основу, натрш бурштиновокислий (натрш сукцинат) - стимулятор росту культур Campylobacter spp., натрш хлорид - для регулювання осмотичного тиску та агар-агар. Оптимальний склад шгред1ента поживного щшьного середовища для культивування кампшобактерш забезпечуе picT Campylobacter spp. у поавних концентращях 10-109 КУО / мл, a nepmi ознаки росту виявити через 17-24 год за мжроаерофшьних умов культивування. Поживне середовище сприяе росту Bcix тест-штам1в кампшобактерш у дозах 10-109. Зареестровано picT C. jejuni 70.2Т у чашках Петр! з поавами 10-109КУО/см3, C. coli та 43477 С. lari в
t f А Л t ^ А л
концентрациях 10 -10 КУО/см , С. fetus 5396 в концентрациях 10 -10 КУО/см та С. bubulus 53103 - у чашках Петр! з поЫвною дозою 106-109 КУО/см3. Запропоноване поживне середовище вщповщае вимогам Свропейсько! фармакопе! щодо бактерюлопчного контролю ростових властивостей поживних середовищ, забезпечуе штенсивний picT Campylobacter spp., збереження бюлопчних властивостей ¿золята за культивування, а також активне накопичення значно! кшькост! живих бактер1альних кл1тин Campylobacter spp. 8,93±0,21*106 КУО/см3, що в 1,3 раза перевищуе аналопчний показник у контроле На розроблений продукт оформлена i зареестрована нормативна документащя (ТУ У 24.4-14332579-056:2010) та отримано патент на корисну модель Украши № 36641 «Поживне середовище для кампшобактерш» (вщ 10.11.2008 р.).
Складшсть ¿золяци м!крооргашзм!в роду Campylobacter i3 патолопчного матер1алу, об'ект1в зовшшнього середовища та харчових продукпв зумовлюеться випереджальним ростом на поживних середовищах супутньо! мжрофлори. Селективна ¿золящя кампшобактерш передбачае обов'язкове внесения до складу поживних середовищ cyMimi селективних компонента -х1мютерапевтичних засоб1в як окремо, так i в р1зних поеднаннях, яю пригшчують picT супутньо! мжрофлори. На пщстав! результата проведених дослщжень встановлено, що до поживних середовищ для селективно! ¿золяци Campylobacter spp. доцшьно додавати антиб!отики у таких кшькостях на 1 л: гентамщину 2 мг; цефалексину 156 мг; рифамп!цину 150 мг виробництва ЗАТ НВЦ «Борщапвський ХФЗ» (м. Ки!в). На розроблений продукт оформлена i зареестрована нормативна документац!я (ТУ У 24.4-14332579-066:2012) «Селективна домплка до поживних середовищ для ¿золяци Campylobacter spp.».
107
Отримано патент на корисну модель Украши 65594 «Cnoci6 селективно! ¿золяци м1крооргашзм1в роду Campylobacter i3 харчових продукта».
Також нами розроблено технологш отримання д1агностичних кампшобактерюзних аглютинуючих сироваток. Застосування розроблено! технолог!! отримання д!агностично! ками!лобактер!озно! аглютинуючо! сироватки, що включае и'ятикратну, з штервалом 7 д!б, ¿мушзацш тварин-иродуцент!в антигенним штамом C. jejuni spp. jejuni С. 2008 у поеднанш з ¿муностимулятором «Тимогеном» у доз! 10 мкг/кг (одночасно з !н'екц!ею антигена), препаратом «Трив!тамш» у доз! 1 см3/гол. одноразово в третш ш'екци, забезпечуе одержання високих титр!в специф!чних антит!л -3886±1437. Отриман! результати св!дчать, що запропонована нами схема ¿мушзаци тварин-донор!в камп!лобактер!озних сироваток виявилася ефективною - сироватки характеризувалися високим р!внем вмкту аглютин!н!в. Оптимальна концентрац!я м!кробних кл!тин у завис!, що використовуеться як антиген в РА з кампшобактерюзними д!агностичними сироватками, становить 3*109 м.к/см3. Специф!чшсть отриманих сироваток вивчали в РА ¿з антигенами спор!днених м!кроорган!зм!в: S. typhimurium; E. coli; P. vulgaris; E. aerogenes. При цьому встановлено, що отриман! нами сироватки не давали перехресних реакцш ¿з антигенами гетеролопчних вид!в м!кроорган!зм!в - РА ¿з м!кробними зависями цих вид!в м!кроб!в була негативною у вихщному розведенн! сироваток (1:25). Це свщчить про високу специф!чн!сть аглютинуючих кампшобактерюзних сироваток. Отже, поеднання дп ¿муностимулятора та в!там!нного препарату е ефективною комбшащею препарат!в р!зних груп i терм!н!в !х застосування для активаци механ!зм!в ¿муштету. Отримана д!агностична кампшобактерюзна аглютинуюча сироватка використовувалася нами в робот! для серолопчно! тип!зац!! ¿золят!в Campylobacter spp. На п!дстав! проведено! роботи i отриманих результат!в нами одержано патент Украши на корисну модель 61997 «Cnoci6 одержання д!агностично! сироватки кампшобактерюзно! аглютинуючо!».
Отже, за результатами проведених експериментальних досл!джень нами науково обгрунтовано i розроблено засоби д!агностики: поживне середовище та селективна добавка для ¿золяци камп!лобактер!й, технолопя отримання д!агностично! камп!лобактер!озно! аглютинуючо! сироватки. Гармошзовано методи як!сного та кшьккного анал!зу контам!новано! Campylobacter spp. продукци птах!вництва за м!жнародними стандартами, розроблено нормативш документи в!дпов!дно до законодавства GC, що забезпечуе ефективн!сть роботи та належну як!сть д!агностичних дослщжень.
Одержан! результати отримали практичне значения. На пщстав! одержаних результат!в експериментальних дослщжень розроблено систему заход!в контролю щодо камп!лобактер!озу на етапах вирощування, забою i переробки курей. Результати експериментальних дослщжень використано при складанш таких нормативних документ!в: 1нструкци з проф!лактики та л!кв!дац!! кампшобактерюзу птиц!, затверджено! наказом М!н!стерства аграрно! пол!тики та продовольства Укра!ни 28.09.2011 № 502 та зареестрована в
108
MiHicTepcTBi юстици Украши 14.10.2011 р. за № 1192/19930; Науково-методичних рекомендациях «Видшення м!крооргашзм!в роду Campylobacter i3 продукци птах1вництва та порядку И ветеринарно-саштарно! експертизи», затверджених на засщанш Науково-методично! ради Державного ком1тету ветеринарно! медицини Украши (протокол № 1 вщ 23.12.2010 р.); Науково-методичних рекомендащях «Ветеринарно-саштарного контролю м'яса птиц! та яйцепродукив на наявшсть збудниюв зооноз1в (Campylobacter, E.coli O157, Enterobacteriacae, Listeria, Salmonella, Pseudomonas, Yersinia). Bifl6ip проб.», затверджених Науково-методичною радою Державного компоту ветеринарно! медицини Украши (протокол № 4 вщ 21.12.2011 р.); «Мкробюлопчш критери для боень (вщповщно до законодавства £С)».
За результатами дослщжень вперше теоретично й експериментально обгрунтовано систему контролю кампшобактерюзу курей на основ! розробки засоб1в та метод1в його д1агностики.
Висновки.
1. Показано, що метод видшення бактерш роду Campylobacter i3 харчових продукта за м1жнародним стандартом FDA, 2001 мае переваги над вщповщним методом дослщжень за ДСТУ ISO 10272-1:2007 у швидкост1 росту колонш при найменших дозах контамшаци (10 КУО) й дае змогу одержувати результати за коротш1 термши (через 24 год). Метод визначення р1вня контам1нац11 м'яса птиц1 кампшобактер1ями за м1жнародним стандартом ДСТУ ISO 7218:1996 кращий в1дпов1дного методу дослщжень, регламентованого ДСТУ ISO 102721:2007, за р1внем (вищий на 4,0-5,1 %), термшом ¿нкубац!! (менший на 1 добу) та за трудомюткктю досл1дження.
2. Розроблене поживне щшьне середовище для культивування камп1лобактер1й, що включае: протеозопептон 15,0 г; печшковий екстракт 5,0 г; др1жджовий екстракт 5,0 г; натрш бурштиновокислий 2,0 г; натрш хлорид 3,0 г; агар-агар 8,0 г та воду дистильовану до 1 л, дозволяе забезпечити picT Campylobacter spp. у поавних концентрац1ях 10-109 КУО/мл, a nepmi ознаки росту виявити через 16 год за мшроаерофшьних умов культивування.
3. Запропонована селективна добавка з антибактер1альних препарат1в, до складу яко! входять; мг: гентам1цин сульфат 2,0; цефалексин 156; рифамп1цин 150 на 1 л поживного середовища, забезпечуе селективну ¿золяц1ю м1кроорган1зм1в роду Campylobacter, пригшчуючи picT супутньо! мкрофлори (E. coli, S. enteritidis, L. monocitogenes, P. multocidae, S. aureus, P. vulgaris, P aeruginosa). Модифкований метод видшення Campylobacter spp. на основ! застосування тюпколевого середовища з селективною добавкою (гентам1цин сульфат - 2,0 мг; цефалексин - 156 мг; рифампщин - 150 мг) на еташ збагачення контам1нованих проб забезпечив отримання чисто! культури Campylobacter spp., високий р1вень чутливост1 у процеЫ досл1дження проб i3 р1внем контам!нац1! 1 КУО/г.
4. Застосування розроблено! технолог!! отримання д!агностично! кампшобактерюзно! аглютинуючо! сироватки, що включае п'ятикратну, з ¿нтервалом 7 д!б, ¿мушзацш тварин-продуцент!в антигенним штамом
109
C. jejuni spp. jejuni С.2008 у поеднанш з ¿муностимулятором «Тимогеном» у доз1 10 мкг/кг (одночасно з ш'екщею антигена), препаратом «Трив1тамш» у доз1 1 см3/гол. одноразово в третш ш'екцп, забезпечуе одержання високих титр iß специф1чних антитш - 3886±1437.
Перспективи подальших дослщжень. Будуть розроблеш методи експрес-д1агностики збудник1в токсикошфекцш та токсикоз1в на виявленш i'x на Bcix етапах харчового ланцюга.
Л1тература
1. М1кроб1олог1я харчових продукт1в i корм1в для тварин. Горизонтальний метод виявлення i пщрахунку камп1лобактер1й (Campylobacter spp). Частина 1. Метод виявлення (ISO 10272-1:2006, IDT) : ДСТУ ISO 10272-1:2007. - [Чинний вщ 2006-08-03]. - К.: Держспоживстандарт Укра!ни, 2007. - 28 с. -(Нацюнальний стандарт Укра!ни).
2. М1кроб1олог1я харчових продукта i корм1в для тварин. Загальш настанови м1кроб1олог1чних досл1джень (ISO 7218:1996, IDT) : ДСТУ ISO 7218:2008. - [Чинний вщ 2011-01-01]. - К.: Держспоживстандарт Украши, 2008. - 11 с. - (Нацюнальний стандарт Украши).
3. Мжробюлопя харчових продукта i корм1в для тварин. Настанови щодо готування та виробництва поживних середовищ. Частина 1. Загальш настанови щодо виготовлення поживних середовищ гарантовано! якост1 в лабораторй' (ISO/TS 11133-1:2000, IDT) : ДСТУ ISO/TS 11133-1:2005. - [Чинний В1Д 2008.03.01]. - К. : Держспоживстандарт Украши 2008. - 23 с. (Нацюнальний стандарт Украши).
4. Посуд лабораторний скляний. Колби Mipm з одшею позначкою : (ISO 1042:1998, IDT) : ДСТУ ISO 1042:2005. - [Чиннийий В1Д 2008-01-01]. - К. : Держспоживстандарт Украши, 2008. - 24 с. - (Нацюнальний стандарт украши).
Рецензент - д.вет.н., професор Сл1вшська Л.Г.
110
