CC BY
19
Бычков Виталий Григорьевич, доктор медицинских наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ, заведующий кафедрой патологической анатомии, ГБОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия» Минздрава России, Россия, 625023, г. Тюмень, ул. Одесская, д. 54, тел.: (3452) 20-05-34, e-mail: kulikova@tyumsma.ru.
УДК 579.25:616.921.8
© Г.А. Ивашинникова, О.Ю. Борисова, А.В. Алешкин, А.С. Пименова, 2012
Г.А. Ивашинникова, О.Ю. Борисова, А.В. Алешкин, А.С. Пименова УСКОРЕННЫЙ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ МЕТОД ТИПИРОВАНИЯ ШТАММОВ BORDETELLA PERTUSSIS ПО СТРУКТУРЕ ПРОМОТОРА PTXP КОКЛЮШНОГО ТОКСИНА
ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии
им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора
Разработан новый ускоренный молекулярно-генетический способ типирования штаммов Bordetella pertussis по структуре промотора коклюшного токсина (ptxP). Метод основан на полимеразной цепной реакции с анализом длин рестрикционных фрагментов амплифицированных продуктов (ПЦР-ПДРФ), который позволяет получить характерный рестрикционный профиль и дает возможность дифференцировать штаммы с особенностями структуры промотора ptxP и, как следствие, с увеличенной продукцией коклюшного токсина.
Ключевые слова: Bordetella pertussis, рестрикционный анализ, промотор коклюшного токсина.
G.A. Ivashinnikova, O.Yu. Borisova, A.V. Aleshkin, A.S. Pimenova THE EXELERATED METHOD OF MOLECULAR GENOTYPING OF BORDETELLA PERTUSSIS STRAINS USING THE STRUCTURE OF PTXP PERTUSSIS TOXIN PROMOTER
The new exelerated method of molecular genotyping was developed for studying the structure of pertussis toxin promoter (ptxP). The method was based on restriction fragment length polymorphism of amplified fragments (PCR-RFLP), allowed to study the specific restriction profiles of the B. pertussis strains and gave the ability to differentiate the strains with structural particularities of promotor ptxPand as a result with increased pertussis toxin production.
Key words: Bordetella pertussis, restrictive analysis, pertussis toxin promoter.
Введение. Молекулярно-генетический мониторинг штаммов Bordetella pertussis, проводимый во многих странах мира и в России, показал, что штаммы B. pertussis подвержены генетической вариабельности, затрагивающей гены, которые кодируют основные факторы патогенности возбудителя. Было установлено, что штаммы с новыми «невакцинными» аллелями этих генов постепенно вытесняют штаммы со старыми «вакцинными» аллелями генов [1, 2, 3, 4, 5]. Недавние многочисленные исследования доказали важность происходящих в областях генома изменений, регулирующих экспрессию генов основных факторов патогенности, в частности, в промоторе коклюшного токсина (ptxP) [3, 4, 5]. В настоящее время единственным методом для определения генетической структуры ptxP является прямое секвенирование с последующим анализом нуклеотидной последовательности. Однако данный метод является длительным, трудоемким, дорогостоящим и не может быть использован для ускоренного слежения за циркулирующими штаммами при проведении микробиологического и молекулярногенетического мониторинга в системе эпидемиологического надзора за коклюшной инфекцией.
Цель: разработать ускоренный молекулярно-генетический метод типирования штаммов B. pertussis по структуре ptxP.
Материалы и методы исследования. Изучено 258 штаммов B. pertussis, выделенных от больных коклюшем в Российской Федерации в 2000-2012 гг., а также 84 штамма B. pertussis, выделенные в 1948-1999 гг. (из коллекции ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского). Микробиологическое исследование штаммов B. pertussis проводили согласно инструкции (1983 г.). Постановку ПЦР осуществляли
согласно опубликованному протоколу [4]. Анализ нуклеотидных последовательностей после секвени-рования проводили с использованием программ BLAST [6] и баз данных EMBL/GenBank [7, 8].
Результаты исследования и их обсуждение. В процессе изучения генетической структуры ptxP у штаммов B. pertussis методом секвенирования выявлены три варианта последовательности нуклеотидов, которые полностью совпадали с данными EMBL/GeneBank и соответствовали трем аллелям промотора ptxP. Так, для ptxР1 и ptxP3 аллелей в положении (-167) характерным является нуклеотид С, в то время как для ptxP2 аллеля - нуклеотид Т. Во втором положении - (-65) для аллелей ptxP1 и ptxP2 характерным является нуклеотид G, а для третьего варианта - нуклеотид А. Показано [4], что новый «невакцинный» ptxP3 аллель промотора имеет значимые мутационные изменения, затрагивающие функциональную область, отвечающую за связывание с BvgA димером, что приводит к усилению прочности связи, оказывающей влияние на экспрессию оперона ptx и, как следствие, увеличению продукции коклюшного токсина (КТ) [4, 5].
Нами разработан ускоренный молекулярно-генетический метод типирования штаммов B. pertussis по структуре промотора ptxP коклюшного токсина на основании ПЦР-ПДРФ анализа, который позволяет получить характерный рестрикционный профиль, связанный с генотипом штамма. Метод включает в себя выделение ДНК штаммов B. pertussis, постановку полимеразной цепной реакции с использованием специфичных праймеров PF и PR, последовательную обработку эндонуклеазами KpnI и MluI с проведением электрофореза в агарозном геле для разделения рестрицированных фрагментов ампликонов и дальнейшей визуализацией результатов в ультрафиолетовом спектре. Выбор эндонуклеаз обусловлен тем, что последовательность нуклеотидов в положениях 313-318 ptxP1 и ptxP2 аллелей промотора коклюшного токсина создают сайт рестрикции для эндонуклеазы KpnI (5’-GGTACC-3’), а нуклеотидная последовательность ptxP2 аллеля промотора в положениях 206-211 -для эндонуклеазы MluI (5’- ACGCGT-3’). Дифференциация штаммов, несущих ptxP3 аллель промотора, от штаммов, несущих ptxP2 и ptxP 1 аллели, основана на отсутствии сайтов рестрикции для эндонуклеаз MluI и KpnI в нуклеотидной структуре ptxP3 аллеля. В свою очередь, отсутствие сайтов рестрикции для эндонуклеазы MluI в нуклеотидной структуре ptxP1 аллеля создает возможность дифференциации штаммов, несущих ptxP1 аллель промотора, от штаммов, несущих ptxP2 аллель. Нуклеотидная структура ptxP2 аллеля промотора в положениях 313-318 и 206-211 создает сайты рестрикции для эндонуклеаз KpnI и MluI, соответственно. После обработки ампликонов промотора ptxP эндонуклеазой рестрикции KpnI и постановки электрофореза выявляли два варианта рестрикционного профиля. Для одной группы штаммов был характерен рестрикционный профиль с наличием двух специфических светящихся фрагментов размером 315 и 217 п.н. (тип KpnI-1), что соответствовало размеру специфических светящихся фрагментов ДНК контрольных штаммов B. pertussis, несущих ptxP1 и PtxP2 аллели промотора КТ, для второй группы штаммов - наличие одного специфического светящегося фрагмента размером 532 п.н. (тип KpnI-2), что соответствовало размеру фрагмента ДНК контрольного штамма B. pertussis, несущего ptxP3 аллель. Следовательно, после рестрикции с эндонуклеазой KpnI можно дифференцировать штаммы, несущие ptxP1 и ptxP2 аллели, от штаммов, несущих ptxP3 аллель промотора.
Для точной дифференциации штаммов, несущих ptxP1 и ptxP2 аллели промотора, проводили обработку ампликонов эндонуклеазой рестрикции MluI. После проведения электрофореза и визуализации результатов рестрикции выявили две группы штаммов, имеющих разный набор специфических светящихся фрагментов (рис.). Для первой группы характерным было наличие двух специфических светящихся фрагментов размером 321 и 211 пар нуклеотидов (тип MluI-1), что соответствовало профилю контрольного образца ДНК штамма B. pertussis, несущего ptxP2 аллель промотора. Для второй группы штаммов характерным было наличие одного специфического светящегося фрагмента размером 532 пар нуклеотидов (тип MluI-2), что соответствовало профилю контрольных образцов ДНК штаммов, несущих ptxP 1 и ptxP3 аллели промотора. Следовательно, после рестрикции с эндонуклеазой MluI можно дифференцировать между собой штаммы, несущие ptxP1 и ptxP2 аллели промотора коклюшного токсина. С использованием разработанного метода молекулярно-генетического типиро-вания изучена генетическая структура ptxP 342 штаммов B. pertussis. При сопоставлении данных, полученных в разработанном методе и при прямом секвенировании фрагментов ptxР, оказалось, что для 57 (24,6 %) штаммов характерным был рестрикционный профиль типов KpnI-1 и MluI-2 и данные штаммы при секвенировании несли ptxP1 аллель промотора. 24 (10,3 %) штамма характеризовались рестрикционным профилем KpnI-1 и MluI-1 и имели ptxP2 аллель, и 151 (65,1 %) штамм характеризовался рестрикционным профилем KpnI-2 и MluI-2 и несли ptxP3 аллель промотора.
Рис. Рестрикционный профиль участка промотора ptxP исследуемых штаммов B. pertussis (1-5, 7-11 - исследуемые пробы ДНК; 6 - маркер молекулярных весов, DNA ladder Mix)
Заключение. Разработанный метод мониторинга штаммов B. pertussis по структуре ptxP промотора на основе ПЦР-ПДРФ анализа дает возможность дифференцировать штаммы с особенностями структуры промотора ptxP и является инструментом при мониторинге штаммов возбудителя коклюша, позволяющим проводить наблюдение за циркулирующей популяцией B. pertussis, выявлять высоковирулентные штаммы и следить за их распространением.
Список литературы
1. Борисова, О. Ю. Молекулярно-генетический метод ускоренного выявления штаммов Borde-tella pertussis, обладающих различными ptx генами / О. Ю. Борисова, С. Ю. Комбарова, Н. Т. Гадуа, И. К. Мазурова // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2008. - № 5. - С. 80-83.
2. Мазурова, И. К. Динамика изменчивости основных генов патогенности штаммов В. pertussis, выделенных от больных коклюшем в Москве (1948-2005 гг.) / И. К. Мазурова, О. Ю. Борисова, С. Ю. Комбарова // Молекулярная медицина. - 2008. - № 1. - С. 40-45.
3. Lam, C. Selection and emergence of pertussis toxin promoter ptxP3 allele in the evolution of Borde-tella pertussis / C. Lam, S. Octavia, Z. Bahrame // Infect. Genetic Evolution. - 2012. - Vol. 12. - P. 492-495.
4. Mooi, F. R. Bordetella pertussis strains with increased toxin production associated with pertussis resurgence / F. R. Mooi, I. H. van Loo, M. van Gent // Emerg. Infect. Dis. - 2009. - Vol. 15, № 8. - P. 1206-1213.
5. Nygren, M. Polymorphism in the pertussis toxin promoter region affecting the DNA-based diagnosis of Bordetella infection / M. Nygren, E. Reizenstein, M. Ronaghi // J. Clin. Microbiology. - 2000. -Vol. 38. - P. 55-60.
6. BLAST. - Режим доступа : http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, свободный. - Яз. англ. - Дата обращения: 28.09.2012.
7. EMBL. - Режим доступа : http://www.embl.org/, свободный. - Яз. англ. - Дата обращения: 28.09.2012.
8. GenBank. - Режим доступа : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank, свободный. - Яз. англ. -Дата обращения: 28.09.2012.
Ивашинникова Галина Антоновна, младший научный сотрудник лаборатории диагностики дифтерийной инфекции, ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, Россия, 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10, тел.: (495) 459-21-46, e-mail: Ivashinnikova@gmail.com.
Борисова Ольга Юрьевна, доктор медицинских наук, главный научный сотрудник лаборатории диагностики дифтерийной инфекции, ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, Россия, 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10, тел.: (495) 459-21-46, e-mail: olgborisova@mail.ru.
Алешкин Андрей Владимирович, доктор биологических наук, заведующий лабораторией микробиологии и биотехнологии бактериофагов, ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, Россия, 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10, тел.: (495) 452-07-88, e-mail: ava@gabri.ru.
