CC BY
3
Е. Я. ЗИНОВЬЕВА (Москва>
Ускоренное исследование пищевых продуктов на бактерии кишечно-тифозной группы
В деле обеспечения санитарной безвредности продуктов роль бактериологических лабораторий была определена обращением ЦК ВКП(б) от 22.XII.1933 г.: «Не допускать к переработке некондиционного« не отвечающего технологическим требованиям сырья и полуфабрикатов, в частности, не допускать к производству ни один вид сырья и полуфабрикатов без установленного для них химико-бакте-риологического контроля».
- «Не выпускать с предприятия готовой продукции без тщательного анализа ее в химико-бактериологических лабораториях». (Из обращения ЦК ВКП(б) от 22.XII.1933 т.)
Как правило, существующие пищевые бактериологические лаборатории, пользуясь несовершенными методами исследования, не могут обеспечить своевременного контроля продуктов и дать точные анализы их.
С таким положением нельзя мириться.
Бактериальная неоднородность сырья, поступающего, с одной стороны, от технически оснащенных и высоко организованных хозяйств, с другой стороны — от мелких кустарных производств, заставляет обратить особое внимание на необходимость своевременного бактериологического контроля сырья до пуска его в производство.
Быстро дать точный анализ — вот задача бактериолога пищевика.
Некоторые советские и заграничные лаборатории занялись вопросом сокращения сроков производства анализов. Из опубликованных в нашей печати работ в данной области отметим статьи об исследовании воды в лаборатории Рублевской станции Московского водопровода (журнал «Микробиология», 1932, в. 4) и об исследовании мяса, произведенном А. М. Казаковым в Институте мясной промышленности («Вопросы питания», 1936 г., № 5).
Целью настоящей работы является максимальное сокращение сроков производства бактериологического анализа путем изменения методики исследования устранением жидких сред желчи и Эйкмана и заменой их посевом определенного количества вещества непосредственно (без накопления) на твердую среду Эндо.
Опытные анализы на среду Эндо проводились следующим образом.
Стерильно взятая навеска в 2—3 г разбавлялась в колбе теплой (около' 40°) водой в 5—10 раз \
Колба ставилась в шюттель-аппарат с электроприводом, где содержимое ее тщательно разбалтывалось в течение 10 минут.
Полученная эмульсия в количестве 0,1 см3, при сильно загрязненном продукте 0,01 см3, засевалась на среду Эндо и тщательно растиралась шпателем, после чего чашка ставилась в термостат при температуре 37°.
Через 15—18 часов подозрительные колонии засевались в подогретые до 40° сахара пестрого ряда (лактоза, сахароза, маннит, глю-
1 Санитарные пробы (смывы с поверхности столов, аппаратуры и оборудова-
ния, а также с рук рабочих), взятые смоченным водой тампоном, разбавлялись
водой в 5 раз. Наименее загрязненное сырье разбавлялось также в 5 раз.
коза, мальтоза) и на косой агар, затем выращивались в термостате при 37°.
При отсутствии изменения в лактозе и сахарозе через 3—4 часа ставилась пробная агглютинация на стекле и дополнялся пестрый ряд молоком Минкевича, бульоном Готтингера и желатиной.
После отбивки подозрительных колоний производился подсчет типичных колоний кишечной палочки на чашке с предварительным просмотром морфологии и проверкой брожения в лактозе (при большом количестве — выборочно). Лактозодефективные разновидности кишечной палочки — В. рагасоН — также учитывались при установлении степени фекального загрязнения.
Наряду с опытными анализами, производились контрольные:
1. Для выявления тифозно-паратифозной группы обычный посев в желчь, на следующий день высев с желчи на среду Эндо, далее отвивка на косой агар
Рис. 1 и 2. Чашки Петри с непосредственным посевом пищевых продуктов
на среду Эндо
подозрительных колоний и, наконец, на 4-й день проведение их по пестрому ряду.
2. Для установления титра кишечной палочки посев в среду Эйкмана (Кес-слера) падающих количеств исследуемого продукта. Количество разведений и засеваемых пробирок со средой Эйкмана зависело от предполагаемой степени загрязненности продукта. Так, меланж засевался в 8—10 пробирок, масло и кремы—в 4 пробирки.
Таким образом, чашка со средой Эндо исключает среду накопления (желчь) и заменяет собой среду Эйкмана, одновременно позволяя судить о степени загрязненности продукта бактериями кишечной группы и давая материал для дальнейших исследований в виде подозрительных колоний.
Поставленные нами в лаборатории фабрики «Большевик» опыты по замене среды накопления (желчь) непосредственным посевом на элективную среду Эндо дали оледующие результаты (табл. 1).
Анализируя приведенную таблицу, мы видим, что из 230 случаев в 162 (70,4%) наблюдается сов/падение опыта с контролем, т. е. при пересеве с желчи на среду Эндо и при непосредственном посеве вещества на среду Эндо получены одни и те же результаты.
В 64 случаях, или 27,8%, посев непосредственно на среду Эндо дал положительный результат, в то время как ореда накопления
Таблица Г
Сравнительная таблица результатов, полученных при посеве непосредственно на среду Эндо (о ыт) и в среду накопле)ия (желчь) (контроль)
Количество случаев совпадения: опыт —
л <и та V р-> ч контроль +
со v_ о о СО О с В. faecalis alcaligenes
* О 4) О СО о g ° е CQ S В. coli commui РЗ та а, CQ S H Он СчЗ f-ч S"« >2 га С, к Всего
171 111 6 6 _ 123 71,9
Крем сливочный ••..... 49 32 — — — 1 33 67,3
Меланж, крем-безе..... 10 5 — — — 1 6 60,0
Всего. . . 230 148 6 — 6 2 162 70,4
Коли чество случае .в несс впадения: ou ыт +
контроль —
Масло сливочное ...... 171 11 11 11 9 2 44 25,7
Крем сливочный ...... • 49 3 6 4 1 2 16 32,6
Меланж, крем-безе..... 10 — — 2 — 2 4 40,0
Всего. . . 230 14 17 17 10 6 64 27,8
Масло сливочное ...... 171 1 — 3 — — 4 2,3
Крем сливочный ...... 49 — — — —; — — —
Меланж, крем-безе..... 10
Всего. . . 230 1 — 3 — — 4 1,8
(желчь) показала отрицательный. Это значит, что при обычном широко распространенном методе посева мы потеряли бы из 16 случаев обнаружения представителей паратифозной группы 10, или 63%.
Кишечная палочка из 185 случаев обнаружена только в 154. В 31 случае (20%) она ускользает из поля зрения.
Еще более показательны потери при посеве в желчь в отношейии В.. paracoli и В. faecalis alcaligenes, наличие которых также характеризует качество пищевого продукта: из 25 случаев в 23 (92%) указанные бактерии не были обнаружены обычным методом (желчью); в 4 случаях (что составляет 1,8% общего количества случаев) с непосредственного посева на среду Эндо не были выделены кишечная палочка (1 случай) и В. paracoli (3 случая).
Из табл. 1 видно, что среда накопления (желчь), задерживая рост граммположительных бактерий, задерживает также и рост граммот-рицательных кишечной группы (в том числе паратифозные бактерии).
В 1933 г. бактериологическим отделением института им. Пастера в Ленинграде была проведена работа по оценке основных методов обогащения микробов тифозно-паратифозной группы из испражнений, сточных и питьевых вод1.
1 Труды Ленинградского института им. Пастера за 1935 г.
Полученные данные говорят не в пользу большинства распространенных сред обогащения. В отношении желчи в заключении сказано: «Использование желчной среды для целей обогащения микробов тифозно-паратифозной группы испражнений, сточных и питьевых вод, практикующееся в широком масштабе и в настоящее время, должно быть безусловно оставлено».
Кроме того, работа эта приводит литературные данные: «Форнэ, изучив бактерицидное влияние желчи на тифозную палочку, отмечает, что при посеве в желчь единичных тифозных клеток последние погибают. При засеве больших количеств (5 ООО ООО) размножение идет, за счет резистентных и устойчивых клеток».
Проверка другой среды накопления — Мюллера 'была проведена т. Хаджидимовой в Институте эпидемиологии и микробиологии (микробиологическое отделение) в Иванове \
При обследовании faeces реконвалесцентов на бациллоношение т. Хаджиди-мова пришла к выводу, что наиболее высокий процент положительных результатов дает метод непосредственного посева материала шпателем на элективную среду Падлевского или на плацентарный агар без накопления в среде Мюллера.
По полученным т. Хаджидимовой данным из 55 посевов положительный результат дали при непосредственном посеве (по тифу, паратифу А и паратифу В) 26 посевов и только 15 выявила среда накопления Мюллера. В другом случае из 40 опытов 14 показали положительный результат на твердой среде и только 1 на среде Мюллера.
Начало применения желчи как чреды накопления положили медицинские лаборатории. Не получая директив и инструкции от руководящих органов по методике работы, пищевые бактериологические лаборатории .стали пользоваться методикой исследований, разработанной для медицинских лабораторий. Но в настоящее время последние уже отказались от посева в желчь как ib среду накопления и пользуются посевом непосредственно на среду Эндо, пищевые же бактериологические лаборатории продолжают применять желчь при исследовании продуктов питания на кишечно-тифозную группу.
Бактериологическая лаборатория фабрики «Большевик» уже в течение нескольких месяцев .применяет при своих исследованиях разнообразных пищевых продуктов и санитарных проб посев непосредственно на среду Эндо и параллельно на желчь. Полученные результаты также подтверждают несостоятельность желчи как среды накопления. Так, при непосредственном посеве на среду Эндо обнаружены бактерии паратифозной группы в 6 случаях, тогда как посев в желчь не дал ни одного случая.
В ходе опытов по замене желчи непосредственным посевом на элективную среду в отношении мало загрязненных объектов накоплен сравнительный материал в количестве 230 анализов по концентрации бактерий методом центрифугирования, как это было предложено для молока А. А. Миллером («Санитарная бактериология») и мяса А. М. Казаковым. В наших опытах центрифугирование производилось через 10—20—30—45 минут. Производился посев как осадка, так и верхнего слоя эмульсии. Полученные результаты не выявили существенной разницы в отношении качественной и количественной миклофлоры между различными сроками центрифугирования и посевом без центрифугирования.
Перейдем теперь к вопросу о замене среды Эйкмана непосредственным посевом на среду Эндо.
Бродильные среды Эйкмана, Кесслера at др. дают нам возможность судить о степени загрязненности кишечной палочкой объекта исследования не меньше чем через три дня. Кроме того, они часто не обнаруживают кишечной палочки в объектах, большая обсеменен-ность которых этим микробом заведомо известна. Наконец, данные среды часто затрудняют определение титра вследствие наличия кишечной палочки в больших разведениях и отсутствия ее в меньших.
Все это, вместе взятое, побудило нас искать новых путей определения титра. Идя по линии отказа от бродильных сред, мы попыта-
1 «Лабораторная практика», № 5, 1937 г.
лись использовать среду Эндо для определения титра кишечной палочки путем засева определенного количества вещества на чашку с последующим подсчетом выросших колоний кишечной палочки и пересчетом их на 1 грамм вещества.
Для проверки возможности определения титра посевом непосредственно на среду Эндо было произведено 525 опытных анализов и столько же контрольных, из них масла сливочного 243, кремов сливочных 43, пирожных с сливочным кремом 114, меланжа 26, крема-безе 23 и санитарных проб 76. Контролем служил посев в среду Эйкмана, как обычно при определении титра кишечной палочки при исследовании пищевых продуктов.
Результаты определения титра кишечной палочки, полученного посевом непосредственно на среду Эндо и по методу Эйкмана, приведены в табл. 2.
Таблица 2
Среднее количество кишечной палочки в 1 г пищевых продуктов при посеве непосредствечно на среду Эндо и по методу Эйкмана!
Количество произведенных анализов Н а и м е н о в'а н и е объекта Среднее количество кишечной палочки в 1 г
при непосредственном посеве на среду ЭнАо по методу Эйкмана
243 43 114 23 26 Масло сливочное .... Крем сливочный . . . . Пирож ое с сливочным кремом ........ Крем-безе........ Меланж........ 45 539,7 35 3^3,8 18437,2 71 788,8 244140,9 3 268,1 3 326,0 2285,6 3 967 о 202 773,0
Среднее по пищевым продуктам 449 762 Санитарные пробы . . 83 046,0 191 443,1 43 123,9 4122.3
Из табл. 2 видно, что среднее количество кишечной палочки в различных пищевых продуктах и ® санитарных пробах, обнаруженное по посеву непосредственно на среду Эндо, значительно выше, чем полученное по методу Эйкмана, ; ;!/
В отдельных случаях при посеве 0,1 г вещества в среду Эйкмана кишечная палочка не была обнаружена, и то время как посев 0,01 г непосредственно на среду Эндо дал десятки и даже сотни колоний на чашке, следовательно, 'тысячи и десятки тысяч кишечной палочки в 1 г.
Столь значительное расхождение результатов анализов на кишечную палочку в пищевых продуктах и санитарных пробах методами непосредственного посева определенных количеств вещества на чреду Эндо и по методу Эйкмана заставило нас провести опыты по выявлению кишечной палочки в среде Эйкмана через различные промежутки времени.
Высевы в два срока, через сутки и двое суток, показали, что в большинстве случаев (67°/о) кишечная палочка не могла быть выявлена на вторые сутки в том
1 Высев со среды Эйкмана на среду Эндо производился через 48 часов, как указано в инструкции по проведению санитарно-микробиологических исследований в кондитерской промышленности (Спецредактор—Акимов И. Г., 1936 г.).
2 Количество кишечной палочки в 1 см3 смыва.
разведении, в котором она была обнаружена через одни сутки. Вместо кишечной палочки мы наблюдали на вторые сутки усиленное развитие дрожжей и различных кокков. При этом рН среды менялся в сторону повышения кислотности так: при исходном рН=7,4—-7,6 мы имели через сутки от 6,6 до 4,6, через двое суток от 5,8 до 4,0.
Но, несмотря на то, что количество кишечной палочки, выявленное в суточной среде Эйкмана, значительно превышало двухсуточное, все же посев непосредственно на среду Эндо дал значительно больше кишечной палочки в 1 г, чем через одни сутки.
Показательны работы по выявлению преимущества непосредственного посева на твердую среду (Эндо) бактериологической лаборатории Московского водопровода в Рублеве, производившей параллельные посевы воды по Эйкману и по Марману. Метод Мармана состоит в посеве малых объемов воды (5—10 см3) непосредственно на среду Эндо и испарении ее с последующим выращиванием в течение 24 часов при температуре 41° (Рублевская лаборатория засевала 1 см8 воды).
Систематизированный материал по месяцам за ,4 года дал такую картину (табл. 3):
• Таблица 3
Среднее количество кишечной палочки в 1 см3 воды реки Москвы по Эйкману и по Марману за 1928— 1931 гг1.
Год Количество Среднее количество кишечной палочки в 1 см3 по методу
анализов Эйкмана Мармана
1928 .5....... 117 4,3 9,0
1929 ........ 149 3,0 4,0
1930 ........ 163 3,2 3,4
1931........ 252 3,0 4,2
Среднее за все годы ■ 681 3,4 5,2 %
Как дидно из приведенных цифр, и здесь метод непосредственного посева обнаружил большее количество кишечной палочки, чем1 метод Эйкмана, а это значит, что он является более точным.
Если в .отношении воды метод Эйкмана дает заниженные результаты по сравнению с действительным, то при анализе продуктов, обладающих плохой растворимостью (масло, кремы), этот способ является еще .менее точным. ■ •
При засеве в среду Эйкмана падающих количеств продукта кусочки жира, задерживаясь на внутренней и наружной стенках пипетки, могут попасть в большие разведения и дать в них брожение при отсутствии его в меньших разведениях, что затруднит установление титра. Употребление же для каждого разведения (6—8 и больше при сильно загрязненном продукте) отдельной пипетки практически трудно осуществимо в условиях производственных лабораторий. К тому же и в данном случае не исключена возможность прилипания к каждой пипетке кусочков жира в процессе посева из различных разведений в пробирки со средой Эйкмана. При быстром же непосредственном посеве на среду Эндо определенного количества тщательно разбалтываемого в теплой воде масла, крема и других продуктов, содержащих жир в большом проценте, такое явление исключается.
1 Таблица составлена по материалам Рублевской лаборатории, сведенным в табличную форму (журнал «Микробиология» за 1932 г., в. 4).
Производя подсчет колоний кишечной палочки на среде Эндо через 14—18 часов и делая затем пересчет на 1 г вещества, мы получим степень загрязнения продукта представителями кишечной группы.
В случае слишком густого роста на чашке и невозможности подсчета колоний достаточно отметить «не поддается учету», что уже само по себе характеризует качество исследуемого продукта.
Все же если необходимо выявить точное количество кишечной палочки в определенном объеме сильно загрязненного продукта, то при посеве можно пользоваться микропипеткой, позволяющей засеять на чашку с элективной средой 0,001 г вещества. Допустимо также применение двух чашек Эндо, причем на одну следует посеять 0,01 г вещества и, на другую 0,001 г. В практике лаборатории фаб- ■ рики мы пользуемся двумя чашками при посеве сильно загрязненного меланжа.
Определяя методом Эйкмана титр кишечной палочки таких сильно загрязненных пищевых продуктов, как меланж, .масло сливочное и пр., приходится делать большое количество разведений (меланж — до 0,000000001 г и более) и, следовательно, засевать много пробирок со средой Эйкмана (8—10). Все это усложняет производство анализа, требует много времени, требует ,много питательных сред и в то же время не дает точных результатов.
К тому же нередки случаи получения на элективной среде Эндо со среды Эйкмана нехарактерных колоний кишечной палочки без металлического блеска, которые приходится проводить по пестрому ряду с предварительной отвивкой на косой агар, и в большинстве случаев расчисткой, что еще более усложняет работу по определению титра кишечной палочки и, самое главное, отодвигает получение результата анализа на 1х/2—2 суток сверх обычного срока.
Замена среды Эйкмана для определения титра кишечной палочки непосредственным посевом на среду Эндо определенных количеств вещества дает возможность втрое быстрее получить результат, значительно сокращает работу по производству самого посфа и вместе с тем повышает точность анализов.
Если при работе с водой, для которой и был предложен метод Эйкмана, он не оправдал себя и теперь заменяется непосредственным посевом на элективную среду (Рублевская станция), то тем больше оснований отказаться от него при исследовании пищевых продуктов.
Реферируя статьи американских бактериологов об усовершенствовании бродильных сред, А. С. Разумов пишет: «Реферируемые работы, а также ранее появлявшиеся на эту тему (см. сводку, Нортон, реф. «Микробиология», 3 стр. 296, 1934 г.) показывают, что усовершенствование санитарно-бактериологического анализа воды, основанного на бродильных пробах, безнадежно и что основным недостатком его является не состав сред для брожения и накопления, а самый метод титра, связанный с применением жидких сред, в которых устанавливаются почти не учитываемые и трудно регулируемые взаимоотношения бактерий, развивающихся и внесенных с испытуемой водой. Применение плотных сред в первом этапе анализа позволяет устранить указанное затруднение»1.
Выигрыш во времени при посевах на среду Эндо иллюстрируется данными табл. 4.
Если исключить часы одновременного выращивания в термостате посевов в желчь и среду Эйкмана, то общая затрата времени на получение результатов исследования обычным методом выразится в 3,9—5,0 днях. Ускоренный же способ дает возможность сократить этот срок до 22—26 часов, а в отдельных случаях при наличии активной культуры или отсутствии лактозодефективных штаммов еще на несколько часов.
1 Журнал «Микробиология», т. V, в. 5, стр. 740, 1936 г.
Таблица 4
Эффективность ускоренного метода в отношении сроков получения результатов анализа1
Общепринятые методы исследования Время, затрачиваемое на выращивание (в часах) Ускоренный метод Время, затрачиваемое на выращивание (в часах)
10-12 Непосред-ств. Эндо 18-20
На среду Эндо со среды накопления . . . Выращивание на косом агаре выделенной со среды Эндо колонии ........... Среда Эйкмана для определения титра кишечной палочки ............ 18-20 Пестрый ряд . . 4—6
18-12 24—48 Итого 22—26
На среду Эндо со среды Эйкмана..... 18—20
Пестрый ряд............... 24
Итого. . . 104—136
Кроме того, ускоренный метод значительно снижает затраты рабочего времени на самое производство анализа. Если обычным методом требуется на один анализ не менее 86 минут, то при ускоренном достаточно 54У2 минут, вследствие сокращения отдельных процессов работы, как-то: 1) приготовление разведений, 2) ¡посев в среду Эйк-мана, 3) пересев со среды Эйкмана и желчи на среду Эндо .и 4) занесение в журнал забродивших пробирок, роста на среде Эндо с желчи в среды Эйкмана. На все это в общей сложности расходуется 31У2 минута на каждый анализ.
Упразднение отдельных процессов работы, неизбежных при обычном методе, с переходом :на ускоренный способ позволяет значительно увеличить количество анализов и, следовательно, шире развернуть работу и стать действительно контрольным органом на производстве. ,
Лаборатория фабрики «Большевик», внедрив ускоренный метод, тем самым осуществила предварительный контроль сырья, поступающего в цехи. Сырье, поступающее на складе," обследуется бактериологической лабораторией для установления его доброкачественности и возможности использования без термической обработки (масло сливочное, употребляемое при изготовлении сливочных кремов, различные фруктовые начинки, помадки, цукаты и пр.).
Меланж, подвергающийся термической обработке, пройдя бактериологический анализ, распределяется в соответствии со степенью своей загрязненности по различным цехам фабрики; наиболее ч&бтый меланж направляется в цех № 3 (венские изделия, торты., пирожные). Таким образом, лаборатория фабрики, применяя ускоренный метод анализа, смогла обеспечить выпуск доброкачественной в санитарном отношении продукции.
1 Агглютинация не включена потому, что случаи, требующие постановки ее, редки при наших исследованиях.
(Выводы
1. Желчь как среда накопления при исследовании пищевых продуктов (масло сливочное, кремы сливочные и безе, меланж и пр.), а также санитарных анализах (смывы /с рук, с поверхности столов, аппаратуры, оборудования и пр.) не оправдывает своего назначения. Заменяя ее непосредственным посевом вещества на элективную среду Эндо, мы выигрываем в быстроте и точности анализов. -
2. Применение среды Эйкмана (Кесслера) для определения титра кишечной палочки в названных объектах исследования также не оправдывает себя. Замена ее непосредственным посевом на среду Эндо строго определенных количеств вещества с последующим подсчетом типичных колоний на чашке втрое ускоряет производство анализов, давая вместе с тем более точные результаты.
Таким образом, непосредственный посев! определенных количеств вещества на среду Эндо обеспечивает двойное использование чашки; одна чашка Эндо, заменяя собой две среды — желчь и Эйкмана, — дает полноценный материал: а) для отвивки подозрительных колоний, б) для суждения о степени загрязненности! исследуемого продукта бактериями кишечцюй группы.
3. Применение агглютинационных пробирок (вместо обычных) с малым количеством (1 см3) подогретых питательных сред в несколько раз сокращает срок получения результатов по пестрому ряду.
4. Введение ускоренного метода повышает производительность труда более чем на 50% и тем самым переводит работу лаборатории на стахановские рельсы. С переходом на ускоренный метод бактериологическая лаборатория сможет осуществить свою роль передового звена в борьбе за качество продуктов питания.
4 Гигиена и санитары I, № в
