Уровни сывороточного il-4 и экспрессия его рецептора на Т-хелперах периферической крови пациентов с хронической обструктивной болезнью легких

Виткина Т.И.; Сидлецкая К.А.; Минеева Е.Е.

24. Veremchuk L.V., Yankova V.I., Vitkina T.I., Naz-arenko A.V., Golokhvast K.S. Urban air pollution, climate and its impact on asthma morbidity. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine. 2016; 6 (1): 76-79.

25. Янькова В.И., Гвозденко Т.А., Голохваст К.С., Чайка В.В., Городный В.А. Гранулометрический анализ атмосферных взвесей экологически благополучного и неблагополучного районов Владивостока

// Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2014; 56 (2): 62-66.

Yan'kova V.I., Gvozdenko T.A., Golokhvast K.S., Chayka V.V., Gorodnyj V.A. Granulometric analysis of atmospheric suspensions of environmentally favorable and unfavorable areas of Vladivostok.

Zdorov'e. Meditsinskaya yekologiya. Nauka. 2014; 56 (2): 62-66. (RUS).

Сведения об авторе

Т.И. Виткина, д.б.н., профессор РАН, заведующая лабораторией медицинской экологии и рекреационных ресурсов Владивостокского филиала ФГБНУ «Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания» - Научно-исследовательский институт медицинской климатологии и восстановительного лечения, 690105, г. Владивосток, ул. Русская, 73-г, e-mail: [email protected].

Удк 616.24:616-002.2:571.27

Т.И. Виткина, К.А. Сидлецкая, Е.Е. Минеева

уровни сывороточного il-4 и экспрессия его рецептора на т-хелперах периферической крови пациентов с хронической обструктивной болезнью легких

Владивостокский филиал ФГБНУ «Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания» -Научно исследовательский институт медицинской климатологии и восстановительного лечения, г. Владивосток

Цель - изучить динамику сывороточного содержания IL-4 и уровня экспрессии его рецептора (IL-4R) на Т-хелперах (CD4+) периферической крови при прогрессировании хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ). В исследование были включены 112 пациентов с ХОБЛ стабильного течения: 36 человек с ХОБЛ I спирометрического класса (с. кл.), 52 человека с ХОБЛ II с. кл. и 24 человека с ХОБЛ III с. кл. В контрольную группу вошли 32 условно здоровых человека. Уровни IL-4, IL-6, IL-10, IL-17А, IFN-y и TNF-a диагностировали в сыворотке крови методом проточной цитометрии, концентрации TGF-ß1 и IL-21 измеряли методом иммуноферментного анализа. На основании соотношения цитокинов были выявлены типы Т-хелперного ответа. Определение количества CD4+, экспрессирующих IL-4R, в крови больных ХОБЛ и здоровых лиц проводили методом проточной цитометрии. Согласно полученным данным, концентрация IL-4 в крови больных ХОБЛ оставалась ниже контрольного значения на всех стадиях заболевания вне зависимости от типа Th иммунного ответа. Однако, по мере прогрессирования ХОБЛ наблюдалось повышение сывороточного уровня IL-4. Было выявлено, что количество CD4+-клеток, экспрессирующих IL-4R, оставалось ниже контрольного значения на всех стадиях ХОБЛ. Низкое количество CD4+CD124+-клеток в крови пациентов на всех стадиях ХОБЛ, несмотря на рост концентрации IL-4 по мере прогрессирования заболевания, свидетельствует о подавлении IL-4 сигналинга на Т-хелперах. Мы предполагаем, что это связано с деградацией рецептора и является компенсаторным механизмом, направленным на ограничение воспалительного процесса. При ХОБЛ происходит увеличение концентрации сывороточного IL-4 в сочетании с понижением уровня экспрессии IL-4R на Т-хелперах, что отражает снижение их отклика.

Ключевые слова: хроническая обструктивная болезнь легких, IL-4, IL-4Ra. Для корреспонденции: Сидлецкая К.А., e-mail: [email protected].

T.I. Vitkina, K A. Sidletskaya, E.E. Mineeva

the changes of serum level of il-4 and expression of its receptor

on t-helpers of peripheral blood of patients with chronic obstructive pulmonary disease

Vladivostok Branch of the Far Eastern Scientific Center of Physiology and Pathology of Respiration - Research Institute of Medical Climatology and Rehabilitation Treatment, Vladivostok, Russia

Materials of the All-Russian Scientific and Practical Conference •

The aim is to study the dynamics of serum IL-4 content and the level of expression of its receptor (IL-4R) on peripheral blood T-helper (CD4+) in the progression of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). The study included 112 patients with stable COPD: 36 people with COPD of I spirometric class (s. c.), 52 patients with COPD of II s. c. and 24 people with COPD of III s. c. The control group included 32 conditionally healthy people. Levels of IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, IFN-y and TNF-a were diagnosed in blood serum by flow cytometry, concentrations of TGF-pi and IL-21 were measured by enzyme immunoassay. Types of T-helper response were identified based on the ratio of cytokines. The determination of the number of CD4+, that express IL-4R, in blood of COPD patients and healthy people was performed by flow cytometry. According to the obtained data, IL-4 concentration in the blood of COPD patients remained below the control value at all stages of the disease, regardless of Th type immune response. However, there was an increase in the serum level of IL-4 as COPD progresses. It was found that the number of CD4+ cells expressing IL-4R remained below the control value at all stages of COPD. A low number of CD4+CD124+ cells in the blood of patients at all stages of COPD, despite the increase in IL-4 concentration as the disease progresses, indicate the inhibition of IL-4 signaling on T-helper cells. We assume that it is due to the degradation of the receptor and it is a compensatory mechanism aimed at limiting the inflammatory process. There is an increase in serum IL-4 concentration in combination with a decrease in the expression level of IL-4R on T-helper cells in COPD, it is reflected in a decrease in responsiveness these cells.

Keywords: chronic obstructive pulmonary disease, IL-4, IL-4Ra.

For correspondence: Sidletskaya K.A., e-mail: [email protected].

Conflict of interest. The authors are declaring absence of conflict of interests.

Financing. The study had no sponsor support.

Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) на сегодняшний день относится к глобальным медико-социальным проблемам. Опасения специалистов всего мира в отношении ХОБЛ обусловлены не только широкой распространенностью заболевания, но и высоким риском серьезных осложнений, приводящих к инвалидизации и смерти трудоспособного населения [1]. Ежегодно от ХОБЛ умирает около 2,8 млн. человек [2].

Воспаление является ключевым элементом патогенеза ХОБЛ и носит системный характер [3, 4]. Системное воспаление характеризуется нарушением баланса про- и противовоспалительных цитоки-нов [5]. IL-4 является одним из наиболее важных цитокинов, действие которых направлено на ограничение воспаления. Он представляет собой гли-копротеин массой 15 кДа, который секретируется Т-хелперами 2 типа (Th2), гранулоцитами, тучными клетками и моноцитами/макрофагами. Его противовоспалительный эффект проявляется в блокировании продукции провоспалительных цитокинов эф-фекторными клетками. IL-4 инициирует передачу сигнала в клетку через мембранный рецепторный комплекс, который может быть двух типов. Рецептор к IL-4 (IL-4R) I типа состоит из а-цепи (IL-4Ra) и у-цепи. Данный тип рецептора находится на поверхности иммунных клеток и связывается с IL-4 с высокой специфичностью. IL-4R II типа состоит из двух субъединиц - IL-4Ra и IL-13Ra1, экспрессируется некроветворными клетками и обладает способностью связывать как IL-4, так и IL-13. Действие IL-4 осуществляется за счёт запуска Janus kinase/Signal Transducer and Activator of Transcription (JAK/STAT)

сигнального пути, основного пути внутриклеточной передачи сигнала с цитокинового рецептора [6, 7].

Данные о роли ^-4 в формировании системного воспалительного процесса при ХОБЛ остаются противоречивыми. В одних работах отмечается снижение его концентрации в крови больных ХОБЛ [8], в других, наоборот, - повышение [10]. Это не позволяет дать однозначный ответ на вопрос о том, какую роль ^-4 играет в воспалительных реакциях при ХОБЛ. Исследование уровней экспрессии IL-4Ra (CD124) проводилось только в контексте локального воспалительного процесса, было отмечено повышение уровня белка IL-4Ra в легочных тканях [10, 11]. Работ, посвященных изучению роли CD124 в системном воспалении у больных ХОБЛ, в литературе не встречается.

Целью работы является изучение динамики содержания сывороточного ^-4 и уровня экспрессии его рецептора на Т-хелперах периферической крови при прогрессировании хронической обструктивной болезни легких.

Материалы и методы. Работа выполнена в соответствии с требованиями Хельсинкской декларации (пересмотр 2013 г.) с одобрения локального Биоэтического комитета.

В клинике Института было обследовано 112 пациентов с ХОБЛ стабильного течения, от каждого из них получено добровольное информированное согласие на проведение обследования. ХОБЛ диагностировали на основании данных анамнеза, объективного осмотра, пикфлоуметрии, спирографии с выполнением бронхолитического теста (спирограф «FUKUDA», Япония), результатов тестов с

HEALTH. MEDICAL ECOLOGY. SCiENCE 4 (71) - 2017 41

помощью модифицированного вопросника «British Medical Research Council» (mMRC) и вопросника «COPD Assessment Test» (САТ), рентгенологического и лабораторного исследования.

Все пациенты с ХОБЛ были разделены на три группы GOLD: 36 человек с ХОБЛ I спирометрического класса (с. кл.) (GOLD I), 52 человека с ХОБЛ II с. кл. (GOLD II) и 24 человека с ХОБЛ III с. кл. (GOLD III) [1]. Все пациенты были сопоставимы по возрасту и полу, средний возраст пациентов с ХОБЛ составлял 57,5±4,8 года. В период обследования никто из пациентов не получал регулярной противовоспалительной терапии. Критериями исключения были сопутствующие хронические заболевания в фазе обострения. В контрольную группу вошли 32 условно здоровых лица, некурящих, с нормальной функцией внешнего дыхания, средний возраст составлял 42,0±3,4 года.

Для исследования цитокиновых профилей пациентов и здоровых лиц была использована сыворотка крови. Уровни IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, IFN-y и TNF-a определяли методом проточной цитометрии по принципу мультиплексного количественного анализа (цитометр «BD FACS CantoII»; тест-система «Cytometric Bead Array», фирма BD, США). Для обработки данных использовалась программа FCAP 3.0 (фирма BD, США). Концентрации циркулирующих TGF-pi и IL-21 измеряли методом иммунофермент-ного анализа (тест-система «Genzyme diagnostics», США). Учет результатов иммуноферментного анализа осуществляли с помощью спектрофотометра «PowerWave» (фирма BioTec) при длине волны 540 нм. Полученные величины выражались в пг/мл. На основании соотношения цитокинов, являющихся значимыми для определенных субпопуляций Th-клеток, - INF-y, TNF-a (Th1 цитокины), IL-4, IL-10 (Th2 цитокины), IL-17 (Th17 цитокин), были выявлены типы Т-хелперного ответа [8].

В качестве материала для исследования уровня экспрессии мембранного рецептора IL-4R на Т-хелперах (CD4+-клетки) у больных ХОБЛ и здоровых лиц использовали цельную кровь. Для определения числа клеток, экспрессирующих IL-4R, использовали меченые моноклональные антитела к a-субъединице этого рецептора (IL-4Ra) - CD124 (PE). Фенотипирование лейкоцитов по кластерам дифференцировки осуществляли с помощью меченых моноклональных антител: CD45 (APC-H7), CD3 (FITC), CD4 (PE-Cy7). Измерение уровней экспрессии названных поверхностных маркеров проводили на цитометре «BD FACS CantoII» с использованием реагентов фирмы BD (США). Полученные данные обрабатывали с помощью программы FACS Diva (фирма BD, США). Количество клеток, несущих на мембране исследуемый рецептор, выражали в процентах.

Статистическую обработку данных проводили с использованием программы «Statistica 6.0 для Windows». Результаты статистической обработки всех данных представляли в виде медианы, верхнего и нижнего квартилей. Для проверки совпадения распределения исследуемых количественных показателей с нормальным в группах пользовались критерием согласия Колмогорова-Смирнова, для проверки гомогенности дисперсии - критерием Левена. Для решения проблемы множественных сравнений использовали поправку Бонферрони. Статистическую значимость различий уровней цитокинов между группами оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Критический уровень значимости (р) при проверке статистических гипотез принимался при значении менее 0,05. Статистическую значимость различий уровней экспрессии IL-4R на Т-хелперах между группами определяли при помощи непараметрического критерия Краскела-Уоллиса. Различия считались статистически значимыми при р<0,01.

Результаты. На основании соотношений уровней сывороточных цитокинов, характерных для определенных субпопуляций Th-клеток, у пациентов с ХОБЛ разного с. кл. стабильного течения были выявлены преобладающие типы иммунного ответа - Th1 и Th17. Была исследована динамика изменения концентрации IL-4 в сыворотке крови больных ХОБЛ, у которых воспаление развивалось в соответствии с Th1, либо Th17 типом иммунного ответа.

При Th1 пути иммунного ответа у больных ХОБЛ I с. кл. было отмечено статистически значимое снижение уровня противовоспалительного цитокина -IL-4 на 42% (на 32,5 пг/мл, р<0,05) в сыворотке крови по сравнению с контрольной группой (77,9 пг/мл, р<0,05). При ХОБЛ II и III с. кл. его концентрация оставалась ниже контрольного значения - на 28% (на 21,7 пг/мл, р<0,05) и на 17,5% (на 13,6 пг/мл) соответственно. Th17 путь иммунного ответа у пациентов с ХОБЛ I с. кл. характеризовался уменьшением содержания IL-4 на 24% (на 18,6 пг/мл, р<0,05) по сравнении с контрольным уровнем. У пациентов с ХОБЛ II с. кл. содержание исследуемого цитокина в крови было ниже контрольного значения на 20% (на 15,5 пг/мл, р<0,05). При ХОБЛ III с. кл. наблюдалась тенденция к увеличению его уровня относительно контроля на 4% (на 3,3 пг/мл).

В ходе исследования были определены уровни экспрессии IL-4R на Т-хелперах периферической крови больных ХОБЛ разного с. кл. стабильного течения и здоровых лиц в виде относительного количества клеток, несущих на своей мембране а-субъединицы этого рецептора - IL-4Ra (CD124). Полученные данные отображены на рис.

Materials of the All-Russian Scientific and Practical Conference

Уровень Т-хелперов, экспрессирующих мембранный рецептор к И-4, в крови больных ХОБЛ разного спирометрического класса (показатели посчитаны относительно группы контроля, взятой за 100%) ** - р<0,01 статистическая значимость различий в сравнении с группой контроля

У пациентов с ХОБЛ I с. кл. число CD4+CD124+-клеток в крови было ниже контрольного значения на 69% (на 4,2%, р<0,01). В группе пациентов с ХОБЛ II с. кл. уровень Th-клеток, экспрессирующих IL-4R, был ниже контрольного значения на 67% (на 4,1%, р<0,01). При ХОБЛ III с. кл. количество исследуемых клеток оставалось ниже контрольного значения на 64% (на 3,9%, р<0,01) (рис.).

Обсуждение. В данной работе мы исследовали содержание сывороточного IL-4 при различных Th типах иммунного ответа и уровень экспрессии мембранного рецептора к IL-4 (IL-4R) на Т-хелперах периферической крови при прогрессировании ХОБЛ.

Согласно полученным данным, концентрация IL-4 в крови больных ХОБЛ оставалась ниже контрольного значения на всех стадиях заболевания вне зависимости от типа Т-хелперного ответа. Однако по мере прогрессирования ХОБЛ наблюдалось повышение сывороточного уровня IL-4 при обоих типах Th иммунного ответа. На начальном этапе заболевания значение этого параметра у пациентов с ХОБЛ, развивающейся по Th17 пути, было значительно выше в сравнении с группой пациентов с Th1 путем. При развитии системного воспаления по Th17 пути увеличение синтеза IL-4 было более интенсивным, чем при формировании Th1 пути. Таким образом, можно предположить, что IL-4 вносит вклад в развитие воспалительной реакции при ХОБЛ.

Воздействие IL-4 на Т-хелперы опосредовано экспрессией CD124+ на поверхности клеток [6]. Взаимодействие IL-4 с IL-4R индуцирует активацию Janus киназ, которые затем инициируют сигнальный каскад, приводящий к связыванию STAT6 с промо-торными участками определенных генов [6, 7].

IL-4R участвует не только в противовоспалительном ответе, как считалось раньше, но и может быть вовлечен в патогенетические реакции при

ХОБЛ. Недавно было показано, что у пациентов с ХОБЛ и БА усиливается экспрессия убиквитин-ли-газы STUB1 (STIP1 homology and U-Box containing protein) в легочном эпителии. Белок STUB1 взаимодействует с IL-4Ra и опосредует деградацию рецептора, тем самым регулируя IL-4 сигналинг. У мышей дефицитных по STUB1 происходит усиление IL-4R сигналинга и наблюдаются признаки воспаления легких [10]. В ходе исследования было определено, что количество CD4+-клеток, экспрессирующих IL-4R, оставалось ниже контрольного значения на протяжении всех стадий ХОБЛ. Низкое количество CD4+CD124+-клеток в крови пациентов на всех стадиях ХОБЛ, несмотря на рост концентрации IL-4 по мере прогрессирования заболевания, свидетельствует о снижении отвечаемости Т-хелперов на IL-4 сигнал. Возможно, это связано с деградацией рецептора с помощью STUB1 и является компенсаторным механизмом, направленным на ограничение воспалительного процесса.

Заключение. Полученные новые данные могут послужить основой для теоретического обоснования клеточно-молекулярных механизмов развития системного воспаления при ХОБЛ. Роль IL-4 и его рецептора в патогенезе ХОБЛ и молекулярные механизмы IL-4 сигналинга требуют дальнейшего изучения.

Выводы. При ХОБЛ происходит увеличение концентрации сывороточного IL-4 в сочетании с понижением уровня экспрессии IL-4R на Т-хелперах, что отражает снижение их отвечаемости.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование. Исследование было проведено без финансовой поддержки.

HEALTH. MEDiCAL ECOLOGY. SCiENCE 4 (71) - 2017 43

ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES

1. Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease, Pocket Guide to COPD Diagnosis, Management, and Prevention, a Guide for Health Care Professionals (2017 edition).

2. Burney P.G.J., Patel J., Newson R., Minelli C., Naghavi M. Global and regional trends in COPD mortality, 1990-2010. European Respiratory Journal. 2015; 45(5): 1239-1247; doi: 10.1183/09031936.00142414.

3. Durham A.L., Caramori G., Chung K.F., Ad-cock I.M. Targeted anti-inflammatory therapeutics in asthma and chronic obstructive lung disease. Transla-tional Research. 2016; 167(1): 192-203, doi: 10.1016/j. trsl.2015.08.004.

4. Kalinina E.P., Denisenko Yu.K., Vitkina T.I., Lobanova E.G., Novgorodtseva T.P., Antonyuk M.V., Gvozdenko T.A., Knyshova V.V., Nazarenko A.V. The Mechanisms of the Regulation of Immune Response in Patients with Comorbidity of Chronic Obstructive Pulmonary Disease and Asthma. Canadian Respiratory Journal. 2016; 2016: 1-8, doi: 10.1155/2016/4503267.

5. Виткина Т.И., Денисенко Ю.К., Сидлецкая К.А. Изменение экспрессии рецептора к IL-6 на поверхности иммунокомпетентных клеток при про-грессировании хронической обструктивной болезни легких // Медицинская иммунология. 2017; 19(2): 191-196; doi: 10.15789/1563-0625-2017-2-191-196.

Vitkina T.I., Denisenko Ju.K., Sidltskaya K.A. Change in the expression of the receptor for IL-6 on the surface of immune cells in the progression of chronic obstructive pulmonary disease. Meditsinskaya immu-nologiya. 2017; 19(2): 191-196; doi: 10.15789/15630625-2017-2-191-196. (RUS)

6. McCormick S.M., Heller N.M. Commentary: IL-4 and IL-13 receptors and signaling. Cytokine. 2015; 75(1): 38-50; doi.org/10.1016/j.cyto.2015.05.023.

7. May R.D., Fung M. Strategies targeting the IL-4/ IL-13 axes in disease. Cytokine. 2015; 75(1): 89-116; doi.org/10.1016/j.cyto.2015.05.018.

8. Vitkina T.I., Denisenko Yu.K., Davydova K.A. The changes in the profile of cytokines in progressing chronic obstructive pulmonary disease. International Research Journal. 2016; 49(7): 6-8; doi: 10.18454/ IRJ.2016.49.024.

9. Конопля Е.Н., Мансимова О.В., Шелухина А.Н., Дорофеева С.Г. Фармакологическая коррекция иммунных нарушений у пациентов с ХОБЛ. Научный медицинский вестник. 2015; 2: 18-24; doi: 10.17117/nm.2015.02.018.

Konoplya E.N., Mansimova O.V., Sheluhina A.N., Dorofeeva S.G. Pharmacological correction of immune disorders in patients with COPD. Nauchnyi medicinskiy vestnik. 2015; 2: 18-24, 10.17117/nm.2015.02.018. (RUS)

10. Wei Q., Sha Y., Bhattacharya A., Fattah E.A., Bonilla D., Jyothula S.S., Pandit L., Hershey K.K., Eissa, N. T. Regulation of IL-4 receptor signaling by STUB1 in lung inflammation. American journal of respiratory and critical care medicine. 2014; 189(1): 16-29; doi: 10.1164/rccm.201305-08740C.

11. Matej R., Vasakova M., Kukal J., Sterclova M., Olejar T. Higher TGF-p with lower CD124 and TSLP, but no difference in PAR-2 expression in bronchial biopsy of bronchial asthma patients in comparison with COPD patients. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 2014; 22(7): 543-549; doi: 10.1097/PAI.0b013e3182a500a3.

Сведения об авторах

Виткина Т.И. .д.б.н., профессор РАН, ведущий научный сотрудник лаборатории биомедицинских исследований Владивостокского филиала ФГБНУ «Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания» - Научно исследовательский институт медицинской климатологии и восстановительного лечения; e-mail: [email protected];

Сидлецкая К.А. лаборант-исследователь лаборатории биомедицинских исследований Владивостокского филиала ФГБНУ «Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания» - Научно исследовательский институт медицинской климатологии и восстановительного лечения; 690035; e-mail: [email protected];

Минеева Е.Е., к.м.н., научный сотрудник лаборатории восстановительного лечения, врач функциональной диагностики, врач-пульмонолог клинического подразделения Владивостокского филиала ФГБНУ «Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания» - Научно-исследовательский институт медицинской климатологии и восстановительного лечения, 690105, г. Владивосток, ул. Русская, 73-г, e-male: [email protected].

УДК 615.834/838

Т.А. Гвозденко

актуальные аспекты реализации рекреационного потенциала дальнего востока

Владивостокский филиал ФГБНУ «Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания» -Научно-исследовательский институт медицинской климатологии и восстановительного лечения, г. Владивосток

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Виткина Т. И., Сидлецкая К. А., Минеева Е. Е.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Виткина Т. И., Сидлецкая К. А., Минеева Е. Е.

THE CHANGES OF SERUM LEVEL OF IL-4 AND EXPRESSION OF ITS RECEPTOR ON T-HELPERS OF PERIPHERAL BLOOD OF PATIENTS WITH CHRONIC OBSTRUCTIVE PULMONARY DISEASE