CC BY
8
Оригинальные статьи
УРОВЕНЬ ЭКСПРЕССИИ И КОЭКСПРЕССИИ ЭСТРОГЕНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ а И ß В ТКАНИ НЕМЕЛКОКЛЕТОЧНОГО РАКА ЛЕГКИХ
Т. А. Богуш1, О. М. Рябинина1, М. И. Папулина2, Е. А. Богуш1, А.Н. Гришанина1, А. В. Карпухин3, Б. Е. Полоцкий1, М. М. Давыдов1
1ФГБУ«НМИЦонкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24; ФГБОУВО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова»; Россия, 119991 Москва, Ломоносовский пр-т, 27, корп. 1; 3ФГБНУ«Медико-генетический научный центр»; Россия, 115478 Москва, ул. Москворечье, 1
Цель исследования — количественная оценка уровня экспрессии и коэкспрессии эстрогеновыхрецепторов разных типов (ЭРа и ЭРв) в ткани опухолей большой когорты больных немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ).
Материалы и методы. Исследованы хирургические образцы НМРЛ (167) иммунофлуоресцентным методом, сопряженным с проточной цитометрией. Оценен уровень экспрессии маркеров, который рассчитывали как количество специфически флуоресцирующих клеток в процентах по отношению к контролю (инкубация с вторичными антителами). Результаты. Экспрессия ЭРа и ЭРв выявлена в 100 % исследованных образцов НМРЛ, при этом отмечена значительная вариабельность показателей и в большинстве случаев — превышение уровня экспрессии ЭРв в сравнении с ЭРа — в 1,5—2,0 раза и более. В целом по группе медиана показателя для ЭРа составила 19 %, а для ЭРв — 43 %. Коэффициент ранговой корреляции Спирмена оказался равным 0,364 (р <0,001), а коэффициент корреляции Пирсона — 0,401 (р <0,001), что указывает на наличие статистически значимой прямой слабой взаимосвязи между показателями уровня экспрессии ЭРв и ЭРа. Заключение. ЭРв могут являться основной мишенью антиэстрогенов и ориентиром для отбора пациентов с НМРЛ для проведения гормональной терапии.
Ключевые слова: немелкоклеточный рак легкого, эстрогеновые рецепторы а и в, проточная цитофлуориметрия
DOI: 10.17650/1726-9784-2018-17-4-111-114
LEVEL OF ESTROGEN RECEPTOR a AND p EXPRESSION AND COEXPRESSION IN NON-SMALL CELL LUNG CANCER TISSUE
T.A. Bogush1, O.M. Ryabinina', M.I. Papulina2, E.A. Bogush', A.N. Grishanina1, A. V. Karpukhin3, B.E. Polotsky1, M.M. Davydov1
'N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia; 24 Kashirskoe Shosse,
Moscow '15478, Russia
2M.V. Lomonosov Moscow State University; ' bldg., 27Lomonosovsky pr-t, Moscow '1999', Russia; 3Research Centre for Medical Genetics; ' Moskvorechie St., Moscow '15478, Russia
Objectives. Quantitative assessment of the expression and co-expression levels of estrogen receptors of different types (ERa and ERP) in malignant tissues of large cohort of patients with non-small cell lung cancer (NSCLC).
Materials and methods. Measurement of ERa and ERP expression levels was carried out on '67 malignant tissue samples by immunofluorescence flow cytometric method. Level of the ERa and ERP expression was calculated as a ratio of specifically fluorescent cells (%) compared to the control (incubated with the secondary antibody only).
Results. The expression of ERa and ERP was detected in all the NSCLC samples investigated. High variability in the level of the marker expression was revealed and it was shown ',5-2,0-fold higher ERP expression in the most tumors than that for ERa. The Spearman rank correlation coefficient of0,364 (p <0,00') and the Pearson correlation coefficient of 0,40' (p <0,00') indicate statistically significant weak positive correlation between the levels of expression of ERP and ERa.
Conclusion. The level of expression of ERP as a main subtype of ER in NSCLC tissue could prove useful for selecting patients for antiestrogen therapy.
Key words: non-small cell lung cancer, estrogen receptors a andP, flow cytofluorimetry
Контакты: Татьяна Анатольевна Богуш labmedchem@mail.ru
4'2018 ТОм 17 | VOL. 17
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSIAN JOURNAL OF BiOTHERAPY
Введение
Эстрогеновые рецепторы (ЭР) являются важнейшей клеточной мишенью, воздействуя на которую можно не только контролировать процессы канцерогенеза, но и подавлять рост опухолевых клеток. Блестящим подтверждением этого служит результат многолетнего (с начала 1970 годов) применения та-моксифена у больных раком молочной железы с положительным статусом ЭР опухоли. Препарат эффективен в адъювантном (послеоперационном) режиме и позволяет значительно улучшить отдаленные результаты хирургического лечения, снижая риск рецидива заболевания и смертность больных.
В последние годы ЭР, а значит и мишени антиэстрогенов, обнаружены в клетках различных злокачественных новообразований (немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ), рака предстательной железы, рака пищевода, колоректального рака, рака яичников, рака эндометрия и др.) [1—5]. Это дает основания полагать, что антиэстрогеновая гормонотерапия в случае положительного статуса ЭР различных опухолей будет давать результаты, сходные с результатами лечения рака молочной железы. Однако вопрос об антиэстрогеновой терапии других опухолей до сих пор лишь обсуждается в научных публикациях [6].
В клетках человека присутствуют 2 изоформы ЭР: альфа (ЭРа) и бета (ЭРр). Их соотношение, а также клеточное и тканевое распределение подвержено широкой вариабельности, но в любом случае экспрессия как ЭРа, так и ЭРр ассоциирована с ответом на антиэстрогеновую терапию. Стимуляция пролиферации клеток НМРЛ под воздействием эстрогенов, так же как и ингибирование пролиферации при воздействии антиэстрогенов, реализуется только в клетках с экспрессией разных типов ЭР. В целом ситуация аналогична раку молочной железы, однако количественные показатели экспрессии и коэкспрессии в ткани НМРЛ ЭР разных типов по-прежнему остаются неизученными. Принимая во внимание, что именно эта молекулярная характеристика опухоли является важнейшим аргументом в обоснованности развития гормональной терапии любого злокачественного новообразования, целью настоящего исследования явилась оценка уровня экспрессии ЭРа и ЭРр в ткани опухолей большой когорты больных НМРЛ. Для получения строго количественных показателей экспрессии маркеров работа проведена им-мунофлуоресцентным методом, сопряженным с проточной цитометрией.
Материалы и методы
Проведен анализ показателей экспрессии ЭРа и ЭРр в хирургических биопсийных образцах опухолей 167 больных НМРЛ (139 мужчин и 28 женщины). Использована ранее разработанная и запатентован-
ная методика строго количественной характеристики молекулярных белковых маркеров солидных опухолей [3]. Для иммунофлуоресцентного анализа экспрессии ЭРа использовали первичные кроличьи антитела (клон SP1, Abcam), для ЭРр — мышиные (клон 14C8, Abcam), а также вторичные козьи антитела, конъюги-рованные с красителем DyLight650 (ab98510 и ab98729 соответственно). Измерение флуоресценции проводили на проточном цитофлуориметре Navios (Beck-man Coulter). Для возбуждения флуоресценции использовали твердотельные диодные лазеры с длиной волны испускаемого света 488 и 638 нм. Регистрацию сигнала флуоресценции красителей DyLight650 проводили в канале FL-6. Использовали средний показатель скорости при подсчете анализируемых клеток; число анализируемых событий — 5000. Количество окрашенных клеток рассчитывали в программе FlowJo 10.0 с помощью метода Колмогорова-Смирнова.
Уровень экспрессии ЭРа и ЭРр рассчитывали как количество специфически флуоресцирующих клеток в % по отношению к контролю (инкубация с вторичными антителами).
Результаты и обсуждение
При анализе данных о больных НМРЛ, образцы опухолей которых были включены в исследование, выявлены следующие закономерности. Среди прооперированных пациентов женщины составили 17 %, мужчины — 83 %. Возраст мужчин колебался от 35 до 82 лет (средний возраст 61 год), возраст женщин — от 37 до 73 (средний возраст 58 лет).
В общей группе больных обоих полов плоскоклеточный рак диагностирован в 55 % случаев, адено-карцинома — в 42 %. Процент курящих пациентов преобладал над числом пациентов, которые не имели такой привычки, и составил не менее 62 %. Данных о статусе курения 15 % больных не найдено.
Несмотря на сопоставимое число пациентов в группах с разным гистологическим типом опухоли, разница в группах разных полов очевидна: у женщин частота аденокарциномы составила 93 %, частота плоскоклеточного рака — 7 %. У пациентов мужского пола почти в 2 раза чаще, чем аденокарцинома, выявлялся плоскоклеточный рак, частота встречаемости составила 64 % против 31,5 %. Стоит отметить, что не менее 73 % пациентов мужского пола являлись курильщиками, причем многие пациенты имели стаж курения более 20 лет; 90 % женщин не имели такой привычки.
Показатели уровня экспрессии ЭРа и ЭРр в общей группе пациентов представлены в таблице.
Иммунофлуоресцентный анализ опухолей выявил экспрессию ЭРа и ЭРр во всех исследованных образцах. Однако, учитывая тот факт, что несмотря
Оригинальные статьи
113
Показатели уровня экспрессии ЭРа и ЭРр в ткани НМРЛ
Подтип эр Показатели уровня экспрессии маркеров, %
Среднее значение (М ± ЗБ)* Медиана Ю1; Q3]**
ЭРа 21,4 ± 11,2 19,0 [13,0; 27,0] < 0,001
ЭРр 42,1 ± 15,3 43,0 [30,0; 53,0]
*М± SD — среднее арифметическое значение ± стандартное отклонение. ** Ме ^1; Q3] — медиана [нижний квартиль, верхний квартиль]. ***р — достоверность различий между показателями уровня экспрессии ЭРа и ЭРр, рассчитанная методом t-критерия Стьюдента
на прецизионность, метод проточной цитофлуори-метрии имеет определенную погрешность, образцы опухолевой ткани, в которых уровень экспрессии маркеров был <10 % окрашенных клеток, мы рассматривали как неэкспрессирующие маркеры. При этом ЭРр-позитивными оказались все исследованные опухоли, а ЭРа-позитивными — большинство (88,4 %). Уровень экспрессии ЭРа в опухолях разных больных варьировал от 11 до 58 % специфически окрашенных клеток, медиана показателя оказалась равной 19 %. Уровень экспрессии ЭРр в образцах колебался от 12 до 80 %, медиана составила 43 %. Средние значения показателей мало отличались от медианы (ЭРа: 21,4 % против 19,0 %, ЭРР: 42,1 % против 43 %). Таким образом, в среднем по группе уровень экспрессии ЭРр в образцах ткани НМРЛ приблизительно в 2 раза превышает уровень экспрессии ЭРа (р <0,001).
На рисунке представлено распределение показателей коэкспрессии ЭРа и ЭРр в исследованной группе пациентов с НМРЛ. Образцы опухолей были ранжированы по возрастанию уровня экспрессии ERp — от минимального до максимального значения (на графике обозначены черными треугольниками). Круглые точки показывают значение уровня экспрессии ERа в том же образце опухоли. Видно, что в ткани большинства образцов уровень экспрессии ЭРр превышает уровень экспрессии ЭРа. Только в 8 % образцов (в 14 из 167 случаев) экспрессия ЭРа оказалась равной или незначительно превысила экспрессию ЭРр. Распределение точек на данном рисунке согласуется с отношением рассчитанных показателей медианы и среднего значения: в большинстве случаев показатель экспрессии ЭРр в 1,5 раза превысил показатель экспрессии ЭРа, а в 58 % случаев — в 2 раза и более. Видно также, что персонализированные различия были очень значительными и уровень экспрессии ЭРр более чем в 4 раза превышал показатель ЭРа.
На графике также очевидно отсутствие четкой корреляции между экспрессией ЭРр и ЭРа в ткани НМРЛ. Данный факт подтвержден результатом корреляционного анализа. Так как число наблюдений
Распределение показателей экспрессии ЭРа и ЭРр в исследованной группе больных НМРЛ. По оси абсцисс — номера образцов опухолей, которые ранжированы от минимального до максимального значения по уровню экспрессии Е^ (%). По оси ординат — уровень экспрессии ERа и ERp (%). Черными треугольниками отмечены показатели уровня экспрессии ERp, круглыми точками — ERа в ткани опухоли того же больного
оказалось больше 100, в качестве показателей согласованности между значениями экспрессии ЭРр и ЭРа можно использовать как коэффициент корреляции Пирсона, так и коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Коэффициент ранговой корреляции Спирмена оказался равным 0,364 (р <0,001), а коэффициент корреляции Пирсона — 0,401 (р <0,001). Эти значения указывают на наличие статистически значимой прямой слабой взаимосвязи между показателями экспрессии ЭРр и ЭРа.
Заключение
Обсуждая полученные результаты, прежде всего необходимо отметить, что это первое исследование НМРЛ, проведенное на большом клиническом материале (проанализировано 167 хирургических образцов НМРЛ), в котором на основании строго количественного показателя охарактеризован уровень экспрессии и коэкспрессии ЭР разных типов — ЭРа и ЭРр. Показано, что ЭРр экспрессированы во всех исследованных образцах НМРЛ, а ЭРа-позитивными является большинство опухолей — 88,4 %. Тот факт, что в ткани НМРЛ в 100 % случаев выявляется экспрессия 1 или 2 мишеней антиэстрогенов, указывает на молекулярную обоснованность сформулированной выше гипотезы о возможной эффективности гормональной терапии у больных НМРЛ.
В связи с этим важно отметить, что уровень экспрессии в ткани НМРЛ ЭРр значительно выше, чем ЭРа. В целом по группе превышение медианы уровня экспрессии ЭРр против ЭРа составило 2,3 раза (43 % против 19 %), а различия между реальными показателями у конкретных больных были еще более значительными. Это свидетельствует о том, что ЭРр
4'2018 том 17 | V0L. 17
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSIAN J0URNAL 0Р ВЮТ^АРУ
могут являться основной мишенью антиэстрогенов и ориентиром для отбора пациентов с НМРЛ для проведения гормональной терапии.
Принимая во внимание полученные результаты, признавая ЭР патогенетически важным маркером
НМРЛ и допуская, что уровень экспрессии ЭРр в опухоли >30 % может быть значимым для реализации эффекта антиэстрогенов, считаем, что претендентами на проведение гормональной терапии являются около 90 % больных НМРЛ.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Богуш Т.А., Дудко Е.А., Беме А.А.
и др. Эстрогеновые рецепторы, антиэстрогены и немелкоклеточный рак легкого. Биохимия 2010;75(12): 1633-41. [Bogush T.A., Dudko E.A., Beme A.A. et al. Estrogen receptors, antiestrogens and non-small cell lung cancer. Biohimiya = Biochemistry 2010;75(12):1633-41. (In Russ.)].
2. Богуш Т.А., Шатурова А.С.,
Дудко Е.А. и др. Количественная им-мунофлуоресцентная оценка с использованием проточной цитофлуо-риметрии экспрессии эстрогеновых рецепторов р в солидных опухолях человека. Вестник Московского унта. Серия 2, Химия 2011;52(4):305-12. [Bogush T.A., Shaturova A.S., Dudko E.A. et al. Quantitative
immunofluorescence assessment using flow-cytometry the expression of estrogen receptor p in a solid human tumor. Vestik Moskovskogo universi-tetata. Seriya = Bulletin of Moscow University. Series 2, Chemistry 2011;52(4):305-12. (In Russ.)].
3. Christoforou P., Christopoulos P.F., Koutsilieris M. The role of estrogen receptor p in prostate cancer. Mol Med 2014;20:427-34. PMID: 25032955. DOI: 10.2119/molmed.2014.00105.
4. Dong J., Jiang S.W., Niu Y. et al. Expression of estrogen receptor a and p in esophageal squamous cell carcinoma. Oncol Rep 2013;30(6):2771-6. PMID: 24101172.
DOI: 10.3892/or.2013.2770.
5. Jia M., Dahlman-Wright K., Gustafsson J.-A. Estrogen receptor alpha and beta in health and disease. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 2015;29(4):557-68.
PMID: 26303083. DOI: 10.1016/j. beem.2015.04.008.
6. Богуш Т.А., Дудко Е.А., Беме А.А. и др. Экспрессия эстрогеновых рецепторов в опухолях, отличных от рака молочной железы. Антибиотики и химиотерапия 2009;54(7-8): 41-9. [Bogush T.A., Dudko E.A., Beme A.A. et al. The expression
of estrogen receptors in tumors other than breast cancer. Antibiotiki i himio-terapiya = Antibiotics and chemotherapy 2009;54(7-8):41-9. (In Russ.)].
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
