CC BY
16
DOI: 10.15690/onco.v4i4.1812
Л.П. Киселёв, Т.В. Савицкая, О.В. Алейникова
Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии,
Минск, Республика Беларусь
Уровень экспрессии факторов ангиогенеза в ткани сарком и незлокачественных образований у пациентов детского возраста: результаты одномоментного
исследования
Формирование опухолью собственной сосудистой сети (неоангиогенез) является необходимым условием для развития новообразования. Цель исследования: оценить отличия в уровне экспрессии матричной рибонуклеиновой кислоты (мРНК) спектра генов, ассоциированных с процессом ангиогенеза, в субстрате злокачественных и незлокачественных патологических образований с локализацией в костях и мягких тканях перед началом системной терапии у пациентов детского возраста. Методы. Проведено поперечное (одномоментное) исследование. Методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени изучен спектр маркеров ангиогенеза — факторы роста эндотелия сосудов (VEGFA, включая изоформы 121, 165, 189, и VEGFC), рецепторы VEGFR1 и VEGFR2, фактор индукции гипоксии (HIF-1a), тканевый фактор и его ингибиторы (TF, TFPI1, TFPI2), ингибиторы активатора плазминогена (uPA, PAI1) — в образцах патологической ткани у 39 пациентов со злокачественной и 23 — с незлокачественной природой заболевания. Результаты. Саркомы костей и мягких тканей характеризуются значимо большим по сравнению с незлокачественной патологией уровнем экспрессии мРНК изоформ VEGFA121 (3,425 против 1,500; р =0,018), VEGFA165 (2,516 против 1,124; р =0,233) и соотношением VEGFA165/189 (0,720 против 0,400; р =0,003), в то время как экспрессия остальных маркеров была выше у пациентов с незлокачественной патологией. Локализованные формы сарком костей и мягких тканей в сравнении с метастатическими характеризуются значимо более высоким уровнем как экспрессии TFPI2 (0,1783 против 0,0939; р =0,041), так и значением соотношения VEGFA165/189 (0,8235 против 0,6765; р =0,003). Заключение. Показано, что экспрессия мРНК значительной части спектра факторов ангиогенеза не является прерогативой неоплазм и может быть выше у пациентов без онкопатологии. Соотношение изоформ VEGFA165/189 вместе с уровнем TFPI2 значимо отличает пациентов с локализованными (неметастатическими) формами сарком от когорты с IV стадией заболевания: эти показатели могут расцениваться как убедительные прогностические маркеры онкологического процесса.
Ключевые слова: ангиогенез, ткань опухоли, саркомы костей и мягких тканей у детей, диагностика и лечение.
(Для цитирования: Киселёв Л.П., Савицкая Т.В., Алейникова О.В. Уровень экспрессии факторов ангиогенеза в ткани сарком и незлокачественных образований у пациентов детского возраста. Онкопедиатрия. 2017;4(4):260-268. Doi: 10.15690/onco.v4i4.1812)
ОБОСНОВАНИЕ
Злокачественные новообразования костей и мягких тканей имеют общую мезенхимальную природу. Доказано, что рост и метастазирование неоплазм связаны с процессом формирования собственной сосудистой сети, известным также как ангиогенез или неоангиогенез [1-3]. Увеличивается количество литературных источников, представляющих данные о том, что маркеры опухолевого ангиогенеза могут коррелировать с конкретными клиническими признаками у пациентов с саркомами [4-6]. Процесс формирования сосудистой сети
обусловлен функционированием широкого спектра генов. Прежде всего, это представитель семейства факторов роста — фактор роста эндотелия сосудов (Vascular endothelial growth factor, VEGF), его изоформы, а также рецепторы взаимодействия. VEGF является фундаментальным медиатором как патологического, так и физиологического ангиогенеза. В семействе VEGF выделяют VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD, VEGFE, VEGFF и плацентарный фактор роста (Placental growth factor, PLGF). Точками приложения VEGFA являются хемотаксис и диффе-ренцировка предшественников эндотелиоцитов
[5]. Как правило, выделяют 5 изоформ VEGFA, обозначаемых по количеству аминокислотных оснований в каждой — VEGFA121, VEGFA145, VEGFA165, VEGFA189 и VEGFA206. Изоформа VEGFA121 обладает максимальной растворимостью и действует как митогенный фактор для сосудистого эндотелия. VEGFA165 рассматривается как изоформа, обладающая максимальным потенциалом к стимуляции генеза сосудистой сети. VEGFA189 представлен в сравнительно небольших концентрациях и является лигандом рецептора VEGFR3, презентирован-ного в основном в лимфатических сосудах [5, 6]. VEGFA участвует в регуляции процесса гипоксии и естественным образом связан с фактором, индуцирующим гипоксию (Hypoxia inducible factor-1, HIF-1) [7]. VEGFC наряду со стимуляцией сосудистого эндотелия обеспечивает клеточную миграцию (рецепторами являются VEGFR3, реже VEGFR2), но его ангиогенный потенциал меньше по сравнению с VEGFA [8].
Компоненты проводящих путей тканевого фактора (Tissue factor pathway inhibitors, TFPIs) —
обратимые ингибиторы коагулянта тканевого фактора и сигнальной активности клетки. In vitro и in vivo показана способность TFPI1 к антиангио-генному и противометастатическому эффекту. TFPI2 — структурный аналог TFPI1, его экспрессия обратно пропорциональна повышению степени злокачественности и распространению новообразования: таким образом, роль TFPI2 может расцениваться как ограничение роста опухоли в организме [9, 10].
Значимое влияние на формирование опухолевой сосудистой сети оказывают протеазы и их ингибиторы. В частности, система активации плаз-миногена и VEGF взаимосвязаны и являются синер-гистами в процессе инвазии опухоли. Активаторы плазминогена урокиназного типа (Urokinase-type plasminogen activator, uPA) и его антагонист PAI1 (Plasminogen activators inhibitor-1) продуцируются нормальными и опухолевыми клетками и играют ключевую роль в деградации и ремоделировании межклеточного матрикса, деструкции базальной мембраны и метастазировании. Повышение уров-
Leanid P. Kisialeu, Tatiana V. Savitskaia, Olga V. Aleinikova
Belarusian Research Center for Pediatric Oncology, Hematology and Immunology,
Minsk, Republic of Belarus
Levels of Angiogenesis Factors Expression in Sarcoma Tissue and Non-Malignant Lesions
in Pediatric Patients: Results of a Cross-Sectional Study
Background. Vasculature formation (angiogenesis) is critical for the development of a tumor, may reflect neoplasms behavior and considered as a target for angiogenesis inhibition. Objective. We investigated the mRNA (messenger ribonucleic acid) expression levels of varied angiogenesis markers in malignant and non-malignant pathological foci of pediatric patients. Methods. A cross-sectional study was carried out. Angiogenesis markers VEGFA (including isoforms of 121,165,189), VEGFC, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, HIF-1a, TF, TFPI-1, TFPI-2, uPA, PAI-1 in pediatric specimens were examined using quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction. 62 (39 malignant and 23 nonmalignant) samples from pediatric patients with bone and soft tissues pathology were studied. Results. Higher level of isoforms VEGFA121 (3.425 vs 1.500; p =0.018), VEGFA165 (2.516 vs 1.124; p =0.233), as well as VEGFA165/189(0.720 vs 0.400; p =0.003) ratio ascertained for malignancies in contrast to non-malignant pathology. Other markers expression levels were higher in patients without cancer pathology. Both the TFPI-2 level (0.1783 vs 0.0939; p =0.041) and VEGFA165/189 ratio (0.8235 vs 0.6765; p =0.003) were significantly elevated in patients with localized cancer vs metastatic forms. Conclusion. Demonstrated expression of several angiogenesis factors is not the distinctive characteristic of neoplasms and can reveal a higher level in pediatric patients without malignancy. VEGFA165/189 ratio together with the TFPI-2 level distinguished localized and metastatic cancer patients and may use as a tumor prognostic marker. Key words: angiogenesis, pediatric patients, tissue tumors, sarcomas of bone and soft tissues. (For citation: Kisialeu Leanid P., Savitskaia Tatiana V., Aleinikova Olga V. Levels of Angiogenesis Factors Expression in Sarcoma Tissue and Non-Malignant Lesions in Pediatric Patients: Results of a Cross-Sectional Study. Onkopediatria. 2017;4(4):260-268. Doi: 10.15690/onco.v4i4.1812)
ня uPA ассоциируется с плохим прогнозом заболевания [11-13].
Можно суммировать, что экспрессия опухолью компонентов ангиогенеза, в первую очередь VEGF, классически рассматривается как отрицательный прогностический фактор, ассоциируемый с мета-стазированием и химиорезистентностью, однако последующие работы показывают необходимость детализации спектра маркеров для индивидуальной оценки клинической значимости его составляющих.
Целью нашего исследования был анализ уровней экспрессии мРНК спектра маркеров ангиогенеза, включающего не только классические компоненты VEGF, но также TFPI1, TFPI2, uPA и PAI1, в ткани опухоли пациентов детского возраста с костными и мягкотканными саркомами.
МЕТОДЫ
Дизайн исследования
Проведено поперечное (одномоментное) исследование.
262
Критерии соответствия
Критериями включения пациента в исследование были наличие морфологического диагноза и отсутствие специального противоопухолевого лечения до взятия образца ткани.
Диагноз и стадию (распространение) опухоли устанавливали согласно критериям международных протоколов [14-16]:
• для остеосаркомы — ЕВРОАМОС (EuRAMOSl
Protocol, Version 1.0, 30 September 2004) [14];
• для саркомы Юинга — ЕВРОЮИНГ (EURO-
E.W.I.N.G.99 Protocol, Version 1999-09-27) [15];
• для рабдомиосаркомы — РМС-2005 (RMS 2005,
EpSSG Protocol Final, Version January 2005) [16].
Критерии исключения. Пациенты исключались из исследования, если до получения материала опухоли им было проведено специальное лечение.
Условия проведения
В исследование включены 62 образца патологической ткани со злокачественной и незлокачественной природой заболевания, полученные от пациентов детского возраста в 2008-2011 гг.: первый пациент включен в исследование в феврале 2008, последний — в декабре 2011 г. Одна часть материала направлялась на морфологическое исследование, другая — для формирования банка тканей с целью проведения молекулярно-генетических исследований. Все образцы тканей первичных патологических очагов были получены до начала специального лечения.
После окончания лечения пациенты наблюдались детским субканцер-регистром Республики Беларусь (РБ), включенным в Интернациональное агентство исследования рака (International Agency
for Research on Cancer, IARC) с постоянным обновлением статуса.
Лабораторные исследования
Выделение РНК и синтез кДНК
Образцы тканей были получены непосредственно после операции и заморожены в жидком азоте. Для гомогенизации использовался гомогенизатор Retsch (Германия). Для проведения реакции обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (ПЦР) в режиме реального времени тотальная РНК выделялась с использованием RNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия) согласно инструкции производителя. Концентрацию РНК оценивали посредством спек-трофотометрии. Тотальную РНК (1,5 мкг) из ткани конвертировали в первую цепь ДНК с использованием случайного праймера (0,3 мкг) и обратной транскриптазы 200 U мышиного вируса лейкемии (Moloney murine leukemia virus, M-MLV; Promega, США). Исследование выполнялось в лаборатории молекулярной биологии Центра детской онкологии, гематологии и иммунологии Минздрава РБ (Минск).
Количественная обратно транскриптазная
полимеразная цепная реакция
В оригинальных образцах были исследованы 11 генов: VEGFA (включая изоформы VEGFA121, VEGFA165 и VEGFA189), VEGFC, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, HIF-1a, TF, TFPI1, TFPI2, uPA, PAI-1. В качестве внутреннего контрольного гена использовалась глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH). Количественное определение генов осуществлялось посредством использования метода флуоресценции на основе реального времени (Taqman). ПЦР в режиме реального времени для генов VEGFA, VEGFC, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, HIF-1a, TF, TFPI, TFPI2, uPA, PAI проводилась с использованием коммерческих систем TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems, США) с реакционными блоками Hs00900054 мл, Hs01099203 мл, Hs01052940 мл, Hs00911690 мл, Hs01047659 мл, Hs00936377 мл, Hs00175225 мл, Hs00409206 мл, Hs00197918 мл, Hs01547050 мл, Hs01126603 мл соответственно. Праймеры и зонды для количественной оценки VEGF изоформ в реал-тайм ПЦР были использованы так, как описано в публикации Т. Gustafsson и соавт. [13]. ПЦР в режиме реального времени проводили в 20 мкл реакционной смеси с окончательным разведением 1х в TaqMan PCR Universalmaster Mix (Applied Biosystems, США) в соответствии с протоколом производителя и с помощью оборудования iCycler (Bio-Rad, США). Относительные величины мРНК генов в образцах рассчитаны по показателям стандартных кривых, полученных путем амплификации серийного разведения обратно транскрибированной тотальной РНК. Значения исследованных показателей представлены в виде относительных величин.
Этическая экспертиза
Проведение исследования было одобрено Локальным этическим комитетом Центра детской онкологии, гематологии и иммунологии Минздрава РБ (протокол № 2/08 от 24.01.2008 г.).
Статистический анализ
Статистическая обработка полученных данных проведена с использованием пакета программы Statistica v. 6.0 (Statsoft Inc., США). Количественные данные представлены с определением медианы и 25-го, 75-го процентилей (Ме [25; 75]), минимумов-максимумов; качественные данные выражены в абсолютных величинах и процентах. Проверка гипотез о равенстве двух средних проводилась с помощью U-критерия Манна-Уитни, для количественных признаков — F-критерия Фишера. Различия считали статистически значимыми при p <0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Участники исследования
Группа онкобольных, включенных в исследование (n =62), была сформирована с 2008 по 2011 г. и состояла из пациентов детского возраста, которые были обследованы в связи с подозрением на наличие новообразований костных структур или мягких тканей в Республиканском научно-практическом центре детской онкологии, гематологии и иммунологии Минздрава РБ. Характеристики исследуемой когорты пациентов представлены в табл. 1.
Из 39/62 (62,9%) пациентов с онкозаболеванием у 16 (41,0%) диагностирована саркома Юинга, у 16 (41,0%) — остеосаркома, у 7 (18,0%) — раб-домиосаркома. Для 23/62 (37,1%) диагноз онкозаболевания был исключен: у 5 (21,7%) были незлокачественные новообразования кости (остеоид-остеома, остеокластома, остеобласто-ма, хондрома), у 5 (21,7%) — остеомиелит, у 3 (13,0%) — фиброзная дисплазия, у 3 (13,0%) — анев-ризмальная костная киста, у 3 (13,0%) — посттрав-
Таблица 1. Характеристика пациентов
матические изменения, у 1 (4,4%) — гранулема-тозное воспаление, у 1 (4,4%) — аневризмальная киста, у 1 (4,4%) — фиброматоз мягких тканей, у 1 (4,4%) — оссифицирующий миозит бедра.
Основные результаты исследования Уровни экспрессии мРНК факторов ангиогенеза в ткани опухоли и ткани незлокачественных патологических очагов
Уровни экспрессии мРНК исследованного спектра факторов ангиогенеза в ткани опухоли и ткани незлокачественных патологических очагов представлены в табл. 2. Анализируя данные (см. табл. 2), можно отметить, что уровни экспрессии большинства исследуемых маркеров имели значительные отличия. Статистически значимо большая медиана экспрессии мРНК в незлокачественной ткани была отмечена для ТГР11 (2,070 против 0,516; р <0,001), ТГР12 (0,543 против 0,117; р <0,001), иРА (3,016 против 0,418; р <0,001), ШР-1а (12,861 против 2,028; р <0,001), VEGFR1 (21,865 против 4,937; р <0,001), VEGFR2 (24,488 против 5,794; р =0,001), VEGFR3 (81,181 против 18,574; р <0,001) и VEGFC (2,244 против 0,782; р <0,001). В то же время были определены факторы ангиогенеза, экспрессия которых была больше в следующих опухолевых очагах: VEGFA121 (1,500 против 3,425; р =0,017), VEGFA165 (1,124 против 2,516; р =0,023) и соотношения VEGFA165/VEGF189 (0,400 против 0,720; р =0,003).
Корреляция между экспрессией мРНК изоформ VEGFA
При индивидуальном сравнении была констатирована сильная корреляция значений экспрессии 2 изоформ — VEGFA165 и VEGFA189 — как в опухолевой ткани (г =0,8210, р =0,010), так и в неопухолевых очагах (г =0,9110, р =0,013).
Уровни экспрессии мРНК изоформ VEGFA в тканях сарком
Относительные уровни экспрессии мРНК генов факторов ангиогенеза в выделенных группах сар-
Характеристика пациентов, n =62 Злокачественные новообразования Незлокачественные образования, n =23 абс. (%) Р
Всего n =39 абс. (%) СЮ n =16 абс. (%) ОС n =16 абс. (%) РМС n =7 абс. (%)
Мужской пол 24 (61,5) 10 (62,5) 10 (62,5) 4 (57,1) 15 (65,2) 0,034
Средний возраст, лет 12,5 12,4 13 11,9 12,4 -
Стадия II 24 (61,5) 11 (68,8) 11 (68,8) 2 (28,6) - 0,042
Стадия III 2 (5,2) - - 2 (28,6) - -
Стадия IV 13 (33,3) 5 (31,3) 5 (31,3) 3 (42,8) - 0,038
Примечание. СЮ — саркома Юинга, ОС — остеосаркома, РМС — рабдомиосаркома.
Таблица 2. Уровни экспрессии мРНК исследованного спектра факторов ангиогенеза в ткани опухоли и ткани незлокачественных патологических очагов
264
Факторы Злокачественные новообразования (п =38) Ме [25-75], % мин.-макс. Незлокачественные образования (п =23) Ме [25-75], % мин.-макс. р
TF 1,106 [0,389-2,557] 0,037-38,021 3,114 [0,754-4,986] 0,047-102,000 0,052
TFPI1 0,516 [0,338-1,154] 0,007-21,486 2,070 [0,967-2,962] 0,382-16,105 <0,001
TFPI2 0,117 [0,035-0,302] 0,001-8,704 0,543 [0,355-2,347] 0,052-10,881 <0,001
иРА 0,418 [0,174-0,781] 0,006-15,829 3,016 [1,207-5,572] 0,002-18,782 <0,001
РА11 1,877 [0,645-4,513] 0,037-38,021 2,553 [1,002-5,155] 0,0382-26,287 0,204
2,028 [1,387-3,768] 0,088-98,021 12,861 [7,717-19,773] 0,534-111,111 <0,001
VEGFR1 4,937 [2,312-9,167] 0,003-135,803 21,865 [7,368-50,569] 0,034-118,684 <0,001
VEGFR2 5,794 [2,838-13,517] 0,009-44,589 24,488 [10,000-55,447] 0,000-193,158 0,001
VEGFR3 18,574 [6,274-47,085] 0,163-390,741 81,181 [36,866-159,734] 3,159-905,263 <0,001
VEGFA 4,007 [1,804-6,253] 0,032-113,095 3,311 [1,801-5,732] 0,620-24,959 0,941
VEGFC 0,782 [0,506-1,717] 0,011-321,143 2,244 [1,596-8,792] 0,419-50,425 <0,001
VEGFA121 3,425 [2,281-6,908] 0,215-20,390 1,500 [0,567-3,244] 0,015-81,642 0,017
VEGFA165 2,516 [1,166-5,504] 0,126-127,451 1,124 [0,502-3,733] 0,017-7,360 0,023
VEGFA189 4,195 [1,526-11,854] 0,087-297,059 2,859 [1,351-8,300] 0,026-79,208 0,427
VEGFA165 /VEGFA189 0,720 [0,562-0,933] 0,172-213,093 0,400 [0,282-0,539] 0,093-1,085 0,003
ком в зависимости от нозологии процесса представлены на рис.1.Характеризуя представленные данные в группах пациентов с остеосаркомой, саркомой Юинга и рабдомиосаркомой, можно говорить об общих тенденциях с объединенной группой
пациентов с онкопатологией: более высокие показатели экспрессии VEGFA121, VEGFA165, соотношения VEGFA165/VEGFA189 и низкие по сравнению с неопухолевыми очагами уровни остальных компонентов семейства VEGF
сю
ос
РМС
нз
сю
ОС
РМС
нз
СЮ
ОС
РМС
нз
16 Й 14
s
I 12
со
« 10 =
I 8
Ё 6
ш
о.
§ 4
п л
S 2
ta е-о
* о
-2
1,8
Е Q.
а
1 1,4
U
о о»
= <
0 вд
s §1,0
Е S
¡¡0,6
8 = -Û
1 0,2
16 -0,2
140 g120
S
Й100
я
s
<u
£ 80 =
û_
I 60
s
u
0
1 40
U ЗЛ m
£ 20 <U m a
S о
-20
СЮ
oc
PMC
H3
СЮ
oc
PMC
H3
СЮ
oc
PMC
H3
16 § 14
г
§ 12
| 10 ж
E
% 8
аз p ca e-o
* 0
-2
280
£
S 220 g
£160
§100
40
-20
СЮ
18 г
16
§ § 14
и 12
^ Е О. 10
S 8
u
и 6
с
£ m 4
л
03 ва о 2
S1 0 -2 -
СЮ
СЮ
oc
PMC
H3
oc
PMC
H3
oc
PMC
H3
Рис. 1. Экспрессия мРНК генов семейства VEGF в зависимости от нозологии онкологического процесса и при незлокачественной патологии
Примечание. * — р <0,001 характеризует разницу в экспрессии типа опухоли и неонкологических очагов. СЮ — саркома Юинга, ОС — остеосаркома, РМС — рабдомиосаркома, НЗ — незлокачественная патология.
Уровни экспрессии мРНК генов пути тканевого фактора (TF, TFPI1, TFPI2), ингибиторов активатора плазминогена (uPA, PAI1), фактора индукции гипоксии (HIF-1a) в зависимости от нозологии онкологического процесса и при незлокачественной патологии На рис. 2 представлены относительные уровни экспрессии мРНК генов пути тканевого фактора (TF, TFPI1, TFPI2), ингибиторов активатора плазминогена (uPA, PAI1), фактора индукции гипоксии (HIF-1a) в зависимости от нозологии процесса. Как показано на рис. 2, характерной особенностью был значимо более высокий уровень экспрессии HIF-1a, TF, TFPI1, TFPI2 и uPA при незлокачественных новообразованиях по сравнению с онкопатоло-
гией. При каждом виде сарком был констатирован значимо меньший по сравнению с неопухолевыми очагами уровень экспрессии мРНК таких генов, как Н^-1а, TFPI1, TFPI2 и uPA.
Уровни экспрессии мРНК факторов ангиогенеза в тканях незлокачественных очагов
Группа незлокачественных заболеваний в исследовании достаточно гетерогенна и включает пациентов с заболеваниями, для которых рутинно осуществляется дифференциальная диагностика с онкологическим процессом (доброкачественные и воспалительные изменения костных и мягких тканей). В подгруппах не отмечено значимой разницы в уровне экспрессии факторов
30
а 25
5
£ 20 О)
I— ^
1 15
Ж
110 Е
ё П
£ 5
Ш
ва о
г о
5
5,0 4,5 ¡4.0 € 3,5
Щ
Щ 3,0 а.
* 2,5 |2'0
11,5 «
х 1,0
аз
ш
§.0,5 0,0 -0,5
"V
|==1
сю
ОС
РМС
нз
сю
ОС
РМС
нз
9 8
1 7
I 6
х
Е
I 5
I <
Щ О.
I 3
п
ё г
и
ва ^ 1
о
-1
4,0 3'5
Е з.о
се
е 2,5 1 2,0
Г*
Л
I 0,5
О
*о,о
-0,5
СЮ
ОС
РМС
нз
сю
ос
РМС
нз
сю
СЮ
ОС
ОС
РМС
нз
РМС
нз
Рис. 2. Экспрессия мРНК генов пути тканевого фактора TFPI1, TFPI2), ингибиторов активатора плазминогена (uPA, PAI1), фактора индукции гипоксии (И^-1а) в зависимости от нозологии онкологического процесса и при незлокачественной патологии Примечание. * — р<0,001 характеризует разницу в экспрессии типа опухоли и неонкологических очагов. СЮ — саркома Юинга, ОС — остеосаркома, РМС — рабдомиосаркома, НЗ — незлокачественная патология.
ангиогенеза (данные не представлены), кроме больших значений VEGFR1 (34,4186 против 12,2564; р =0,027), VEGFR2 (35,1163 против 18,8205; р =0,043) и TFPI1 (2,9261 против 1,6039; р =0,027) для когорты пациентов с воспалительным процессом.
Уровни экспрессии мРНК факторов ангиогенеза в ткани опухоли пациентов с локализованным и распространенным онкологическим процессом
Уровни только двух компонентов из исследованного спектра факторов ангиогенеза значимо отличались в группах пациентов, выделенных в зависимости от наличия метастатического распространения на момент постановки диагноза. Экспрессия TFPI2 (0,0939 против 0,1783; р =0,041) и соотношение изоформ VEGFA165/VEGFA189 (0,6765 против 0,8235; р =0,007) были ниже при распространенном онкологическом процессе по сравнению с локализованными формами заболевания.
ОБСУЖДЕНИЕ
Резюме основного результата исследования
В настоящей работе мы исследовали уровни экспрессии мРНК у пациентов детского возраста с патологией костей и мягких тканей. Уровни
экспрессии оценивали внутри групп с онкопато-логией; также проводилось сравнение с когортой пациентов без злокачественного процесса. Были изучены компоненты VEGF, протеазы и их ингибиторы, а также ингибиторы проводящих путей тканевого фактора. Согласно полученным результатам, уровни экспрессии VEGFC, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, И^-1а, TFPI1, TFPI2 и uPA были выше в неопухолевых очагах по сравнению как с общей когортой онкобольных, так и с группами отдельных видов нозологий (саркома Юинга, остеосаркома, мягкотканные опухоли).
Обсуждение основного результата
исследования
Костные и мягкотканные саркомы представляют группу гетерогенных заболеваний мезенхи-мальной природы [1-3]. Несмотря на существующие алгоритмы морфологической диагностики биопсийных препаратов при постановке онкологического диагноза, до настоящего времени остается актуальным вопрос, могут ли быть обнаружены какие-либо дополнительные маркеры, способствующие дифференцировке злокачественной и незлокачественной природы заболевания [5, 6]. Формирование опухолью патологической сосудистой сети происходит на фоне физиологического ангиогенеза, который особенно активен в детском растущем организме [17, 18]. Не вызывает
сомнения, что маркеры ангиогенеза, продуцируемые опухолевым субстратом, могут быть удобной мишенью для таргетной терапии, так же как и служить критериями для прогнозирования течения и исхода заболевания [6, 7, 17].
В литературе представлены факты, что около 15-20% всех злокачественных новообразований могут быть инициированы или усугублены наличием воспалительного процесса [8, 17]. Воспаление, так же как и ангиогенез, стимулирует образование цитокинов, факторов роста, протеолитических ферментов, протеогликанов, липидных медиаторов и простагландинов [10]. Гипоксические процессы в участках воспаления физиологически сопровождаются метаболическими сдвигами и гиперэкспрессией фактора Н^1, который в свою очередь стимулирует синтез факторов ангиогенеза [14, 15]. Таким образом, наши данные подтверждают гипотезу о том, что гиперэкспрессия некоторых факторов ангиогенеза является прерогативой не только злокачественных новообразований, и не может однозначно рассматриваться как диагностический критерий наличия саркомы в детском организме.
С другой стороны, в настоящем исследовании отмечен статистически значимо более высокий уровень экспрессии некоторых изоформ VEGFA — VEGFA121, VEGFA165 и соотношения VEGFA165/ VEGFA189 — в тканях злокачественных опухолей. По известным нам данным, биологическая роль различных изоформ VEGFA остается не до конца определенной [8, 9, 17]. Так, VEGAF121 и VEGFA165 секретируются в эндотелиальных клетках и способствуют их активному митогенезу [10, 11, 18]. Изоформы с большим количеством аминокислот — VEGFA165 и VEGFA189 — ассоциируются в основном с присутствием в клетках, хотя тоже обладают сосудистой проницаемостью [10, 17]. Считается, что VEGFA165 более «выгодна» для опухоли, чем VEGFA189, хотя обе изоформы участвуют в локальном ангиогенезе [11, 17, 18]. Отмечено, что при дефиците VEGFA165 компенсаторно повышается уровень VEGFA189, однако это не сопровождается усилением инвазии опухоли в костный мозг [17, 18]. Соотношение вне- и внутриклеточных изоформ VEGFA рассматривается рядом авторов как значимый биологический маркер [17, 18], и в нашем исследовании мы увидели этому подтверждение.
Данные литературы свидетельствуют о повышенной экспрессии VEGFA121, VEGFA165, VEGFA189 при остеосаркоме, почечно-клеточном раке, немелкоклеточном раке легкого, колорек-тальном раке, саркоме Юинга, что ассоциируется с ранней прогрессией опухоли и плохим прогнозом заболевания [17, 18]. По нашим данным, у пациентов с саркомами уровень экспрессии этих маркеров был значимо выше при сравнении с группой без онкопатологии, и наряду с этим соотношение VEGFA165/VEGFA189 было меньше у пациентов с IV стадией заболевания в отличие от локализо-
ванных форм онкологического процесса. Также установлена корреляция между экспрессией этих изоформ как в опухолевой ткани, так и в неопухолевых очагах.
Статистически значимые отличия в уровне экспрессии TFPI2 были установлены в группах пациентов в зависимости от наличия метастазов на момент диагноза. Этот ген рассматривается в качестве опухолевого супрессора, в том числе как ингибитор ангиогенеза [18, 19]. В нашем исследовании уровни TFPI1 и TFPI2 были значимо меньше в незлокачественных патологических очагах по сравнению с опухолевой тканью. Представляется важным дальнейшее изучение роли ингибиторов проводящих путей тканевого фактора в качестве онкомаркера со значительным прогностическим потенциалом.
Ограничения исследования
Группировка выявленных случаев осуществлена по индивидуальным признакам, представляющим изучение экспрессии мРНК генов, ассоциированных с процессом ангиогенеза в ткани новообразования у пациентов с незлокачественной патологией и саркомами костных тканей. Дизайн исследования, объем и характеристика выборки могут оказывать влияние на вероятность наличия систематических ошибок и статистической неопределенности для внешней обобщае-мости результатов. Данное исследование рассматривается как пилотное, и полученные результаты свидетельствуют о возможности планирования и осуществления продольных и контролируемых исследований по данной тематике.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Для сарком мягких тканей характерны более высокие уровни экспрессии мРНК генов VEGFA121, VEGFA165, соотношения VEGFA165/VEGFA189 и TFPI2.
При незлокачественной патологии в сравнении с опухолевой тканью констатированы большие уровни экспрессии мРНК генов VEGFC, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, Н^-1а и uPA. Данные маркеры не могут ассоциироваться только с процессами опухолевого ангиогенеза.
Соотношение изоформ VEGFA165/VEGFA189 наряду с уровнем экспрессии мРНК гена TFPI2 статистически значимо отличается у пациентов с распространенным онкологическим процессом и при локализованных формах заболевания, и может быть использовано в качестве прогностического маркера для пациентов детского возраста с саркомами костей и мягких тканей.
ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ
Не указан.
КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ
Авторы статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.
ЛИТЕРАТУРА
1. Алейникова О.В., Потапнев М.П., Сыцкевич О.Н., и др. Достижения детской онкологии и гематологии в Республике Беларусь / Актуальные вопросы детской онкологии и гематологии: Материалы VIII Международного симпозиума. — Минск; 2000. — С. 3-8. [Aleinikova OV, Potapnev MP, Sytskevich ON, et al. Dostizheniya detskoi onkologii i gematologii v Respublike Belarus'. In: (Conference proceedigs) Aktual'nye Voprosy detskoi onkologii i gematologii: Materialy VIII Mezhdunarodnogo simpoziuma. Minsk; 2000. pp. 3-8. (In Russ).]
2. Мень Т.Х., Поляков В.Г., Алиев М.Д. Эпидемиология злокачественных новообразований у детей в России // Онкопедиатрия. 2014. — Т.1. — №1— С. 7-12. [Men TKh, Polyakov VG, Aliev MD. Epidemiology of childhood cancer in Russia. Oncopediatrics. 2014;1(1):7-12. (In Russ).]
3. Hogendoorn PC; ESMO/EUROBONET Working Group, Athanasou N, et al. Bone sarcomas: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 2010;21 Suppl 5:204-213. doi: 10.1093/annonc/mdq223.
4. Olmos D, Tan DS, Jones RL, Judson IR. Biological rationale and current clinical experience with anti-insulinlike growth factor 1 receptor monoclonal antibodies in treating sarcoma: twenty years from the bench to the bedside. Cancer J. 2010;16(3):183-194. doi: 10.1097/ PPO.0b013e3181dbebf9.
5. Altman DG, McShane LM, Sauerbrei W, Taube SE. Reporting recommendations for tumor marker prognostic studies (REMARK): explanation and elaboration. BMC Med. 2012;10:51. doi: 10.1186/1741-7015-10-51.
6. Adams RH, Alitalo K. Molecular regulation of angio-genesis and lymphangiogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007;8(6):464-478. doi: 10.1038/nrm2183.
7. Atzori F, Tabernero J, Cervantes A, et al. A phase I pharmacokinetic and pharmacodynamic study of dalotuzum-ab (MK-0646), an anti-insulin-like growth factor-1 receptor monoclonal antibody, in patients with advanced solid tumors. Clin Cancer Res. 2011;17(19):6304-6312. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-10-3336.
8. Loges S, Clausen H, Reichelt U, et al. Determination of microvessel density by quantitative real-time PCR in esophageal cancer: correlation with histologic methods, angiogenic growth factor expression and lymph node
metastasis. Clin Cancer Res. 2007;13(1):76-80. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-06-1324.
9. Belting M, Ahamed J, Ruf W. Signaling of the tissue factor coagulation pathway in angiogenesis and cancer. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005;25(8):1545-1550. doi: 10.1161/01.ATV.0000171155.05809.bf.
10. Ono M. Molecular links between tumor angiogenesis and inflammation: inflammatory stimuli of macrophages and cancer cells as targets for therapeutic strategy. Cancer Sci. 2008;99(8):1501-1506. doi: 10.1111/j.1349-7006.2008.00853.x.
11. McMahon B, Kwaan HC. The plasminogen activator system and cancer. Pathophysiol Haemost Thromb. 2008;36(3-4):184-194. doi: 10.1159/000175156.
12. Wojtukiewicz MZ, Sierko E, Kisiel W. The role of hemostatic system inhibitors in malignancy. Semin Thromb Hemost. 2007;33(7):621-642. doi: 10.1055/s-2007-991530.
13. Gustafsson T, Ameln H, Fischer H, et al. VEGF-A splice variants and related receptor expression in human skeletal muscle following submaximal exercise. J Appl Physiol (1985). 2005;98(6):2137-2146. doi: 10.1152/ japplphysiol.01402.2004.
14. Whelan JS, Bielack SS, Marina N, et al. EURAMOS-1, an international randomised study for osteosarcoma: results from pre-randomisation treatment. Ann Oncol. 2015;26(2):407-414. doi: 10.1093/annonc/mdu526.
15. Ozaki T. Diagnosis and treatment of Ewing sarcoma of the bone: a review article. J Orthop Sci. 2015;20(2):250-263. doi: 10.1007/s00776-014-0687-z.
16. Shern JF, Yohe ME, Khan J. Pediatric rhabdomyosarcoma. Crit Rev Oncog. 2015;20(3-4):227-243. doi: 10.1615/critrevoncog.2015013800.
17. DuBois SG, Marina N, Glade-Bender J. Angiogenesis and vascular targeting in Ewing sarcoma: a review of preclinical and clinical data. Cancer. 2010;116(3):749-757. doi: 10.1002/cncr.24844.
18. Ferrara N, Gerber HP, Le Couter J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med. 2003;9(6):669-676. doi: 10.1038/nm0603-669.
19. Kawai H, Minamiya Y, Ito M, et al. VEGF121 promotes lymphangiogenesis in the sentinel lymph nodes of non-small cell lung carcinoma patients. Lung Cancer. 2008;59(1):41-47. doi: 10.1016/j.lung-can.2007.08.001.
КОНТАКТНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
Киселёв Леонид Петрович, кандидат медицинских наук, заведующий онкогематологическим отделением № 3 Республиканского научно-практического центра детской онкологии, гематологии и иммунологии (РНПЦ ДОГИ) Минздрава РБ
Адрес: 223053, Республика Беларусь, Минский р-н, д. Боровляны, ул. Фрунзенская, д. 43,
тел.: +375 (17) 265-40-84, e-mail: leonslight@mail.ru, ORCID: http://orcid.org/0000-0003-2071-8143
Савицкая Татьяна Владимировна, кандидат биологических наук, заведующая лабораторией молекулярной биологии РНПЦ ДОГИ Минздрава РБ
Адрес: 223053, Республика Беларусь, Минский р-н, д. Боровляны, ул. Фрунзенская, д. 43, e-mail: t.savitskaia@mail.ru, ORCID: http://orcid.org/0000-0003-0761-525
Алейникова Ольга Витальевна, доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент НАН Беларуси, директор РНПЦ ДОГИ Минздрава РБ
Адрес: 223053, Республика Беларусь, Минский р-н, д. Боровляны, ул. Фрунзенская, д. 43, e-mail: aleinikova2004@mail.ru, ORCID: http://orcid.org/0000-0003-0143-1921
