CC BY
14
DOI 10.31588/2413-4201-1883-244-4-226-231
УДК 636.7:612.08
УРОВЕНЬ АНТИМЮЛЛЕРОВА ГОРМОНА У ВЗРОСЛЫХ КОБЕЛЕЙ СОБАК В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ВОЗРАСТА И СОСТОЯНИЯ ГОНАД
Хуснетдинова Н.Ф. - к.б.н., доцент; Гусельникова А.А. - аспирант
ФГБОУ ВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина»
Ключевые слова: антимюллеров гормон, кобели собак, семенники Key words: hormone AMH, dogs, endocrinology
Антимюллеров гормон (АМГ) является одним из наиболее интересных маркеров репродуктивной системы у млекопитающих, появившийся за последние годы. АМГ представляет собой гликопротеин, принадлежащий суперсемейству трансформирующего фактора роста- B С^-Б) [10, 13]. В пренатальный период у самцов млекопитающих АМГ обеспечивает регрессию мюллеровых протоков. В среднем это происходит у животных во второй трети эмбриогенеза. Так у плодов крыс мужского пола регрессия мюллеровых протоков и соответственно продукция АМГ клетками Сертоли начинается на 13-й день беременности [7], а у собак у плодов мужского пола продукция АМГ начинается на 36-46 день беременности [11]. Отсутствие АМГ или рецептора АМГ типа 2 (АМЖ-2) в этот период приводит к сохранению мюллерова протока [8, 9]. АМГ является одним из ключевых факторов, определяющих мужской пол и регулирующий функционирование репродуктивной системы у млекопитающих. В постнатальный период этот гормон регулирует созревание половых клеток и функционирование половых желез [15].
Данные об изменении антимюлле-рова гормона в крови самцов млекопитающих особенно в постпубертатный период достаточно противоречивы. У жеребцов концентрация АМГ в сыворотке крови в период новорожденности высокая и сохраняется такой весь препубертатный период. После полового созревания происходит снижение концентрации АМГ в сыворотке крови [5]. Причем концентрация АМГ у жеребцов зависит от сезона года. Сниже-
ние АМГ после полового созревания также описаны у крупного рогатого скота [14], овец [4] и белуг (Бе1рЫпар1еги8 1еисаБ) [12]. Однако имеются исследования, показывающие, что АМГ является маркером незрелых клеток Сертоли [1] и этот гормон не обнаруживается в нормальных семенниках взрослых самцов [2], его экспрессия с наступлением пубертата заканчивается. Предыдущие иммуногистохимические исследования описали экспрессию АМГ в фетальном, препубертатном, постпубертатном периодах в семенниках кобелей собак. Исследование показало, что экспрессия АМГ интенсивна в клетках Сертоли фетального семенника кобеля, снижается в препубертатном семеннике; и практически отсутствует в семенниках взрослых кобелей [3]. Изменение концентрации АМГ в сыворотке крови в постпубертатный период интактных кобелей до конца не изучено. Есть данные, что уровень АМГ у жеребцов крипторхов выше чем у интактных [5] и АМГ может использоваться в диагностике крипторхизма. На сегодняшний день для собак такой методики не существует.
В этой связи, целью исследования являлась оценка уровней циркулирующего в крови антимюллерова гормона у кобелей в постпубертатный период, а также оценка данного гормона у кобелей крипторхов.
Материал и методы исследований. Данное исследование проведено на клинически здоровых кобелях и кобелях с крипторхизмом в возрасте от 3 до 12 лет, собак мелких пород массой до 5 кг. Перед взятием крови собирали анамнез, проводили клинический осмотр. Здоровых кобелей разделили на пять групп: от 3 до 5, от 6 до
8, от 9 до 12 лет, кобели крипторхи от 3 до 5 лет и кастрированные (по 5-14 собак в группе). Для исследования кровь брали из подкожной вены предплечья в количестве 2-3 мл, затем ее отстаивали в течение 30 мин и центрифугировали при 3300 об/мин в течение 10 мин. Образцы сыворотки крови переносили в пробирки Эппендорф объемом 1,0 мл и замораживали при t -20 °C до использования в исследованиях. Размораживание и повторное замораживание не допускалось. У всех кобелей взяли образцы крови для определения АМГ и тестостерона в сыворотке крови.
Определение содержания АМГ проводили иммуноферментным методом с помощью наборов фирмы «AnshLab» (США) на анализаторе Униплан согласно прилагаемой инструкции. Набор для определения АМГ - Canine AMH ELISA. Уровень тестостерона в сыворотке крови измеряли с использованием серийно выпускаемых наборов фирмы Хема согласно прилагаемой инструкции. Всего проанализировали 43 пробы. Цифровые данные, полученные в эксперименте, обработаны биометрически на персональном компьютере с использованием прикладной программы Graph Pad Prism v.8. Выборки проходили проверку на нормальность распределения по тесту Шапиро-Вилк. Проверка гипотез проводилась с помощью двухфак-торного дисперсионного анализа и t-теста в случае необходимости. Значение р<0,05
считалось статистически значимым. Влияние возраста на содержание в сыворотки крови АМГ, тестостерона оценивались с помощью однофакторного дисперсионного анализа. Корреляционный анализ проводили с использованием критерия Пирсона. Все результаты представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего.
Результаты исследований. Содержание АМГ у интактных кобелей в сыворотке крови в возрасте от 3 до 12 лет составило 22,7±3,23 нг/мл (n=25) (Lim 6,7859,82). Синтез АМГ в клетках Сертоли сохраняется на протяжении всего этого периода. Имеется тенденция к снижению АМГ с возрастом. Уровень АМГ в возрасте между 3-5 и 6-8 лет (p<0,0001) достоверно снижается, с 43,62±5,07 нг/мл (n=7) до 17,04±2,56 нг/мл (n=11), соответственно. Достоверного снижения с 6-8 до 9-12 лет не обнаружено (Рисунок 1). Содержание тестостерона в сыворотки крови в возрасте от 3 до 12 лет составило 9,02±0,79 нмоль/л (n=33) (Lim 3,33-22,7). Уровень тестостерона достоверно повышается (Рисунок 2) в возрасте между 3-5 и 6-8 лет (p=0,0049), с 6,88±0,82 нмоль/л (n=14) до 13,55±2,48 нмоль/л (n=6), соответственно, достоверной разницы с 6-8 до 9-12 лет не обнаружено. Корреляция между содержанием в сыворотки крови АМГ и тестостерона не выявлено (r=-0,39, n=20; p=0,08).
Рисунок 1 - Содержание антимюллерова гормона в сыворотке крови собак в зависимости от возраста. По оси ординат содержание «АМГ, нг\мл»; по оси абсцисс группы.
227
Рисунок 2 - Содержание тестостерона в сыворотке крови собак в зависимости от возраста. По оси ординат содержание тестостерона, нмоль/л; по оси абсцисс группы.
Рисунок 3 - Содержание антимюллерова гормона в сыворотке крови собак одного возраста в зависимости от состояния гонад. По оси ординат содержание «АМГ, нг\мл»; по оси абсцисс группы.
Рисунок 4 - Содержание тестостерона в сыворотке крови собак одного возраста в зависимости от состояния гонад по оси ординат: содержание «тестостерона, нмоль/л»; по оси абсцисс группы
Уровень АМГ в сыворотке крови у кобелей крипторхов достоверно выше на 45 % (р=0,029), чем у кобелей с интактны-ми гонадами того же возраста и составлял
63,6±6,51 нг/мл (п=5) (Рисунок 3). Содержание тестостерона у кобелей крипторхов в возрасте 3-5 лет составляло 7,14± 2,19 нмоль/л (п=5), достоверной разницы с
интактными кобелями не выявлено (Рисунок 4). Корреляции между содержанием в сыворотке крови АМГ и тестостерона не выявлено (г= -0,41, п=5; р=0,49). У кастрированных кобелей содержание АМГ в сыворотке крови и уровень тестостерона достоверно снижен при сравнении со всеми возрастными группами и составил 0,06±0,02 нг/мл (п=5) и 1,41±0,2 нмоль/л (п=5), соответственно. Корреляции между содержанием АМГ в сыворотке крови и тестостерона не выявлено (г=-0,014; п=5; р=0,98).
Результаты исследования показывают, что АМГ у кобелей синтезируется на протяжение всего постпубертатного периода. Концентрация АМГ в сыворотке крови значительно выше у кобелей в возрасте 3-5 лет, по сравнению с другими возрастными группами, причем резкое снижение АМГ идет в возрасте между 3-5 и 6-8 лет, далее снижение синтеза АМГ уже не так выражено, экспрессия АМГ идет на протяжении всего постбуртата. Корреляция содержания АМГ и тестостерона у кобелей собак в исследовании не найдена. Хотя ряд авторов указывали на отрицательную корреляцию АМГ и тестостерона у лошадей, крупного рогатого скота [14], но не у овец [2]. Можно предположить, что у разных видов животных могут существовать разные механизмы регулирования дифферен-цировки и роста семенников, а также возможно недостаточное количество испытуемых.
У крипторхидных кобелей синтез АМГ значительно выше, чем у интактных кобелей, что позволяет предположить, что исследование содержания АМГ в сыворотке крови может быть полезным для диагностики крипторхизма у кобелей. Семенники, находящиеся в брюшной полости, подвергаются воздействию повышенной температуры. При повышенной температуре пролиферация клеток Сертоли идет интенсивнее, чем у семенников в мошонке. Также рядом авторов установлено на людях, что в семенниках, находящихся в брюшной полости нарушается гематоте-стикулярный барьер и синтез коннексина 43, что может приводить к большему выбросу АМГ в кровь [6]. Однако необходи-
мо проведение дальнейшего исследования гормональной регуляции продукции АМГ у интактных и крипторхидных кобелей.
Данные, о повышении АМГ у кобелей крипторхов согласуются с данными, полученными на крипторхидных жеребцах [5]. У кастрированных кобелей уровень АМГ ниже определения порога чувствительности, что позволяет сделать вывод, что источником АМГ у кобелей является исключительно ткань семенника, тогда как тестостерон может синтезироваться и корой надпочечника в дополнении к семеннику. Концентрация АМГ в сыворотке крови может быть более специфичным маркером наличия ткани семенника, чем уровень тестостерона в сыворотке крови.
Заключение. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что весь постпубертатный период у кобелей собак уровень АМГ в сыворотки крови остается на относительно высоком уровне, то есть с наступлением пубертата его экспрессия не заканчивается, несмотря на его снижение с возрастом. У кастрированных кобелей собак уровень АМГ в сыворотки крови находился ниже порога определения, соответственно источником синтеза АМГ у кобелей собак являются исключительно семенники. У крипторхидных кобелей синтез АМГ значительно выше, чем у интактных кобелей и кастрированных, что позволяет предположить, что исследование содержания АМГ в сыворотке крови может быть полезным для диагностики крипторхизма у кобелей. Тенденция взаимного влияния между АМГ и тестостероном у кобелей собак нами не найдена. Характеристика секреции АМГ у этого вида может быть основой для дальнейшего понимания работы семенников и их функций у кобелей, а также для клинической и патологической оценки случаев патологии семенников и бесплодия.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Al-Attar, L. Hormonal and cellular regulation of Sertoli cell anti-Müllerian hormone production in the postnatal mouse / L. Al-Attar [et al.] // J. Clin. Invest. - 1997. - Vol. 100. - № 6. - P. 1335-1343.
2. Ball, B.A. Expression of anti-Müllerian hormone (AMH) in the equine tes-
tis / B.A. Ball [et al.] // Theriogenology. -2008. - Vol. 69. - № 5. - P. 624-631.
3. Banco, B. Immunohistochemical Evaluation of the Expression of Anti-Müllerian Hormone in Mature, Immature and Neoplastic Canine Sertoli Cells / B. Banco [et al.] // J. Comp. Pathol. - 2012. - Vol. 146. -№ 1. - P. 18-23.
4. Cazorla, O. et al. Anti-Mullerian hormone (AMH) secretion in prepubertal and adult rams / O. Cazorla [et al.] // Reproduction. - 1998. - Vol. 112. - № 2. - P. 259-266.
5. Claes, A. Serum anti-Müllerian hormone concentrations in stallions: Developmental changes, seasonal variation, and differences between intact stallions, cryptorchid stallions, and geldings / A. Claes [et al.] // Theriogenology. - 2013. - Vol. 79. - № 9. -P.1229-1235.
6. Elert, A. Der familiäre Leistenhoden / A. Elert [et al.] // Klin. Pädiatrie. -2003. - Vol. 215. - № 1. - P. 40-45.
7. Josso, N. et al. Anti-Müllerian Hormone: The Jost Factor / N. Josso [et al.] // Recent Progress in Hormone Research. Elsevier. - 1993. - P. 1-59.
8. Josso, N. AMH and AMH receptor defects in persistent Müllerian duct syndrome / N. Josso [et al.] // Hum. Reprod. Update. -2005. - Vol. 11. - № 4. - P. 351-356.
9. Lukas-Croisier, C. Follicle-Stimulating Hormone Increases Testicular Anti-Müllerian Hormone (AMH) Production through Sertoli Cell Proliferation and a Non-classical Cyclic Adenosine 5'-Monophosphate-Mediated Activation of the
AMH Gene / C. Lukas-Croisier [et al.] // Mol. Endocrinol. - 2003. - Vol. 17. - № 4. - P. 550-561.
10. Massagué, J. The logic of TGFp signaling / J. Massagué, R.R. Gomis // FEBS Lett. -2006. - Vol. 580. - № 12. - P. 28112820.
11. Meyers-Wallen, V.N. The Critical Period for Mullerian Duct Regression in the Dog Embryo1 / V.N. Meyers-Wallen [et al.] // Biol. Reprod. - 1991. - Vol. 45. - № 4. - P.
626-633.
12. Montano, G.A. Circulating anti-Mullerian hormone concentrations in relation to age and season in male and female beluga (Delphinapterus leucas) / G.A. Montano [et al.] // Reprod. Fertil. Dev. CSIRO. - 2017. -Vol. 29. - № 8. - P. 1642.
13. Rey, R. AMH/MIS: what we know already about the gene, the protein and its regulation / R. Rey [et al.] // Mol. Cell. Endocrinol. Elsevier Ireland Ltd. - 2003. - Vol. 211. - № 1-2. - P. 21-31.
14. Rota, A. Age dependent changes in plasma anti-Mullerian hormone concentrations in the bovine male, female, and freemartin from birth to puberty: relationship between testosterone production and influence on sex differentiation / A. Rota [et al.] // Gen. Comp. Endocrinol. - 2002. Vol. 129. - № 1. - P. 3944.
15. Sriraman, V. et al. Mullerian Inhibiting Substance Inhibits Testosterone Synthesis in Adult Rats / V. Sriraman [et al.] // J. Androl. - 2001. - Vol. 22. - № 5. - P. 750758.
УРОВЕНЬ АНТИМЮЛЛЕРОВА ГОРМОНА У ВЗРОСЛЫХ КОБЕЛЕЙ СОБАК В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ВОЗРАСТА И СОСТОЯНИЯ ГОНАД
Хуснетдинова Н.Ф., Гусельникова А.А.
Резюме
Целью исследования являлась оценка уровней циркулирующего в крови АМГ у кобелей в постпубертатный период, а также оценка данного гормона у кобелей крипторхов. Данное исследование проведено на клинически здоровых кобелях и кобелях с крипторхизмом в возрасте от 3 до 12 лет мелких пород собак. Результаты исследования показывают, что АМГ у кобелей синтезируется на протяжении всего постпубертатного периода. Так, в возрасте от 3 до 12 лет уровень АМГ составил 22,7±3,23 нг/мл (n=25) (Lim 6,78-59,82). Имеется тенденция к снижению АМГ с возрастом. Уровень АМГ в возрасте между 3-5 и 6-8 лет (p<0.0001) достоверно снижается, с 43,62±5,07 нг/мл (n=7) до 17,04±2,56 нг/мл (n= 11), соответственно. Содержание тестостерона в сыворотки крови в возрасте от 3 до 12 лет составило 9,02±
0,79 нмоль/л (n=33) (Lim 3,33-22,7). Уровень тестостерона достоверно повышается в возрасте между 3-5 и 6-8 лет (p=0,0049), с 6,88±0,82 нмоль/л (n=14) до 13,55±2,48 нмоль/л (n=6), соответственно, достоверной разницы с 6-8 до 9-12 лет не обнаружено. Корреляция между содержанием в сыворотки крови АМГ и тестостерона не выявлено (r=-0,39, n=20; p=0,08).
Полученные нами данные свидетельствуют о том, что весь постпубертатный период у кобелей собак уровень АМГ в сыворотки крови остается на относительно высоком уровне. Источником синтеза АМГ у кобелей собак являются исключительно семенники.
ANTI-MULLER HORMONE LEVEL IN ADULT MALE DOGS DEPENDING ON AGE AND
GONAD STATE
Khusnetdinova N.F., Guselnikova A.A.
Summary
The purpose of the study was to evaluate the levels of AMH circulating in the blood of male animals in the post-pubertal period, as well as to evaluate this hormone in cryptorchid male dogs. This study was conducted on clinically healthy maledogs and maledogs with cryptorchidism aged 3 to 12 years of small dog breeds. The results of the study show that AMH in maledogs is synthesized throughout the entire post-pubertal period, so that at the age of 3 to 12 years, the AMH level was 22.7 ± 3.23 ng / ml (n = 25) (Lim 6.78-59.82) There is a trend of decreasing AMH with age. The level of AMH between the ages of 3-5 and 6-8 years (p<0.0001) significantly decreases, from 43.62 ± 5.07 ng / ml (n = 7) to 17.04 ± 2.56 ng / ml (n = 11), respectively. The serum testosterone levels at the age of 3 to 12 years were 9.02 ± 0.79 nmol / L (n = 33) (Lim 3.33-22.7). Testosterone levels significantly increase between the ages of 3-5 and 6-8 years (p = 0.0049), from 6.88 ± 0.82 nmol / L (n = 14) to 13.55 ± 2.48 nmol / L (n = 6) respectively, no significant difference was found from 6-8 to 9-12 years.No correlation between serum AMH and testosterone was found (r = -0.39, n = 20; p = 0.08).
Our findings indicate that the entire post-pubertal period in male dogs, the serum AMH level remains at a relatively high level. The source of AMH synthesis in male dogs is exclusively the testes.
