CC BY
39
Логинова А.К., Плотников А.О.
Оренбургская государственная медицинская академия Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, г. Оренбург E-mail: histo-ann@yandex.ru
УНИВЕРСАЛЬНЫЙ МЕХАНИЗМ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ БАКТЕРИЙ, ОБЛАДАЮЩИХ АНТИГИСТОНОВОЙ АКТИВНОСТЬЮ,
С КЛЕТКАМИ ЭУКАРИОТ
Исследовано влияние антигистоновой активности бактерий Esherichia coli на клетки печени и семенников крыс-самцов в условиях экспериментальной инфекции. Выявленные цитологические и цитохимические изменения были сходны с полученными на модели «Esherichia coli -Tetrahimena pyriformis»[1], что позволяет говорить об универсальности реакций эукариот на ан-тигистоновую активность бактерий, и может рассматриваться в качестве единого механизма их симбиотических взаимодействий.
Ключевые слова: антигистоновая активность, симбиоз, взаимодействия прокариот-эукари-
от, печень, семенники.
Цель работы - установить закономерности структурно-функциональных изменений клеток млекопитающих (крыс) в условиях воздействия бактерий Е.соН с антигистоновой активностью.
Материал и методы
Исследование было проведено на 10 белых беспородных половозрелых крысах- самцах массой 180-230 г. Животных инфицировали путем внутрибрюшинного введения 1 мл полумиллиардной (5*108 КОЕ/мл) взвеси бактерий ЕзЬепсЫа соН (штамм 20В1из коллекции водной лаборатории природных микробиоценозов ИКиВС УрО РАН) в 0,9% растворе №С1. Первой группе животных вводили бактерии с антигистоновой активностью (АГА+), второй -бактерии без такового признака (АГА -). В работе использовали изогенные клоны указанных бактерий. При этом, клон Е.соН (АГА+) проявлял антигистоновую активность на уровне 6,8 мкг/мл, а клон (АГА-) не обладал этим свойством. Антигистоновую активность бактерий определяли методом фотометрии [1].
Всех животных выводили из опыта через 1 сутки под эфирным рауш-наркозом путем дека-питации. Материал от экспериментальных и контрольных животных (печень, семенники) подвергался однотипной гистологической обработке.
Для изучения морфологических изменений в исследуемых тканях парафиновые срезы окрашивали гематоксилином-эозином. Морфомет-рию осуществляли на основе изучения 100 клеток для каждой исследуемой группы при помощи цифровых изображений. Для визуализации изменений структуры ДНК срезы окрашивали
по Фельгену. Содержание гистонов в клетках тканей животных оценивали цитохимическим методом Олферта-Гешвинда в модификации Эренпрейса [2] с использованием красителя ами-до черного 10Б. Оценку цитохимической реакции на гистоны производили визуально по интенсивности окраски ядер в баллах от 0 до 3. Содержание гистонов в клетках выражали в виде среднего цитохимического коэффициента (СЦК), вычисляемого по формуле Маянской [3].
Результаты
В препаратах печени окрашенных гематоксилином-эозином, обнаружены визуальные различия размеров ядер и структуры хроматина клеток в органах животных, зараженных штаммами микроорганизмов с АГА и без таковой.
В печени животных, инфицированных штаммом Е.соН (АГА-) внутрибрюшинно ядра гепатоцитов имели темную кариоплазму, окрашенную равномерно, либо с участками просветлений. Контуры ядер округлые. Цитоплазма клеток оценивалась как слабо базофильная, ок-рашивалсь неравномерно.
В печени животных, инфицированных штаммом Е.соН (АГА+) визуально ядра имели неровные очертания, наблюдалась внутриядерная дехроматизация. Наблюдалось резкое увеличение степени эозинофилии цитоплазмы. Центролобулярные гепатоциты не демонстрировали митотической активности, степень гетероморфизма их ядер была повышена, а доля полиплоидных и двухъядерных клеток - снижена (р?0,01). Количество долек в единице площади и их линейные размеры не были измене-
ны (р>0,05). В тканях печени наблюдалось полнокровие. Анализ эффектов антигистоновой активности E.coli показал сохранность лобуляр-ного состава паренхимы печени. При этом клеточные элементы перипортальных зон печеночных долек снижали уровень нуклеодинамики и белкового синтеза в цитоплазме.
Морфометрическое исследование ядер гепа-тоцитов подтвердило различия между двумя группами животных. В группе крыс, инфицированных АГА+ штаммом средняя площадь ядер гепатоцитов составила 27,61±0,483 мкм2. В то время как у крыс, зараженных АГА- штаммом, она была равна 30,21±0,473 мкм. Критерий Стью-дента для данных двух групп равен был 3,84 при ^крит=1,973 и уровне значимости р=0,05.
При окраске по Фельгену ядра клеток печени крыс, инфицированных штаммом АГА+ были окрашены менее интенсивно, чем у животных, инфицированных бактериями АГА-. При окраске по Олферту-Гешвинду выявлены различия в содержании гистонов в клетках печени животных первой и второй групп. В печени животных первой группы уменьшалось количество клеток с высоким содержанием гистонов, появлялись ядра, в которых гистоны цитохимически не были выявлены. У животных 2 группы в основном регистрировали клетки с высоким содержанием гистонов.
В семенниках животных, инфицированных бактериями АГА-, в интерстиции был выражен транссудат. Клетки Лейдига гипотрофированы, ядра пикнотизированы, цитоплазма резко ок-сифильна, что свидетельствует о снижении уровня стероидогенеза. Также наблюдались изменения клеток сперматогенного пласта. Ранние округлые сперматиды были слущены в просвет канальцев и агрегированы в многоядерные конгломераты, располагающиеся в центре просвета извитых семенных канальцев (ИСК) и занимающие до 90% площади его поперечного сечения. При этом сперматиды более поздних этапов развития сохраняли связь с сустентоци-тами. Неизмененными оставались ассоциации половых клеток, в составе которых присутствовали сперматоциты первого порядка, находившиеся на ранних этапах профазы первого мей-оза, а также средние сперматиды.
При внутрибрюшинном введении бактерий АГА+ клетки Лейдига формировали две патологические субпопуляции. Клеточный со-
став первой был аналогичен описанному выше, остальные клетки имели относительно большой объем эухроматичных ядер с 3-5 глыбками гетерохроматина. В просвете ИСК присутствовали 2-3-х-ядерные сперматиды. В целом, спер-матогенный эпителий был сохранен.
В целом в семенниках наблюдалась сохранность цикла эпителио-сперматогенного пласта, что предполагает на данном этапе ответа организма протекцию градиента дифференцированных клеточных элементов. Что касается упомянутых изменений, то они скорее всего являются следствием повышения проницаемости гемато-тестикулярного барьера или воздействия на клетки токсинов, выделяемых бактериями.
Обсуждение
В ряде исследований было установлено, что гистоны и их фрагменты, выделенные от млекопитающих, птиц, рыб, моллюсков и других организмов, способны проявлять антимикробную активность [4], направленную против широкого спектра микроорганизмов. Влияние гистонов на микроорганизмы избирательно, что связано с неодинаковой устойчивостью к гистонам у представителей различных таксонов [5]. Проявлением такой устойчивости является способность бактерий снижать бактериостатический эффект гистонов, названная антигистоновой активностью (АГА). АГА рассматривается как один из механизмов персистенции микроорганизмов в клетках организма хозяина [6], что было продемонстрировано ранее на модели «Esherichia coli -Tetrahimena pyriformis» [1]. В клетках инфузорий была обнаружена инактивация гистонов и декомпактизация хроматина, с одновременным сохранением прокариот в клетках простейших в результате незавершенного фагоцитоза.
Результаты исследований, проведенных на крысах, свидетельствуют об изменении цитологических и цитохимических показателей клеток млекопитающих, аналогично результатам, полученным в опытах с простейшими. В частности, показано уменьшение содержания гис-тонов в ядрах гепатоцитов, изменение средней площади ядер одновременно с их эухроматиза-цией под влиянием бактерий АГА+.
Схожесть изменений в эукариотических клетках одноклеточных и многоклеточных организмов при взаимодействии с бактериями (АГА+) отражает общую закономерность изме-
нения функциональной активности генетического аппарата эукариот под действием бактерий.
Характер цитологических и цитохимических изменений в клетках эволюционно удаленных друг от друга организмов свидетельствует об универсальности реакций эукариот на анти-гистоновую активность бактерий, что может рассматриваться в качестве единого механизма их симбиотических взаимодействий.
Таким образом, представлены новые теоретические сведения о влиянии антигистоновой активности бактерий на морфологические и цитохимические показатели эукариотических клеток позвоночных животных. Полученные данные представляют интерес для понимания роли антигистоновой активности бактерий в патогенезе бактериальных инфекций.
07.02.2011
Список литературы:
1. Бухарин О.В., Плотников А.О., Немцева Н.В., Ковбык Л.В. Взаимодействия «гистон-антигистон» в сообществе бактерий Escherichia coli и инфузорий Tetrahymena pyriformis // Микробиология.- 2008.- Т.77.- №2.- С. 219-225.
2. Бухарин О.В., Плотников А.О., Немцева Н.В., Сгибнев А.В. Способ определения антигистоновой активности микроорганизмов // Патент РФ №2203956. Дата регистрации 10.05.2003. Бюл. №13. 22 с.
3. Эренпрейс Я.Г. Цитохимическое исследование основных белков клетки // Арх. анат., гистол. и эмбриол. -1965. -Т. 49. -№12. - С. 3-8.
4. Маянская Н.Н., Николаев Ю.А., Шургая А.М., Гефарова З.М. Цитохимическое определение лизосомальных катионных белков в нейтрофилах крови при гипертрофической кардиомиопатии // Лабораторное дело.- 1991. -№5. - С. 15-18.
5. Parseghian M.H., Luhrs K.A. Beyond the walls of the nucleus: the role of histones in cellular signaling and innate immunity // Biochem. Cell Biol. - 2006. - №84. - P. 589-604.
6. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. М.: Медицина; Екатеринбург: УрО РАН. - 1999. 367 с.
7. Ждан-Пушкина С.М., Дронова Н.В. О дифференциальной чувствительности бактерий к гистонам // Микробиология.-1976. - T. XLV. - С. 61-65.
Работа выполнена по гранту №09-П-4-1037 программы Президиума РАН «Биоразнообразие»
Сведения об авторах:
Плотников Андрей Олегович, в.н.с. лаборатории природных микробиоценозов Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, кандидат медицинских наук, доцент Логинова Анастасия Константиновна, аспирант кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии Оренбургской государственной медицинской академии 460000, г. Оренбург, ул. Пионерская, 11, каб. 307, e-mail: histo-ann@yandex.ru
UDC 57.084:576.32/.36:591.557 Loginova A.K., Plotnikov A.O.
Orenburg state medical academy Institute of cellular and intracellular symbiosis UrB RAS E-mail: histo-ann@yandex.ru
UNIVERSAL MECHANISM OF INTERACTION BETWEEN BACTERIA WITH ANTIHISTONE ACTIVITY AND EUKARYOTIC CELLS
There were studied the effects of Esherichia coli antihistone activity on the hepatocytes and semeniferous epithelium of male rats in the experimental infection. Revealed cytological and cytochemical changes were similar to those obtained in the model of «Esherichia coli - Tetrahimena pyriformis»[1], that allows us to think about the universality of symbiotic interactions between eucariotic cells and bacteria with antihistone activity. Key words: antihistone activity, symbiosis, prokariotic-eukaryotic interactions, liver, testis.
Bibliography:
1. Bukharin O.V., Plotnikov A.O., Nemtseva N.V. and Kovbyk L.V. Histone-Antihistone Interactions in the Esherichia coli -Tetrahimena pyriformis Association // Microbiology. - 2008. - Vol. 77. - №2. - P. 186-191.
2. Bukharin O.V., Plotnikov A.O., Nemtseva N.V., Sgibnev A.V. Method of Determination of Antihistone Activity of Microorganisms. RF Patent №2203956. - Byul. Izobret. - 2003. - №13.
3. Erenpreys, Ya. G. Cytochemical investigation of the cell proteins // Arch. of Anat., Hist., and Embr. - 1965. - V. 49. - №12. - P. 3-8.
4. Mayanskaya N.N., Nikolaev Yu.A., Shurgaya A.M., and Gefarova Z.M. Cytochemical Determination of the Lysosomal Cationic Proteins in Blood Neutrophiles in Cases of Hypertrophic Cardiomyopathy // Lab. Delo. - 1991. - №5. - P. 15-18.
5. Parseghian M.H., Luhrs K.A. Beyond the walls of the nucleus: the role of histones in cellular signaling and innate immunity // Biochem. Cell Biol. - 2006. - №84. - P. 589-604.
6. Bukharin O.V. Persistence of pathogenic Bacteria. Moskow: Medcine; Ekaterinburg: UrO RAS. - 1999. 367 p.
7. Zhdan-Pyushkina S.M., Dronova N.V. Differential Sensibility of Bacteria to Histones // Microbiology. - 1976. - V. XLV. - P 6165.
