CC BY
58
УДК 57.085.1
Логинова А.К.*, Стадников А.А.*, Немцева Н.В.**
*Оренбургская государственная медицинская академия Минздрава России "Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН E-mail: histo-ann@yandex.ru
ОСОБЕННОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ В СЕМЕННИКАХ КРЫС ПРИ ИНТРАТЕСТИКУЛЯРНОМ ВОЗДЕЙСТВИИ БАКТЕРИЙ E.COLI С АНТИГИСТОНОВОЙ АКТИВНОСТЬЮ
В статье приведены морфофункциональные данные по установлению особенностей течения воспалительного процесса в семенниках крыс в условиях интратестикулярного инфицирования изогенными клонами бактерий Escherichia coli с антигистоновой активностью (АГА) и без таковой. В результате исследования выявлена группа факторов, обуславливающих повреждение ги-строструктур семенника, вызванные воздействием бактериями, обладающими персистентным потенциалом по показателям антигистоновой активности.
Ключевые слова: семенники, caspase-3, апоптоз, E.coli, гистоны, антигистоновая активность.
Взаимодействие про- и эукариот является неизбежным и эволюционно детерминированным явлением экогенеза. Частный случай такого взаимодействия - воспалительный процесс, развитие и прогрессирование которого зависит от характеристик двух взаимодействующих микро- и макроорганизмов. Показано, что ведущую роль в защите высших эукариотов от инфекций и биологической агрессии играет филогенетически более древний (1,5 млрд. лет) врожденный иммунитет, который руководит запуском и последующей работой адаптивного иммунитета [10]. Такое диаметральное изменение взглядов на роль звеньев иммунной системы в формировании и течении инфекционного процесса выявило необходимость переосмысления механизмов взаимодействия про- и экарио-тических организмов в условиях воспаления.
Эффективная борьба с инфекциями, сопровождающимися развитием воспалительного процесса в органах мочеполовой системы человека и животных, а также приводящих в последующем к развитию бесплодия, является одной из наиболее актуальных проблем [7].
Роль инфекционно-воспалительного процесса в развитии мужского бесплодия признается большинством исследователей. Для выявления закономерностей персистирования и элиминации возбудителей у людей, а также для оценки выраженности повреждений при экспериментальной инфекции в качестве маркеров широко используются факторы бактериальной персистенции [6].
Бактерии рода Escherichia не только являются представителями резидентной микрофло-
ры урогенитального тракта, относясь к группе условно-патогенных микроорганизмов, но и могут являться причиной развития бактериального орхита и эпидидимита, не редко выступающих причинами морфофункциональных нарушений в половых железах у мужчин [3].
Выбор штамма Б.соИ, обладающего анти-гистоновой активностью, лля изучения адаптивных реакций сперматогенного эпителия был сделан исходя из имеющихся в литературе данных о том, что гистоны играют важнейшую роль в формировании клеток сперматогенного эпителия. Кроме того, что они отвечают за «упаковку» хроматина и регулируют его функциональную активность, они также обеспечивают антимикробную защиту эукариотических орга-низмов[1, 9, 11]. Вполне понятно, что АГА бактерий является закономерным результатом филогенетически древних взаимодействий про-и эукариот и служит одним из механизмов поддержания их популяции [4].
В данном исследовании приводятся результаты по изучению реактивности и пластичности тканевых и клеточных элементов семенников крыс в ответ на внедрение бактерий Б.соИ, обладающих антигистоновой активностью с целью оценки возможностей реализации механизмов адаптогенеза семенников.
Материал и методы исследования
Экспериментальное гистологическое исследование проведено на 27 половозрелых белых крысах-самцах линии Wistar массой 230-250 г. Животных содержали в стандартных клетках (по 4-7 особей) при искусственном освещении
(8.00-20.00 - свет, 20.00-8.00 - темнота) и температуре (20-22°C) и свободном доступе к воде и пище. Экспериментальные исследования на животных выполнены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. № 755), а также в соответствии с требованиями Всемирного общества защиты животных (WSPA) и Европейской конвенции по защите экспериментальных животных.
Животным интратестикулярно вводили бактериальную суспензию (0,1 мл) в область нижнего полюса обоих семенников. Первой группе (9 крыс) вводили бактериальную суспензию E.coli с антигистоновой активностью («АГА+»), второй группе (9 крыс) - E.coli без антигистоновой активности («АГА-»); третьей, контрольной группе (9 крыс) - стерильный физиологический раствор. Для исследования использовали изогенные клоны музейного штамма E.coli (штамм E. coli 6B1) из коллекции лаборатории водной микробиологии Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН. Для инъекции готовили суспензию суточной агаровой культуры бактерий E.coli «АГА+» и «АГА-» по стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича № 5 (5х108 КОЕ/мл) в стерильном физиологическом растворе. Плотность используемой бактериальной суспензии подбирали экспериментально. Животных выводили из эксперимента под эфирным рауш-наркозом на 3, 7 и 10 сутки после введения бактериальной взвеси.
Определение антигистоновой активности бактерий проводили по методике [5]. Обсеме-нённость внутренних органов определяли бактериологическим методом.
Материал от экспериментальных и контрольных животных (семенники) подвергали однотипной гистологической обработке.
Иммуноцитохимически определяли эспрес-сию проапоптотического белка caspase-3 (Sigma-Aldrich, США). Все манипуляции с антителами осуществляли согласно протоколам фирм-производителей. Для каждой исследуемой группы проводили выборочный контроль специфичности иммунодетекции. Индекс апоп-тоза (ИА) определяли путем подсчета сaspase-3 - позитивных клеток на 100 клеток соответствующего класса и высчитывали как процент
клеток с позитивном интрануклеарнои реакцией (антигенные детерминанты расположены в ядре) от общего среднего количества клеток каждого класса при изучении всех участков.
Особенности изменений, происходящих в семенниках, оценивали с использованием количественных параметров: диаметра извитых семенных канальцев (ИСК), относительной площади интерстиция, доли ИСК с многоядерными клетками. Измерения проводили на строго поперечных срезах извитых семенных канальцев. Морфометрию выполняли на световом микроскопе Биомед - 6 ПР 3 (Биомед, Москва) с использованием цифровой камеры Toup Camera, 5.0 mpx, и программе Toup Camera согласно общепринятым методикам.
Количественные параметры подвергали статистической обработке параметрическими и непараметрическими методами вариационной статистики при помощи программы BioStat 2009.
Результаты
В гонадах животных, инфицированных штаммом E. coli «АГА-», через 3 суток формировался фокус деструкции. При этом наблюдали диссоциацию сперматогенного эпителия с последующей некротизацией его элементов (рис. 1).
В интерстиции семенников наблюдали ди-апедез лейкоцитов, среди которых преимущественно выявляли полиморфноядерные лейкоциты и макрофаги. Относительная площадь интерстициальной ткани в семенниках крыс была увеличена за счет отека (табл. 1). В отдельных участках извитых семенных канальцев
Рисунок 1. Участок интерстиция семенника крысы
на 3 сутки после инфицирования Е.соИ «АГА-». На снимке - диапедез форменных элементов крови. В ИСК дезорганизация и дасквамация сперматогенного эпителия. Окр.: гематоксилин Майера-эозин. Об. х400.
(ИСК) наблюдали снижение высоты сперматогенного эпителия, а также его полное отсутствие в отдельных ИСК. К 7 суткам эксперимента признаки воспалительной реакции в ин-терстиции ослабевали, однако в просвете ИСК продолжался процесс активного слущивания клеточных элементов сперматогенного эпителия и их некротизация. В герминативной паренхиме половых желёз можно было наблюдать диффузный асперматогенез.
На 10 сутки эксперимента отмечена тенденция к восстановлению сперматогенеза. В ИСК деструктивная перестройка была выражена слабее, хотя и встречались деструктивно изменённые, запустевшие извитые семенные канальцы. Сперматогенный эпителий в канальцах имел высоту не более половины нормы, но динамика дифференцировки демонстрировала появление всех видов половых элементов, в том числе сперматозоидов.
В гонадах животных, инфицированных изогенным клоном E.coli «АГА+», к 3 суткам опыта в ИСК отмечали явления некроза спер-матогенного эпителия. В интерстиции наблюдали распространённый отёк, а также краевое стояние лейкоцитов в сосудах стромы семенника и лейкодиапедез. Обширных скоплений лейкоцитов не обнаружено. Через 7 суток основная доля ИСК на протяжении большей части их длины была заполнена клеточным детритом. Отмечена активная некротизация и слущива-ние сперматогенных клеток. При этом высота сперматогенного эпителия была значительно снижена. К 10 суткам в семенниках группы «АГА+» было выявлено возобновление сперматогенеза. Высота сперматогенного эпителия была приближена к таковой в семенниках здоровых животных. При этом, однако, среди ИСК с восстановленным сперматогенным эпителием обнаруживали и склерозированные ИСК.
При измерении диаметра и площади поперечного сечения ИСК обращало на себя внимание значимое увеличение указанных параметров на 10 сутки в группе животных, инфицированных E.coli «АГА+».
Что касается результатов измерения относительной площади интерстиция, следует отметить активную реакцию интерстиция как на введение стерильного физиологического раствора, так и на введение бактериальной суспензии. Обращало на себя внимание также бо-
лее интенсивная реакция интерстиция на ранних сроках эксперимента, хотя, позднее, данные различия нивелировались в сравнении с контрольной группой (табл. 2). Отсутствие однозначной тенденции в данном случае, скорее всего, обусловлено наличием одновременно двух действующих факторов - механической травмы и бактериальной инфекции.
Частота обнаружения в просвете ИСК экспериментальных животных многоядерных клеток-шаров, или гигантских клеток (рис. 2) была неодинаковой. Наиболее ранний и интенсивный ответ в виде активной десквамации спер-матогенного эпителия был получен в группе животных, инфицированных E.coli «АГА+», в то время как пик ответа со стороны эпителия в группе животных, инфицированных E.coli «АГА-», наблюдали только к 7 суткам. Дальнейшее снижение количества данных клеток в группе животных, инфицированных изогенным клоном E.coli «АГА+» является результатом активной реакции эпителия на ранних этапах наблюдения. В ИСК контрольной группы животных подобные клетки не выявлялись (рис. 3).
Иммуногистохимическая идентификация синтеза проапоптотического белка caspase-3
Таблица 1. Диаметр извитых семенных канальцев семенников крыс после интратестикулярного введения Е.соИ (М±т, мкм)
Контроль «АГА-» «АГА+»
3 сутки 261,19±2,95 235,02±2,29 P1 <0,01 237,57±3,51 P1 <0,01; P2 <0,01
7 сутки 244,8±3,56 208,54±5,3 P1 <0,01 255,82±3,61 P1 <0,01
10 сутки 243,4±5,8 225,47±4,23 250,07±3,44 P1 <0,05; P2 <0,05
Таблица 2. Относительная площадь интерстициальной ткани в семенниках крыс после интратестикулярного введения Е.соИ с различным персистентным потенциалом (М±т, %)
Контроль «АГА-» «АГА+»
3 сутки 11,05±1,19 14,95±1,19 P1<0,05 16,78±1,32 P1<0,05
7 сутки 12,81±1,15 13,66±2,05 13,23±2,1
10 сутки 19,1±1,47 15±1,79 P1<0,05 14,37±1,59 P1<0,05
Р1 - статистически значимые различия с группой контроля
(табл.3) показала, что наиболее активно явления апоптоза наблюдали в группе ранних спер-матид, в которых обнаруживали и другие их признаки, проявляющиеся в маргинации хроматина, вакуолизации ядер круглых сперматид. Реже признаки синтеза данного белка выявляли среди сперматоцитов первого и второго порядков. При этом экспрессия caspase-3 сохранялась на высоком уровне на протяжении всего эксперимента.
На 10 сутки происходило запустевание, а также склерозирование ИСК, в которых, по-видимому, имели место необратимые повреждения сперматогенеза. Однако и в случае с введением E.coli «АГА+», и «АГА-» имели место признаки восстановления сперматогенеза, хотя и не совсем полноценного. В качестве особенности выявляли достаточно высокую устойчивость к апоптозу сперматогоний.
Обсуждение
В данном исследовании проведено моделирование воспалительного процесса, вызванного кишечной палочкой, обладающей антигис-тоновой активностью. Выбор экспериментальной модели не случаен, поскольку, общепризнанным является то, что только инвазивные методы исследования семенников способны дать окончательный ответ о сохранности процессов сперматогенеза. Однако в данном исследовании модель интратестикулярного введения бактерий с точки зрения оценки антигистоновой активности бактерий нами применена впервые.
В результате исследования выявлена группа факторов, обуславливающих повреждение семенника, вызванные воздействием E. coli с антигистоновой активностью. К ним можно отнести интенсификацию развития воспалительного процесса, обширную некротизацию спер-матогенного эпителия, усиление механизмов
элиминации генетически поврежденных половых клеток путем формирования многоядерных герминативных элементов с последующим апоптозом клеточных элементов, а также снижение пролиферативной активности клеток сперматогенного эпителия.
Результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что задержка эксудатив-ной фазы воспалительного процесса усугубляет развитие альтерации семенника в условиях инфицирования штаммом «АГА+». Значиения индекса апоптоза в группе «АГА+», полученные в результате иммуноцитохимического исследования позволяют сделать предположение о связи действия бактериального агента с наруше-
Рисунок 2. Многоядерные клетки в просвете ИСК крыс после интратестикулярного введения изогенного клона Е.соН «АГА+», 7 сут. Окраска гематоксилин Майера-эозин. Ув. х400.
* р<0,05
Рисунок 3. Доля поперчных срезов извитых семенных канальцев семенников крыс, в просвете которых выявляли многоядерные клетки-шары после интратестикулярного заражения (М±т, в %)
Таблица 3. Индекс апоптоза сперматогенных клеток при интратестикулярном введении E.coli «АГА+» и «АГА-» (M±m, %)
Сроки наблюдения (сутки) Сперматогонии Спераматоциты Ранние Сперматиды
«АГА+» «АГА-» «АГА+» «АГА-» «АГА+» «АГА-»
3 20,5±3,9 5,85±1,7 38,9±4,4* 36,5±4,3* 45,9±5,2* 31,6±7,1
7 12,9±2,7* 4,04±1,1 26,9±3,2* 10,1±2,6* 50,7±5,5* 31,2±6,02*
10 0 0 8,1±1,3* 5,0±0,85* 20,1±3,6* 18,5±2,2*
* р<0,05, достоверность различия изменения показателя между опытными группами.
нием метаболизма гистоновых белков в клетках сперматогенного эпителия.
Полученные данные согласуются с имеющимися сведениями о высокой чувствительности органов мужского репродуктивного тракта к действию различных дестабилизирующих факторов [2], [8], [11]. Полученные нами сведения о морфофункциональных повреждениях тубуляр-ного и интерстициального компонентов семенников исследуемых животных демонстрирует общебиологическую реакцию на системное дестабилизирующее воздействие, в котором отражено не только наличие персистентных свойств у исследуемого бактериального агента, но и реакция тканей и клеток организма животного.
Особого внимания заслуживает выявление гигантских клеток-шаров в прсвете ИСК. Эти клетки представляли собой неполноценные и вставшие на путь апоптотической гибели ранние сперматиды, реже сперматоциты, которые, будучи соединенными цитоплазматическими мостиками, слущивались в просвет ИСК в виде целых пластов или образовывали шарообразные структуры [9].
Результаты иммуногистохимического выявления белка caspase-3 в клетках сперматогенного эпителия обращают на себя особое внимание. В процессе сперматогенеза в гонадах половозрелых млекопитающих спонтанному апоп-тозу подвергается до 75% потенциальных сперматозоидов. Однако, как правило, это клетки, расположенные в различных участках ИСК, сразу фагоцитируемые клетками Сертоли. Этим объясняется сложность детекции спонтанного апоптоза в тканях семенников. Апоптоз,
спонтанно возникающий среди клеток здоровых тканей, является регуляторным механизмом. Обнаружение же явлений программированной клеточной гибели в данном случае говорит о критическом количестве клеток с «поврежденным» генетическим материалом.
Вероятность вступления клетки в апоптоз зависит от множества факторов, от фазы клеточного цикла, в котором находилась клетка на момент обнаружения поломки, а также от наличия необходимых регуляторных белков, среди которых одну из важнейших функции выполняют гистоны. Повреждения молекул гис-тоновых белков, а также нарушение их синтеза приводит к апоптозу сперматогенных клеток [1], [9]. Таким образом, высокий уровень апоптоза при действии бактерий, способных деградировать гистоновые белки, свидетельствует в пользу антигистнового фактора.
Сведения о высоком уровне стабильности стволовых элементов сперматогенного эпителия, а также о наличии высокого адаптивного и регенераторного потенциалов соотносятся с данными, полученными ранее [2], [8].
Результаты, полученные на модели инт-ратестикулярного инфицирования экспериментальных животных, представляют интерес для понимания роли персистентных свойств, прежде всего антигистоновой активности бактерий в патогенезе системных инфекций и инфекций половых органов, а также подтверждают значимость персистентных свойств в формировании, течении и исходе воспалительного процесса в организме позвоночных животных.
01.10.2014
Работа выполнена при поддержке Гранта Правительства Оренбургской области для талантливой молодёжи (№ 17-г, 2012г.)
Список литературы:
1. Божедомов В.А., Липатова Н.А., Спориш Е.А., Рохликов И.М. Виноградов И.В. Роль структурных нарушений хроматина и ДНК сперматозоидов в развитии бесплодия // Андрология и генитальная хирургия. - 2012. - №3. - С. 82-92.
2. Боков Д.А., Шевлюк Н.Н. Характеристика сперматогенеза у мышей CBAXC57B16 при комбинированном действии хрома и бензола // Проблемы репродукции. - 2014. - № 2. - С. 7-11.
3. Бухарин О.В., Кузьмин М.Д., Иванов Ю.Б. Коррекция микробиоценоза урогенитального тракта мужчин на фоне гормональной терапии // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2000. - № 4. - С. 188—192.
4. Бухарин О.В., Соколов В.Ю. Антигистоновая активность бактерий. Персистенция патогенных бактерий. М.: Медицина; Екатеринбург: УрО РАН.- 1999. 99 с.
5. Пат. 2203956 Российская Федерация, МПК C12Q1/02. Способ определения антигистоновой активности / Бухарин О.В., Плотников А.О., Немцева Н.В., Сгибнев А.В.; заявитель и патентообладатель Институт КВС УрО РАН. - № 2001133150/ 13; заявл. 16.12.2001; опубл. 10.05.2003, Бюл. №3. - 3с.: илл.
6. Стадников А.А., Шевлюк Н.Н., Козлова А.Н. Эндоцитосимбиоз микроорганизмов в эукариотических клетках млекопитающих и факторы его регуляции // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2006. - №4. - С. 46-49.
7. Тер-Аванесов Г.В. Современные аспекты диагностики и лечения мужского бесплодия // Бесплодный брак. Под ред. В.И. Кулакова. М: ГЭОТАР - Медиа. - 2005. 279 с.
8. Шевлюк Н.Н., Руди В.Н., Стадников А.А. Биология размножения наземных грызунов из семейства бельчьих (морфологические, физиологические и экологические аспекты). Екатеринбург: УрО РАН. - 1999. 146 с.
9.Blanco-RodriguezJ. Keep cycling or die: the role of germ cell apoptosis in spermatogenesis // Department of Cell Biology, School of Medicine, Valladolid University, Spain, 2006. http://www.andrology.org/library/downloads/BR_full.pdf:
10. KimbrellD.A, Beutler B. The evolution and genetics of innate immunity. Nature. - 2001. - V.2. - Р. 256-267.
11. Nagaosa K, Nakashima Ch, Kishimoto A., Nakanishi Y. Immune response to bacteria in seminiferous epithelium // Society for Reproduction and Fertility. - 2009. - Р. 1470-1626.
Сведения об авторах:
Логинова Анастасия Константиновна, ассистент кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии, кандидат медицинских наук, e-mail: histo-ann@yandex.ru
Стадников Александр Абрамович, заведующий кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии, доктор биологических наук, e-mail: alexandr.stadnikov@yandex.ru
460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6, тел. (3532) 772275
Немцева Наталия Вячеславовна, заведующий лабораторией водной микробиологии Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, доктор медицинских наук,
профессор, e-mail: nemtsevanv@rambler.ru
460000, г. Оренбург, ул. Пионерская, 11, каб. 307, тел. (3532) 770512
