CC BY
7
Обзоры
УДК 614.718-078(047)
Канд мед. наук В. Л. Евдокимов
УНИВЕРСАЛЬНЫЕ СХЕМЫ ЛАБОРАТОРНОГО АНАЛИЗА МИКРОФЛОРЫ ВОЗДУХА
Всесоюзный научно-исследовательский институт гриппа Министерства здравоохранения
СССР, Ленинград
(Процесс исследования аэромикрофлоры можно разделить на 2 этапа: 1) технический, заключающийся в извлечении микрофлоры из воздуха (отбор проб), и 2) биологический, при котором проводят количественный и качественный анализ уловленных бактерий и вирусов.
Основными задачами технического этапа являются: а) по возможности полное отделение микробных аэрозольных частиц от дисперсионной, газовой среды; б) отбор достаточно представительной пробы, отражающей действительное содержание микробов в воздухе, и в) сохранение жизнеспособности микрофлоры в процессе пробоотбора.
К настоящему времени предложено несколько сот конструкций бакте-рио- и вирусоуловителей. Данные о большинстве этих приборов и их сравнительной эффективности приведены в работах И. И. Богданова и Н. М. Ка-морского; В. В. Влодавца; А. И. Жуковой; Г. И. Карпухина, С. С. Реч-менского и др. Современная рациональная классификация количественных методов определения аэромикрофлоры и соответствующей аппаратуры разработана нами совместно с Н. М. Руденко.
Содержание биологического этапа исследования определяется способом отбора пробы на первом этапе, биологическими особенностями уловленных (искомых) микроорганизмов и целью эксперимента. Главной задачей здесь является правильное отражение числа микробов, извлеченных из воздуха в процессе пробоотбора. Это достигается применением лабораторных методов, соответствующих цели исследования, при условии сведения к минимуму потерь микробов в ходе анализа проб. Следовательно, число лабораторных операций должно быть минимальным, что, однако, не всегда возможно. Во многих случаях прежде чем уловленная микрофлора будет количественно определена культуральным, биологическим (на лабораторных животных), серологическим или иным выбранным методом, ее необходимо смыть с поверхности улавливания или извлечь из фильтрующего слоя, сконцентрировать в объеме жидкой пробы или, наоборот, развести и т. п. Возможные сочетания таких операций, составляющих варианты лабораторного анализа воздушной микрофлоры, можно представить в виде универсальных схем (схема 1,2 и 3), практически полностью охватывающих методические приемы, используемые аэромикробиологами при исследовании бактерий, бактериофагов и вирусов.
При построении схем мы исходили из того, что, несмотря на многообразие приборов, предложенных для исследования аэромикрофлоры, в основе их действия лежит 1 из следующих принципов отделения частиц: а) осаждение на твердую поверхность (в том числе и плотней питательной среды) за счет гравитационных (седиментация), инерционных (импакция), центробежных сил или в электрическом поле; б) фильтрационная задержка в нерастворимых или растворимых фильтрах; в) улавливание в жидкость путем иннервационного осаждения на поверхность, барботирования или сифонирования. Такое деление принято в упомянутой классификации (Н. М. Руденко и В. Л. Евдокимов). Предлагаемые схемы, отражающие биологический этап исследования аэромикрофлоры, дополняют эту класси-
Схема 1. ВАРИАНТЫ ЛАБОРАТОРНОГО АНАЛИЗА БАКТЕРИЙ, УЛОВЛЕННЫХ ИЗ ВОЗДУХА
Бактериальный аэрозоль 1 =
Отделение аэрозольных частиц от газовой фазы
Седимантация.импанция или центробежное осаждение
I
На поверхность плотной питательной среды
1
На твердую поверхность (стекло, металл и др.)
Фильтрация
Улавливание в жидкость
] I
Через мембранный ультрафильтр
ЕЛ-
Через неоастворимые (кроме мембранного) или растворимые фильтры
Смыв жидкостью, отмывание или растворение в жидкости
Нонцентрирооанио на поверхности мембранного фильтра
Концентрирование осаждением или центрифугированием
Отпечаток на поверхность плотной питательной среды
Наложение на поверхность плотной питательной среды (для проращивания клеток)
Отмывание в меньшем объеме жидкости
Приготовление разведений (при необходимости)
Посев на плотные или в жидкие питательные среды Постановка биологических проб или серологичесних реакций
Термостатирование I
X
Учет результатов
Схема 3. ВАРИАНТЫ ЛАБОРАТОРНОГО АНАЛИЗА ВИРУСОВ, УЛОВЛЕННЫХ ИЗ ВОЗДУХА
фикацию с точки зрения выбора путей лабораторного анализа бактерий, вирусов и бакриофагов. На схемах не отдается предпочтения какому-либо варианту анализа. Все варианты рассматриваются как реально возможные, а выбор наиболее приемлемых представляется самому исследователю. Основной из этих схем мы считаем схему лабораторного анализа бактериальной аэромикрофлоры (см. схему 1), поскольку последняя наиболее часто является предметом исследования. Схемы анализа бактериофагов и вирусов (см. схему 2 и 3) имеют особенность в соответствии с их культурально-морфологическими свойствами.
При непосредственном осаждении бактерий на поверхность плотной питательной среды (в аэроцентрифугах, щелевых, каскадно-ситевых приборах) количество выросших бактериальных колоний принимают равным содержанию бактериальных частиц в^пробе или единице объема воздуха. Здесь технический и биологический этапы исследования совпадают. В случае отбора подобных проб с помощью каскадных приборов (В. С. Ярных; Andersen; Lidwell; May) одновременно с концентрацией определяют и фракционно-дисперсный состав бактериального аэрозоля. Результаты исследования выражают количеством бактериосодержащих частиц it при аспи-рационном отборе проб через мембранные фильтры с последующим наложением их на питательный агар для проращивания уловленных бактерий, а также при методе отпечатков на агар с мембранных фильтров поверхностей стекла, металла и т. п. При всех остальных вариантах лабораторного анализа бактерии (исследование смывов с улавливающих поверхностей, жидких проб после растворения фильтров или отмывания с них бактерий, улавливающей жидкости из жидкостных бактериоуловителей) конечный результат исследования выражают количеством бактериальных клеток в « пробе (единице объема) воздуха. Отношение этого количества к числу бактериосодержащих частиц характеризует среднюю загрузку аэрозольных частиц клетками.
Жидкие пробы, содержащие бактерии, можно исследовать также путем постановки биологических проб (заражение лабораторных животных) или серологических реакций. Конечный результат при этом выражается числом инфицирующих (летальных) доз или показателями антигенной активности, характеризующими содержание бактерий в пробе.
Схема лабораторного анализа бактериальной аэромикрофлоры применима и при исследовании актиномнцетов, плесневых и патогенных грибов, ул овленных извоздуха, поскольку здесь, как и в случае с аэрогенными бактериями, основными методами выявления микробов остаются культу-ральный, биологический и серологический. С другой стороны, значительные размеры элементов мицелия и спор у актнномицетов и грибов позволяют применять для их анализа все варианты, основанные на использовании мембранных фильтров.
Отличительной особенностью процесса исследования аэрозоля бактериофага (см. схему 2) является необходимость применения индикаторной культуры гомологичных бактерий при всех вариантах анализа проб. Сплошной газон роста индикаторных бактерий на агаровой среде получают при посеве шпателем или методом двуслойного агара. Сразу после такого посева чашки с агаром применяют для отбора проб аэрозоля фага с помощью каскадных приборов (например, импактора Андерсена), а также для исследования методом отпечатков фагов, осажденных из воздуха на твердую поверхность или задержанных мембранным фильтром. Негативные колонии фага можно получить и непосредственно на улавливающей поверхности мембранного фильтра, для чего на нее после отбора аспирационной пробы напыляют индикаторную культуру в количестве, достаточном для образования сплошного газона роста (при инкубации фильтра на агаровой среде). При методе, предложенном Р. А. Дмитриевой, на мембранный фильтр после отбора пробы аэрозоля фага наслаивают полужидкий агар, содержащий индикаторные бактерии. При всех перечисленных вариантах анализа по числу
негативных колоний, сосчитанных после термостатирования посевов, судят о содержании в исследуемом воздухе неразрушенных фагосодержащих частиц.
При отборе проб аэрозоля бактериофага с помощью жидкостных уловителей, а также при смывах с твердой поверхности, отмывании или растворении фильтров в жидкости, получают жидкие пробы, содержащие дезагрегированные корпускулы фага. Нередко в каскадных импакторах для улавливания фагов из воздуха используют среду на основе желатины, которую после отбора пробы можно растопить в термостате и исследовать как жидкую пробу (Washam и соавт.; Coriell и McGarrity). Концентрацию фаговых корпускул в жидких пробах определяют посевом по Грациа или Ап-пельману. В связи с малыми размерами корпускул фагов здесь, естественно, исключается их концентрирование из жидкой пробы с помощью мембранного фильтра. Этого можно достичь путем осаждения или ультрацентрифугирования проб (Д. М. Гольдфарб).
Разнообразны варианты анализа проб, содержащих вирусы, которые уловлены из воздуха (см. схему 3). Это, в частности, можно проиллюстрировать исследованиями, где в качестве пробоотборника применяли каскадный импактор Андерсена. Пробы аэрозолей разных вирусов в этом случае отбирали на поверхность агара, покрытую суспензией снятого молока (Jensen), желатиной или содержащими ее смесями (Guerin и Mitchell: Couch и соавт.; Gerone и соавт.). После разжижения желатины или смыва смесей с агара содержание вирусов в пробах определяли путем заражения культуры тканевых клеток или с помощью серологических реакций. В ходе такого анализа аэрозольные частицы, содержащие вирусы, должны дезагрегироваться до элементарных вирусных образований. Известны успешные попытки регистрации и неразрушенных аэрозольных вируссодержащих частиц. При этом для сбора вирусов в указанном импакторе применяли пустые чашки Петри или стеклянные диски, покрытые липкой смесью (Thomas), или же чашки с питательным агаром (Thomley). После отбора проб на собирающие поверхности наносили взвесь культуры клеток и конечный результат исследования выражали количеством бляшкообразующнх единиц (БОЕ) в объеме пробы, причем каждая БОЕ здесь соответствовала неразрушенной аэрозольной частице, несущей вирусы. В то же время неудачной оказалась попытка Guerin и Mitchell получить БОЕ при осаждении вирусных частиц из аэрозоля в импакторе Андерсена непосредственно на культуру клеток, содержащуюся в чашке Петри, или на поверхность агара, тонким слоем покрывающего эту культуру. Основной причиной неудачи здесь являлось неблагоприятное воздействие потока воздуха на жизнеспособность культуры тканевых клеток. Тем не менее мы сочли необходимым отразить в разбираемой схеме и этот вариант анализа, полагая, что указанная методическая трудность со временем будет преодолена.
Наиболее широкое распространение для выделения вирусов из воздуха получили жидкостные вирусоуловители, поскольку в этом случае с помощью улавливающей жидкости со стабилизирующими добавками можно создать условия, достаточные для сохранения жизнеспособности вирусов в процессе пробоотбора. Из числа хорошо известных уловителей в нашей стране с этой целью часто применяют сифонирующий прибор Речменского, а за рубежом — стеклянные импинжеры различной конструкции. Чтобы увеличить вероятность обнаружения вирусов в воздухе, Artenstein и соавт. предложили прибор с 180 мл сорбирующей жидкости для отбора проб из больших объемов воздуха (до 10 ООО л/мин). Для улавливания вирусов из воздуха применяли также мембранные фильтры, ватные, пено-желатиновые и другие фильтры. Во всех этих случаях получаемые жидкие пробы исследовали на наличие вирусов путем заражения лабораторных животных, куриных эмбрионов, культуры клеток или с помощью серологических реакций.
Предлагаемые схемы, таким образом, показывают, что в зависимости от способа отбора проб воздуха, применяемого для этого оборудования и выбранного варианта лабораторного анализа исследование воздушной микрофлоры может быть более или менее сложным. Исключительной простотой обоих этапов исследования (технического и биологического) отличаются седиментационный отбор проб (метод Коха), просасывание воздуха через мембранный фильтр с наложением его на агаровую среду для проращивания задержанных бактерий и ряд других методов. В иных случаях при простоте второго этапа метод исследования лимитируется сложностью конструкции и малодоступностью применяемого на первом этапе оборудования (импакторы Мея и Андерсена, щелевой прибор Лидуэлла, жидкостной уловитель Руденко, трехкамерный импинжер Мея и т. п.). Совершенно очевидно, что выбор метода исследования воздушной микрофлоры в каждом случае должен прежде всего исходить из задач эксперимента и наличия оборудования. Однако это должно сопровождаться стремлением к правильному отражению микробного пейзажа исследуемого воздуха и достоверному определению концентрации содержащихся в нем бактерий и вирусов. Одновременное определение фракционно-дисперсного состава аэрозольных бактерио- и вируссодержащих частиц будет способствовать более полной характеристике воздушной микрофлоры. Немаловажным при этом является сокращение до возможного минимума количества лабораторных операций при обработке проб, имеющее целью уменьшить или даже полностью исключить потери микроорганизмов в процессе анализа. С учетом этих аспектов предлагаемые схемы, отражающие различные варианты современного лабораторного анализа бактерий, бактериофагов и вирусов, уловленных из воздуха или искусственно созданного аэрозоля, могут, по нашему мнению, принести пользу в выборе эффективных методов и путей определения аэромпкрофлоры при санитарно-гигиенических и эпидемиологических исследованиях.
ЛИТЕРАТУРА. Богданов И. И., Каморский H. М. — «Гиг. и сан.», 1961, № 12, с. 81. — В л о д а в е ц В. В. Основы аэробиологии. М., 1972. — Гольдфарб Д. М. Бакбериофагия. М., 1961. — Д м и т р и е в а Р. А. — сЛабор. дело», 1966, № U.c. 679. —Жукова А. И. — «Микробиология», 1962, № 4, с. 745.— Карпухин Г. И. Бактериологическое исследование и обеззараживание воздуха. М., 1962. — Речменский С. С. Очерки экспериментальной аэромикробиологии. М., 1973. — Руденко H. М. — «Ж- микробиол.», 1970, № 9, с. 124. — Р у д е н -к о H. М., Евдокимов В. Л. — «Гиг. и сан.», 1975, № 7, с. 97. — Ярных В. С. Аэрозоли в ветеринарии. М., 1972. — A n d е г s е n А. А. — «J. Bact.», 1958, v. 76, p. 471, —Artenstein M. S., Miller W. S., R u s t J. H. et a. — «Am. J. Bact.», 1967, v. 85, p. 479. — С о г i e 1 1 L. L., McGarrity C. J. — «Appl. Microbiol.», 1968, v. 16, p. 1895. —Couch R., G e г o n e P. J., С a t e T. R. et a. — «Proc. Soc. Biol. (N. Y.)», 1965, v. 118, p. 818. —G e r о n e P., Со u с h R., К e e f e г G. et a.— «Bact. Rev.», 1966, v. 30, p. 576.—G u e r i n L. F., M i t с h e 1 1 Ch. A. — «Canad. J. comp. Med.», 1964, v. 28, p. 283. — J e n s e n M. M. — «Appl. Microbiol.», 1964, v. 12, p. 418. — L i d w e 1 1 O. M. — «J. Sei. Instruments», 1959, v. 36, p. 3. — May K. R. — Ibid., 1945, v. 22, p. 187. —Thomas G. — «J. Hyg. (Lond.)», 1970, v. 68, p. 273.—T horn ley W. R. — «Appl. Microbiol.», 1971, v. 21, p. 369. — W a s h a m C. J., В I a с k C. H., S a n d i n e W. E. et a. — Ibid., 1966, v. 14, p. 497.
Поступила 29/111 1976 г.
