CC BY
40
УДК 619:614.94613.155:619.616-97
Ключевые слова: способ, устройство, оценка, анализ, закрытое помещение, улавливатель микроорганизмов, бактерии, воздух, болезнь
Key words: method, apparatus, evaluation, analysis, enclosed space, harvesting apparatus for microorganisms, bacteria, air, disease
Дмитриев А. Ф., Ахмадиев Г. М.
РАЗРАБОТКА СПОСОБА И УСТРОЙСТВА ДЛЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ВОЗДУХА
THE DEVELOPMENT OF A METHOD AND APPARATUS FOR THE MICROBIOLOGICAL ANALYSIS OF AIR
'ФГБОУ ВПО «Ставропольский государственный аграрный университет» Адрес: 355017, Россия, г. Ставрополь, пер. Зоотехнический, 12
1Stavropol State Agrarian University. Address: 355017, Russia, Stavropol, Zootechnichesky per., 12 2ГАОУ ВПО «Набережночелнинский государственный торгово-технологический институт» Адрес: 423812, Россия, Республика Татарстан, г. Набережные Челны, Московский пр., 95 2Naberezhnochelninsky State Trade and Technology Institute of the Republic of Tatarstan Address: 423812, Russia, the Republic of Tatarstan, Naberezhnye Chelny, Moskovsky pr., 95
3Набережночелнинский институт Казанского федерального университета Адрес: 423812, Россия, Республика Татарстан, г. Набережные Челны, пр. Мира, д. 68/19 3Naberezhnochelninsky Institute of the Kazan Federal University Address: 423812, Russia, the Republic of Tatarstan, Naberezhnye Chelny, Mirapr., 68/19
Дмитриев Анатолий Федорович, д. б. н., проф.1, заслуж. деятель науки РФ, академик РАЕ. E-mail: [email protected]
Dmitriev Anatoly F., Doctor of Biological Sciences, Professor1, Honored Worker of Science of the Russian Federation, Academician of the Russian Academy of Natural History. E-mail: [email protected] Ахмадиев Габдулахат Маликович, д. в. н., проф.2, проф.3, член-корр. РАЕ. E-mail: [email protected] Akhmadiev Gabdulahat M., Doctor of Veterinary Medicine, Professor2, Professor3, Corresponding Member of the Russian Academy of Natural History. E-mail: [email protected]
Аннотация. Целью настоящей работы является научно-производственное испытание разработанного способа и устройства для микробиологического анализа воздуха. Способ и устройство для микробиологического анализа воздуха включают осаждение аэрозольных частиц и посев микроорганизмов на поверхность плотной питательной среды, последующее термостатирование проб и подсчет числа колоний, выросших на поверхности среды, причем осаждения аэрозольных частиц осуществляется в жидкость улавливателя микроорганизмов с последующей дезинтеграцией и регидратацией аэрозольных частиц, а посев суспензии микроорганизмов проводится на плотную питательную среду.
Summary. The purpose of this paper is R&D testing of the developed method and apparatus for the microbiological analysis of air. The method and apparatus for the microbiological analysis of air include the deposition of aerosol particles and inoculation of microorganisms on the surface of the solid medium and subsequent thermostating of samples and counting of the number of colonies grown on the surface of the medium. Yet aerosol particles depose in liquid of the harvesting apparatus for microorganisms with subsequent disintegration and rehydration of aerosol particles. Inoculation of the microorganism suspension is conducted on the solid medium.
Введение
Способ и устройство относятся к микробиологии, предназначены для индикации, количественной и качественной оценки популяций микроорганизмов и могут быть использованы для своевременного обнаружения возбудителей болезней в воздухе закрытых помещений, при изыскании лечебно-профилактических мер борьбы с бактериальными и вирусными респираторными болезнями.
Целью настоящей работы является научно-производственное испытание разработанного способа и устройства для микробиологического анализа воздуха.
Известно много устройств, в которых осаждение бактериального аэрозоля осуществляется на чашки Петри с питательной средой. Они основаны на использовании инерции быстродвижущихся частиц. В процессе взятия пробы воздуха осуществляется
посев микроорганизмов, которые в последующем культивируются, и через 24-48 часов подсчитывается количество выросших колоний (чашечный импактор Андерсена, аппарат Кротова) [4].
Известен способ микробиологического исследования воздуха путем пропускания его через импактор с твердой питательной средой, содержащей тест-культуру. По этому способу воздух пропускают через импактор перед внесением в питательную среду тест-культуры, последнюю пропускают через импактор в виде полудисперсного аэрозоля, концентрацию и состав антимикробных частиц определяют по числу зон отсутствия роста на твердой питательной среде (Авт. свидетельство № 639937 М. Кл3 С 12 1/00).
Наиболее близкими по технической сущности и достигаемому положительному эффекту и принятые автором за прототипы являются способы микробиологического анализа воздуха (Авт. свидетельства № 777061 М. Кл3 С 12 К 1/00; № 968071 М. Кл3 С 12 К 1/00), которые заключатся в том, что осуществляют осаждение микроорганизмов из воздуха на поверхность твердой питательной среды, термостатирование осажденных микроорганизмов в течение суток и подсчет выросших колоний микроорганизмов. Названные способы для микробиологического анализа воздуха имеют один общий недостаток, касающийся точности. Результаты анализа не отличаются особой точностью в связи с тем, что посев микроорганизмов на поверхность плотной питательной среды осуществляется в процессе взятия пробы воздуха. Определение концентрации клеток в образце, которое основывается на прямом подсчете колониеобразующих единиц, выросших на агаризованных средах, может быть ошибочным ввиду того, что не все жизнеспособные микробные клетки в принципе могут образовывать колонии на твердой питательной среде; отсутствие роста может также быть результатом их определенного физиологического и метаболического состояния [6]. При инкубировании не все бактериальные клетки, находящиеся на поверхности аэрозольных частиц, не контактируют полностью с питательной сре-
дой и остаются в «дремлющем» состоянии, не образуя колонии. У других образование видимых колоний не происходит в связи с тем, что количество питательного раствора, способного диффундировать в клетки, расположенные на поверхности аэрозольных частиц, ограничено, а их запасы в непосредственной близости быстро истощаются. В результате определенная часть микроорганизмов остается не учтенной, что и влияет на результат анализа. Необходимо также иметь в виду, что в воздухе могут быть некультиви-руемые микроорганизмы, которые не растут ни на каких питательных средах. Некульти-вируемые формы (НФ) в настоящее время описаны у многих микроорганизмов различной таксономической принадлежности [8].
Находясь в некультивируемой форме, бактерии остаются жизнеспособными и сохраняют свой адаптивный, метаболический и эпизоотический потенциал. При определенных условиях некультивируемые формы бактерий восстанавливают свою способность к активному росту и размножению. Состояние анабиоза возможно в результате обезвоживания организмов (ангидробиоза). Высушивание микроорганизмов до остаточной влажности 10 % приводит к замедлению и полному прекращению метаболизма с переходом в состояние анабиоза. При естественном ангидробиозе наблюдается глубокое и длительное торможение метаболизма, достаточно распространенное в природе явление. В процессе регидратации создаются благоприятные условия выхода микробной клетки из этого состояния. В результате структурной и функциональной перестройки клетки при ее переходе активизируются процессы роста и размножения, происходит повышение адаптивного и метаболического потенциала [3, 9]. Кроме того, воздушная среда представлена ассоциациями различных групп микроорганизмов, которые находятся в сложных взаимоотношениях, обусловленных конкурентным использованием пищевых продуктов и других факторов среды обитания. При выращивании смешанных культур процессы роста и размножения определяются составом питательной среды, концентрацией и доступностью химических составных
частей среды, потребляемых микроорганизмами различной таксономической принадлежности, температурой и реакцией среды, наличием в ней кислорода, влажностью. Не менее существенное значение может иметь наличие фагов, а также присутствие микроорганизмов, продуцирующих бактерицидные, токсические, литические, или анто-гонистические, вещества. В процессе культивирования в среде накапливаются продукты метаболизма, которые также влияют на процессы роста и размножения.
Материал и методы исследований
Существующие способы микробиологического анализа воздуха позволяют определять бактериальную флору и чаще всего выражаются колониеобразующими единицами (КОЕ в 1 л воздуха). Что касается вирусов и бактериофагов, которые могут находиться на аэрозольных частицах, то они не учитываются, поскольку требуют особых условий культивирования. Это касается также спор микроскопических грибов - продуцентов ферментных препаратов, дрожжевых грибов, L-форм и других физиологических групп микроорганизмов, для которых требуются специальные методические приемы и питательные среды.
Результаты исследований и обсуждение
Технический результат с помощью предлагаемого способа сводится к повышению точности микробиологического анализа воздуха и достигается тем, что взятие пробы воздуха осуществляется в улавливатель микроорганизмов [7] (см. рис. 1).
Улавливатель микроорганизмов содержит конусообразную емкость 1 с улавливающей жидкостью 2 и крышку 6, установленную в верхней части емкости, фильтр 4 и выполненное под острым углом к вертикальной оси емкости в ее средней части отверстие 7 малого диаметра для поступления воздуха через осевой завихритель 9 штуцера 8. При отборе пробы в улавливатель микроорганизмов поступает вихревой поток воздуха с большой скоростью, однако за счет понижения давления в конической емкости улавливателя, гидродинамической кавитации
Рис. 1. Улавливатель микроорганизмов.
и перемешивания происходит диспергирование аэрозолей в жидкости. После взятия пробы воздуха и кавитационной дезинтеграции аэрозольных частиц в емкости с улавливающей жидкостью осуществляют посев улавливающей жидкости с микроорганизмами на поверхность плотной питательной среды (преимущественно в мясо-пептонный агар (МПА), а после культивирования в течение 24-48 часов подсчитывают количество выросших колоний.
Желаемый технический и технологический результат достигается с помощью устройства и способа микробиологического анализа воздуха. Сущность предлагаемого способа микробиологического анализа воздуха заключается в следующем: осуществляют взятие пробы воздуха с помощью улавливателя микроорганизмов в улавливающую жидкость, в которой за счет гидродинамической кавитации происходит дезинтеграция аэрозольных частиц и осаждение их в улавливающую жидкость и далее посев улавливающей жидкости на поверхность плотной питательной среды, культивирование посевов в термостате в течение 24-48 часов при температуре 37,5 °С с последующим подсчетом видимых колоний микроорганизмов.
Повышение точности анализа достигается за счет гидродинамической кавитации и дезинтеграции аэрозольных частиц при взятии пробы воздуха. Аэрозольные конгломераты, в которых находятся микроорганизмы,
диспергируются на отдельные бактериальные или вирусные частицы. При осаждении аэрозольных частиц и последующем высеве улавливающей жидкости на плотную питательную среду формируются отдельные хорошо видимые колонии. Чтобы расти и размножаться, микроорганизмы должны получать из питательного субстрата все вещества, которые необходимы им для синтеза структурных компонентов клетки и для получения энергии. В результате высева улавливающей жидкости с плотной средой создается необходимый контакт клеточной стенки микроорганизмов с питательным субстратом, что индуцирует рост, начало клеточного деления, размножение и образование колоний.
Важным фактором, способствующим росту, размножению и образованию колоний микроорганизмов является плотность питательного субстрата. Плотность в данном случае следует понимать как свойство агара, определяющее ее прочность (упругость) и зависимость от концентрации. Известно, что при высокой прочности агара получается скудный рост микроорганизмов, некоторые из них не могут формировать видимых колоний. Среда с низкой прочностью студня, наоборот, способствует росту не характерных, расплывчатых колоний. Плотность питательного субстрата не только механически препятствует формированию различных колоний, но и влияет на процессы диффузии питательных веществ и продуктов обмена микроорганизмов.
Повышение концентрации агара увеличивает количество столкновений частиц при броуновском движении, что способствует и ускоряет застудневание, а скорость диффузии находится в обратной зависимости от концентрации студня. Чем выше концентрация, тем меньше скорость диффузии. Объясняется это тем, что в концентрированном геле резко возрастает извилистость пути, который должна совершать диффундирующая частица. Кроме того, диффузия в плотной питательной среде отличается от таковой в жидкой среде тем, что здесь отсутствует перемешивание и невозможно образование конвекционных потоков, возникающих в жидких питательных средах.
Так как рост колоний лимитируется скоростью диффузии продуктов обмена, посев улавливающей жидкости способствует улучшению процессов питания и удалению (диффузии) продуктов обмена в процессе роста, размножения и формирования колоний.
В результате сравнительного испытания различных способов микробиологического анализа воздуха было установлено (см. табл. 1), что степень его бактериальной обсемененности по предлагаемому способу выше, чем по известному.
Предлагаемое устройство и способ по сравнению с другими известными техническими решениями имеют следующие преимущества:
- взятие пробы воздуха и осаждение аэрозольных частиц осуществляется в жидкость улавливателя микроорганизмов, где происходит их регидратация;
- воздушная среда представлена различными фракционно-дисперсными аэрозольными частицами, а в процессе отбора проб воздуха происходит дезинтеграция частиц, которые нагружены микроорганизмами, непосредственно в улавливающей жидкости конической емкости улавливателя;
- посев улавливающей жидкости на плотную питательную среду обеспечивает более благоприятные условия для роста микроорганизмов, клеточного деления и формирования видимых колоний;
- обеспечивает рост микроорганизмов, находящихся в «дремлющем» состоянии;
- не требует дополнительных затрат и обучения персонала;
- позволяет осуществлять непрерывный мониторинг воздушной среды в условиях возможных техногенных, природных и террористических угроз и своевременно обеспечивать защиту животных и обслуживающий персонал на предприятиях по производству и переработке животноводческой продукции, в торговых центрах, центрах общественного питания и предприятиях биологической промышленности;
- в устройстве происходит отделение микроорганизмов от газовой фазы и используются различные механизмы улавливания микроорганизмов (седиментационные,
Таблица 1.
Сравнительная эффективность различных способов микробиологического анализа воздуха
№ опыта Устройства для отбора проб воздуха Кол-во проб воздуха Способ посева на плотную питательную среду
Количество микроорганизмов в 1 воздуха л
М±т М±т
1 Улавливатель микроорганизмов 10 После взятия проб посев улавливающей жидкости 251,5±7,3
2 Прибор Кротова 6 При отборе проб воздуха 180,1±5,4
3 Прибор Кротова 19 При отборе проб воздуха 194,2±5,7
4 Улавливатель микроорганизмов 15 После взятия проб посев улавливающей жидкости 239±8,4
сорбционные, фильтрационные), что позволяет в дальнейшем (после отбора пробы воздуха) использовать различные варианты микробиологического анализа биологического аэрозоля. Поскольку воздушная среда животноводческих и закрытых производственных помещений представлена с различными физиологическими группами микроорганизмов, возможно дифференцированное определение численности бактерий путем высева образцов смешанных культур не только на плотные, но и на жидкие селективные питательные среды. Применение селективных сред, предназначенных для роста клеток одной определенной таксономической группы, позволяет осуществлять культивирование и дифференциацию целевых видов бактерий.
Сравнительная эффективность различных способов микробиологического анализа воздуха и с использованием различных устройств, представлена в таблице 1.
Заключение
Способ и устройство для микробиологического анализа воздуха включают осаждение аэрозольных частиц и посев микроорганизмов на поверхность плотной питательной среды, последующее термостатирование проб и подсчет числа колоний, выросших на поверхности среды, причем осаждение аэрозольных частиц осуществляется в жидкость улавливателя микроорганизмов с последующей дезинтеграцией и регидратацией
аэрозольных частиц, а посев суспензии микроорганизмов проводится на плотную питательную среду.
Список литературы
1. А. с. СССР У 639937, кл. С 12 М 100, 1977. Устройство для микробиологического анализа воздуха / Ю. Л. Флеров, Е. Ф. Андреев, А. А. Сафиулин.
2. А.с. 777061 СССР. Способ микробиологического исследования воздуха и устройство для его осуществления / Ю. Л. Флеров, П. Е. Хрустов, А. А. Са-фиуллин и др. - Бюл. № 41 ; 1980. - 6 с.
3. Бекер, М. Е. Торможение жизнедеятельности клеток / М. Е.Бекер, А. И. Рапопорт, Л. В. Калакуцкий и др. ; gод общ. ред. М. Е. Бекера. - АН ЛатвССР, Ин-т микробиологии им. Августа Кирхенштейна. - Рига Зинатне, 1987. - 239 с.
4. Влодавец, В. В. Основы аэробиологии / В. В. Влодавец. - М. : Медицина, 1972. - 152 с.
5. Дмитриев, А. Ф. Устройство для концентрации микробиоты воздуха закрытых помещений / А. Ф. Дмитриев, В. Ю. Морозов // Научное приборостроение. - 2008. - Т. 18, № 2. - С. 98-103.
6. Заварзин, Г. А. Введение в природоведческую микробиологию / Г. А. Заварзин, Н. Н. Колотилова. -Москва, 2001. - С. 71-74.
7. Пат. № 72406 МПК А61М1/00. Улавливатель микроорганизмов / А. Ф. Дмитриев, В. Ю. Морозов ; заявка № 2007141943/22 от 12.11.2007; опубл. 20.04.2008, Бюл. № 11.
8. Романова, Ю. М. Есть ли сходство в механизмах образования «некультивируемых форм» у грамо-трицательных бактерий и спор у бацилл? / Романова Ю. М., Гинцбург А. Л. // Молекулярная генетика. -1993. - № 6. - С. 34-37.
9. Тимофеев, Н. Н. Гипобиоз и криобиоз. Настоящее, прошлое и будущее / Н. Н. Тимофеев. - М. : Ин-форм-Знание, 2005. - 256 с.
Ф
Архивы номеров журнала: щгш^ .шуеНэю .spb.ru/journal/vp_main.htm
