CC BY
0
Turczaninowia 26, 3: 126-136 (2023) DOI: 10.14258/turczaninowia.26.3.10 http://turczaninowia.asu.ru
ISSN 1560-7259 (print edition)
TURCZANINOWIA
ISSN 1560-7267 (online edition)
УДК 582.734.4+575.174.015.3
Универсальные ПЦР-праймеры для идентификации видов рода Sanguisorba и других представителей семейства Rosaceae
А. М. Колтунова1, М. Г. Куцев1' 2*, Р. А. Муртазалиев3
1 Алтайский государственный университет, пр. Ленина, д. 61, г. Барнаул, 656049, Россия. E-mail: koltunova.anas@yandex.ru; ORCID iD: https://orcid.org/0000-0002-3753-7958
2 Сибирский федеральный университет, пр. Свободный, д. 79, г. Красноярск, 660041, Россия. E-mail: m_kucev@mail.ru; ORCID iD: https://orcid.org/0000-0003-2284-6851
3 Прикаспийский институт биологических ресурсов Дагестанского ФИЦ РАН, ул. М. Гаджиева, д. 45, г. Махачкала, 367000, Россия. E-mail: murtazaliev.ra@yandex.ru; ORCID iD: https://orcid.org/0000-0002-2895-213X
* Автор для переписки
Ключевые слова: видоспецифичные праймеры, кровохлебка, пластидный геном, филогенетический анализ.
Аннотация. Разработано семь пар праймеров для амплификации некодирующих участков ДНК хлоро-пластов с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для выяснения универсальности праймеров мы использовали их для амплификации фрагментов ДНК различных видов растений семейства Rosaceae. Прай-меры являются пригодными для генотипирования видов рода Sanguisorba и некоторых видов семейства Rosaceae. С помощью данных праймеров возможно амплифицировать некодирующие полиморфные области хлоропластной ДНК, а значит, они могут быть использованы при выявлении межвидовых различий и в по-пуляционной генетике растений.
Universal PCR primers for identifying species of the genus Sanguisorba and other members of the family Rosaceae
A. M. Koltunova1, M. G. Kutsev1, 2, R. A. Murtazaliev3
1 Altai State University, Lenina Pr., 61, Barnaul, 656049, Russian Federation 2 Siberian Federal University, Svobodny Pr., 79, Krasnoyarsk, 660041, Russian Federation 3 Caspian Institute of Biological Resources, Dagestan FRC RAS, M. Gadzhieva St., 45, Makhachkala, 367000, Russian Federation
Keywords: plastid genome, phylogenic analysis, Sanguisorba, species-specific primers.
Summary. Seven primers for the amplification of non-coding regions of chloroplast DNA via the polymerase chain reaction (PCR) have been designed. In order to find out whether these primers were universal, we used them in an attempt to amplify DNA fragments from various plant species of Rosaceae. Primers worked for species of the genus Sanguisorba and some species of the family Rosaceae. The fact that they amplify chloroplast DNA non-coding regions over a wide taxonomic range means that these primers may be used to study the population biology and evolution of plants.
Поступило в редакцию 06.06.2023 Принято к публикации 16.10.2023
Submitted 06.06.2023 Accepted 16.10.2023
Введение
Семейство Rosaceae Juss. (розоцветные) в современной систематике включает около 100 родов и 3000 видов, распространенных по всем континентам (Potter et al., 2007). Многие виды являются хозяйственно-ценными, декоративными, лекарственными растениями. Несмотря на всестороннюю изученность данного семейства, главными признаками для решения систематических вопросов остаются число хромосом и тип плода. Но и эти признаки могут противоречить друг другу (Morgan, 1994). Виды, входящие в состав сем. Rosaceae, в зависимости от автора, делят на четыре (Schulze-Menz, 1964) и двенадцать (Takhtajan, 1997) подсемейств. Сложная таксономия и ограниченные морфологические характеристики этого семейства затрудняют определение видов некоторых родов.
Род Sanguisorba L., кровохлебка, (подтриба Sanguisorbinae Torr. et A. Gray, триба Sanguisor-beae DC., подсемейство Rosoideae Juss. ex Arn.) насчитывает около 30 видов, распространённых преимущественно в северных и средних широтах (Xiang-Xiao et al., 2018). На территории России род представлен 7 видами, большинство из которых обладают широким фитоценотическим спектром. Растения можно встретить в лесах, лугах, по берегам рек и озёр. Представители этого рода - многолетние корневищные травы с непарноперистыми листьями и головчатым соцветием (Li et al., 2003). Идентификация видов затруднена из-за морфологического сходства и симпатрического распространения Sanguisorba officinalis L. и его близких родственников (Inkyu et al., 2021). Этот вид традиционно используют в качестве вяжущего и кровоостанавливающего средства. Имеются исследования и других видов рода, которые проявляют разную фармакологическую активность, в том числе противовоспалительную (Su et al., 2018; Guo et al., 2019; Yasueda et al., 2020) и противораковую (Liu et al., 2016; Nam et al., 2017; Tan et al., 2019), участвуют в антипероксидации липидов (Zhang et al., 2012; Romojaro et al., 2013; Kim et al., 2018), проявляют антибактериальные (Su et al., 2019; Zhu et al., 2020), антидиабетические (Kuang et al., 2011; Son et al., 2015) и гепатопротекторные свойства(Meng et al., 2020) и эффективны против ожирения (Jung et al., 2016; Im et al., 2017; Ji et al., 2018). На сегодняшний день в растениях рода Sanguisorba идентифицировано более 270 химических компонентов, включая флавоноиды, три-
терпеноиды, стероиды, лигнаны, органические кислоты и т. д. (Zhao et al., 2017; Jang et al., 2018). Поэтому исследования данного рода являются перспективными не только в ботанических целях, но и для отечественной фармацевтики.
Близкородственный таксон Poterium L. изначально был признан отдельным родом (Linnaeus, 1753). Однако затем Sanguisorba и Poterium не раз объединялись многими авторами из-за схожести в строении цветка и плодов. Тем не менее, в настоящий момент современная систематика разделяет Sanguisorba и Poterium на два самостоятельных рода (Lee et al., 2011).
Хлоропластный геном представителей рода Sanguisorba имеет длину 100-150 т. п. н. и содержит большое количество эволюционной информации, которая может быть использована для выявления филогенетических отношений между видами или их идентификации (Hong et al., 2017; Freitas et al., 2018), а также в филогенетической эволюции и исследованиях, связанных с генной инженерией (Leister, Pesaresi, 2018; Mader et al., 2018). Несмотря на то, что технология высокопроизводительного секвенирования стала более доступной, молекулярно-генетических исследований представителей рода Sanguisorba всё ещё очень мало. Китайскими учёными (Xiang-Xiao, 2018) с помощью платформы Illumina HiSeq X была произведена сборка, аннотация и структурный анализ хлоропластного генома четырёх таксонов рода Sanguisorba (S. officinalis, S. filiformis (Hook. f.) Hand.-Mazz., S. stipulata Raf. и S. tenuifo-lia var. alba Trautv. et C. A. Mey.), другой группой учёных (Inkyu et al., 2021) - ещё двух видов (S. sitchensis C. A. Mey. и S. hakusanensis Makino).
Точное определение видов растений по морфологическим признакам не всегда возможно. Например, определение вида спорно, а в некоторых случаях невозможно, когда используются только отдельные органы растений (Casper, Jackson, 1997; Taggart et al., 2011). Методы молекулярной биологии, основанные на различиях в геноме растений между видами, являются одним из инструментов решения данной проблемы (Linder et al., 2000; Agarwal et al., 2008).
Молекулярные маркеры активно используют для решения экологических и эволюционных задач, для оценки инвазивных или исчезающих видов, в таксономических и филогенетических исследованиях (Valentini et al., 2009). Наиболее распространенный подход - ДНК-баркодинг, основанный на секвенировании стандартизованного участка ДНК для точной и быстрой иден-
тификации видов (Hebert et al., 2003). Однако этот подход является дорогостоящим, особенно при обработке большого количества образцов. Диагностическая ПЦР с использованием специфических праймеров предлагает более быстрый метод идентификации конкретных таксонов растений. Альтернативой является разработка праймеров для амплификации участков ДНК разной длины и дальнейшей детекции с помощью капиллярного или агарозного электрофореза (King et al., 2008; Wallinger et al., 2012).
Целью нашего исследования стала разработка универсальных праймеров для видовой идентификации представителей рода Sanguisorba, а также тестирование их на других родах из семейства розоцветные.
Материалы и методы
Материалом для исследования послужили 8 видов рода Sanguisorba: S. minor Scop., S. baicalen-sis Poplawska, S. tenuifolia, S. parviflora Takeda, S. canadensis L., S. officinalis, S. azovtsevii Pshenich. et Krasnob., S. alpina Bunge; 2 разновидности: S. officinalis var. polygama F. Nyl., S. officinalis var. glandulosa (Kom.) Worosch.; 2 вида рода Poteri-um L.: P. polygamum Waldst. et Kit., P. lasiocarpum Boiss. et Hausskn.; и некоторые виды из семейства розоцветные гербария ALTB (табл. 1).
Гербарные образцы, взятые для м
Выделение тотальной ДНК осуществлялось с помощью набора Diamond DNA Plant kit (ООО «Алтайбиотех», Россия) по протоколу производителя. Реакцию амплификации проводили с применением готовой ПЦР смеси БиоМастер HS-Taq ПЦР (Биолабмикс, Россия) в объёме 15 мкл и конечной концентрацией праймеров 400 нМ. Для анализа использовались прайме-ры, синтезированные ООО «Евроген» (Россия). Амплификация проводилась в термоциклере MyCycler по следующей программе: денатурация 95 °C - 60 с, отжиг праймеров 57 °C - 30 с, элонгация 72 °C - 30 с (всего 33 цикла). Разделение и визуализацию продуктов амплификации проводили с помощью капиллярного электрофореза с использованием автоматической станции QIAxcel Advenced (Qiagen, Германия) и набора реагентов QIAxcel DNA High Resolution Kit в соответствии с инструкцией производителя (программа электрофореза OL 800, время инжекции образца 10 с). На основе матрицы Евклидовых расстояний построена дендрограмма, а значение Fst рассчитывали посредством анализа главных координат в программе NTSYSpc (Rohlf, 2018). Для подсчёта статистических данных применялась программа PopGene версия 4.7 (Raymond, Rousset, 1995; Rousset, 2008).
Таблица 1
-генетического анализа
№ Вид Места сбора образцов
1 Agrimonia pilosa Ledeb. Россия, Алтайский край, Курьинский р-н, окр. с. Бугрышиха.
2 Cotoneaster melanocarpus G. Lodd. Россия, Алтайский край, Курьинский р-н.
3 Filipendula vulgaris Moench Россия, Алтайский край, Курьинский р-н, долина р. Белая в 3 км выше с. Бугрышиха, левый берег, пойма.
4 Fragaria viridis Weston Алтайский край, Ребрихинский р-н, трасса А321, между. пос. Подстепное и пос. Кадникова.
5 Geum urbanum L. Россия, Алтайский край, Курьинский р-н, долина р. Белая в 3 км выше с. Бугрышиха, левый берег, пойма.
6 Geum virale L. Россия, Алтайский край, Курьинский р-н, долина р. Белая в 3 км выше с. Бугрышиха, левый берег, пойма.
7 Potentilla argentea L. Алтайский край, Романовский р-н, вост. побережье оз. Горькое.
8 Potentilla canescens Besser Алтайский край, Ребрихинский р-н, трасса А321, между пос. Подстепное и пос. Кадникова.
9 Poterium lasiocarpum Boiss. et Hausskn. (Sanguisorba minor ssp. lasiocarpa (Boiss. et Hausskn.) Nordborg) Казахстан, Южно-Казахстанская область, село Бостандык, травянистый склон по берегу реки.
10 Poterium polygamum Waldst. et Kit. (10 образцов) Дагестан. Окр. г. Махачкала, гора Тарки-Тау, вост. склон с кустарником, 200 м над ур. м./
11 Rosa majalis Herrm. Алтайский край, Ребрихинский р-н, трасса А321, между. пос. Подстепное и пос. Кадникова.
Таблица 1 (продолжение)
12 Sanguisorba alpina Bunge (10 образцов) Россия, Республика Алтай, Семинский перевал.
13 Sanguisorba azovtsevii Pshenich. et Krasnob. (10 образцов) Россия, Республика Алтай, Семинский перевал.
14 Sanguisorba baicalensis Poplawska Россия, Забайкальская область, Баргузинск, у. Песчаныя дюны у берега Байкал, близ устьев р.Турки.
15 Sanguisorba canadensis L. Япония, Хоккайдо, Куширо-ши.
16 Sanguisorba minor Scop. Россия, Северное предгорье Алайского хребта, Кишпак Туран, по руслу Сая.
17 Sanguisorba officinalis L. (10 образцов) Россия, Республика Алтай, Семинский перевал.
18 Sanguisorba officinalis var. glandulosa (Kom.) Worosch. Монголия, г. Богдо-ула, дл. р. Урги, вершина горы
19 Sanguisorba officinalis var. polygama F. Nyl. Россия, Якутия, низовья р. Лены, окр. пос. Чай-Тумус.
20 Sanguisorba parviflora (Maxim.) Takeda КНР, провинция Хэйгунцзян, верхнее течение, близко с. Малуньчжань, березово-лиственно-сосновый лес с дубом.
21 Sanguisorba tenuifolia Fisch. var. alba Trautv. et Mey Япония, Хоккайдо, Куширо-ши.
22 Spiraea hypericifolia L. Россия, Алтайский край, Курьинский р-н, окр. с. Бугрышиха.
23 Spiraeae trilobata L. Россия, Алтайский край, Курьинский р-н, окр. с. Бугрышиха.
Для дизайна праймеров использовались полногеномные хлоропластные последовательности 3 видов: Sanguisorba officinalis, S. filiformis, S. stipulata (Xiang-Xiao et al., 2018). Выравнивание и анализ последовательностей производились в программе MEGA X (Kumar et al., 2018). Первоначально были выделены области деле-ций, потенциально пригодных для видовой идентификации. Прямые и обратные праймеры были сконструированы с использованием программного обеспечения Primer3 (Koressaar et al., 2018) и PrimerBlast (Ye et al., 2012). Выбирались локусы, которые не входят в область кодирующих участков генов. Всего было синтезировано 24 праймера, среди которых были отобраны 7 пар праймеров, дающих стабильно амплифици-рованные фрагменты путём постановки пробных амплификаций. Локализация амплифи-цированных областей и структура праймеров представлена на примере последовательности KI0M200901001889 Sanguisorba stipulata (Xiang-Xiao et al., 2018) (рис. 1-7).
Результаты и их обсуждение
Разработанные пары праймеров были протестированы на некоторых представителях семейства розоцветные (табл. 2). Наиболее информативными оказались участки, амплифи-цированные с парами праймеров Sang1 и Sang4, которые потенциально могут быть использова-
ны для ДНК-баркодинга родов семейства розоцветные, т. к. длины ампликонов отличаются на 5 и более нуклеотидных пар. Здесь следует заметить, что по результатам амплификации с некоторыми праймерами различаются и виды, следовательно, эти праймеры могут быть применимы и внутри родов. Однако остальные пары прай-меров не показали значительного полиморфизма длин ампликонов между родами и не могут быть применимы для видовой идентификации.
Далее все 7 пар праймеров были протестированы на 8 видах и двух разновидностях рода Sanguisorba (табл. 3). Получены результаты размеров аллелей по 7 праймерам 12 таксонов рода Sanguisorba. Наиболее консервативные регионы относятся к четырем парам праймеров Sangl, Sang2, Sang3 и Sang7. Они не подходят для идентификации видов рода Sanguisorba, т. к. колебание размеров длин амплифицированных участков находятся в пределах ошибки метода ± 3 пары нуклеотидов. В качестве праймеров для видовой идентификации возможно использование Sang5 и Sang6, которые стабильно показывали разные длины для всех 12 видов и могут быть использованы для уточнения видовой принадлежности образца. Пара праймеров Sang4 не показала результатов в отношении нескольких таксонов, таких как S. tenuifolia, S. officinalis var. glandulosa, S. canadensis. Возможно, у них отсутствует данный регион хлоропластной последовательности.
Таблица 2
Размер аллелей представителей семейства Rosaceae по 7 локусам, пар нуклеотидов
№ Вид Пара праймеров " —— Sang1 Sang2 Sang3 Sang4 Sang5 Sang6 Sang7
1 Agrimonia pilosa Ledeb. 190 224 179 849 354 468 233
2 Cotoneaster melanocarpus G. Lodd. 197 239 185 1039 366 453 231
3 Filipendula vulgaris Moench 195 212 150 777 350 481 230
4 Fragaria viridis Weston 180 323 183 560 345 477 221
5 Geum urbanum L. 186 212 153 261 354 478 235
6 Geum virale L. 198 212 153 256 354 480 235
7 Potentilla argentea L. 127 203 158 911 367 474 235
8 Potentilla canescens Besser 125 203 151 926 369 474 230
9 Rosa majalis Herrm. 191 238 183 708 340 477 231
10 Spiraea hypericifolia L. 207 212 154 567 354 480 231
11 Spireae trilobata L. 169 223 148 594 352 474 232
Таблица 3 Размер аллелей видов Sanguisorba по 7 локусам, пар нуклеотидов
№ ' ———Вид Пара праймеров " -—-—^^ Sang1 Sang2 Sang3 Sang4 Sang5 Sang6 Sang7
1 Sanguisorba officinalis var. polygama F. Nyl. 263 213 171 733 381 539 234
2 Sanguisorba minor Scop. 261 222 170 673 361 472 222
3 Sanguisorba baicalensis Poplawska 261 212 169 749 400 539 232
4 Sanguisorba tenuifolia Fisch. ex Link 263 211 169 - 378 526 232
5 Sanguisorba officinalis var. glandulosa (Kom.) Worosch. 265 211 169 - 384 534 232
6 Sanguisorba parviflora (Maxim.) Takeda 263 211 170 716 397 536 231
7 Sanguisorba canadensis L. 263 213 178 - 378 552 322
8 Sanguisorba azovtsevii Pshenich. et Krasnob. (10 образцов) 263 261 259 218 220 216 169 665 663 668 647 654 664 370 368 531 527 534 536 529 232 230 231
9 Sanguisorba officinalis L. (10 образцов) 253 264 211 213 169 171 714 717 730 744 728 723 397 394 392 525 538 542 522 230 232 229
10 Sanguisorba alpina Bunge (10 образцов) 262 261 264 216 218 168 170 646 635 638 662 368 371 523 526 531 534 228 232 230
11 Poterium lasiocarpum (Boiss. et Hausskn.) 261 221 169 643 359 475 223
12 Poterium polygamum Waldst. et Kit. (10 образцов) 282 275 279 280 222 220 224 169 171 629 620 627 621 616 625 399 358 356 477 474 472 469 222 231 224
| |ЮК |20 К |30 К 140 К 150 К 60 К |70 К |80 К 90 К |100 К л 1 К 1120 К |130К |140 К 155,326
- ||| 1М III 1 1 1 г в г в ■ гт: 1 в 1 ■ 1 1 II = = 1 1 I Ж 1 | ■ 1 1 ■ 1 1 1 I 1 1 Е - 1 • в 1 =111 ц II м л 1
¡Ь % МС_056805.1 ' ПпЛ: V фс> ^ йТб гт I ^ Тоо15 * ф Тгаскг Download У
К [110.200 1110,480 1110.600 |110,800 111 К 1111,200 1111.400 |111,600 |И1.800 |112 К 112.200 11
и 1±У А О О К
усП г«1М=
К 1110.200 1110,400 [110,600 1110.800 111 К 1111,200 1111,400 [111.600 1111,800 1112 К 1112.200 111
Рис. 1. Расположение амплифицированной области с использованием праймеров: Sang1F AGATCTCTTCCGATTTGAAAAA, Sang1R AGGGGGCGGTCGAATTT.
Рис. 2. Расположение амплифицированной области с использованием праймеров: Sang2F CGTCTTTGAGTACTCCGGCA, Sang2R TAGATCACTACCCGGCCCAT.
|Ю К |20 К |30 К |40 К Л 50 К [60 К |70 К ¡80 К |Э0 К 100 К [110 К |120 К |130 К |140 К 155,32€
■ ■II ■ В В2 1 1 1 в 1 шя = III III 1 1 3 : 1 ш в I в | 1 1 1 1------= ^к^н II: 1 1 ■ = в = = :__= 1 в 1= = !1в 1 =131 д 1 II = В ! 1 £ = 1| = 1 II 1 Мв 1 1111 1 1 1 1 1
МС_056805.11 НпсЗ: V фс£> О, йТе I X Тоо1э - 0 Тгаскэ Роипкэас! *■(£>?■'
|43,5Э0 |44 К 144,500 145 К |45.500 |4В К |46,500 ¡47 К ]47.500 |48 К
-1 [±и юо» ^гЭ-ббА гр54 *ггТ-0би
|43,500 |44 К 144,500 |45 К |45,500 |46 К 146,508 . . |47 К ¡47.500 |48 К
Рис. 3. Расположение амплифицированной области с использованием праймеров: Sang3F CCTTGCTACAGCTGATAAAAATCGT, Sang3R GGCCGTGATCTGTCATTACG.
Рис. 4. Расположение амплифицированной области с использованием праймеров: Sang4F ACAAATGCGAT-GCTCTAACCT, Sang4R TGACCTGGATTGCACTTTTCTC.
Рис. 5. Расположение амплифицированной области с использованием праймеров: Sang5F CCCTTCGAAACCGTACATGC, Sang5R ATCGGGCGGATCTTTACTCG.
|Ю К 120 К |30 К 140 К ISO К |60К |7с1 К |Э0К 1100 К (110 К 1120 К ИЗО К |140 К 155,325
п »____ III Ш 1 п ■ ■ ■ —
■ ■ 1 = ■ 1 К = 1 1 1 1 1 ■ 1 1 1 i и В | | II 1 1 i ■ 111 : = = = 1 =г= 1 = i = я i та я = Г Í = ■ тш — = 111 0
1 i : = В 1 1 II =1 i i i 1 = i
NC 056805.1 » Find: ¡- <="=>10. <21, Hit?? I ^ Tools *■ 0 Tracks - *ь Download у1 *
... 1^2. 00 172,200 172.300 172,400 172,600 |7г.бвд 172,700 72,800 172.900 рз к 173,1 00 173,200
Genes uu Liü 1 О О X
-<---*-1--
cIpP
Í72' 00 |72,200 172,300 172,400 72,590 172,700 72,800 |72,900 |73 К |73,1 00 173,200
Рис. 6. Расположение амплифицированной области с использованием праймеров: Sang6F CTCCGAGTAAAGATCCGCCC, Sang6R GGCATACGGTATTTCCCCGT.
рок |20К |3 К 40K ¡50 К |60K |70 К 80 К |30K jlOOK 110 К 120 К 1130 К Э с К 155,325
S3 I = — = i = ■ ■ 1 1 1 1 B3 IIIS EX Sil 11 1 1 1 1 К I ■ I 1 а lili 1 1 —
1 I- 1 = = S s = I 1 1 1 1 i = I ■ i = в 1 I ■ 1 а I ■ 1 II 1 Ms 1 1 0
^ NC_0568Q5.1 - Find: _Qj_ ¿Mj Tools - 0 Tracks - Download» t^3 : "
S00 [139 К 1139,200 j 139,400 [139,66 0 1139,800 140 К ¡140,200 [140,400 40,600 j 140,800 [141 К |14i,200 |141,400 |141,600 [141,800 [142 К [142,2
Genes ü¡ 1-1 ; i л. О 0 х
YP_010134824.1 H
trnU SñC
Ж"« tRNñ-Uai
800 |139 К 1139,200 j 139.400 |139,6í 0 1139,800 |140 К 140,200 |140,400 1 40.600 1140.800 |14l К [141,268 1141,400 |141.600 |141,800 |142 К 1142,2
Рис. 7. Расположение амплифицированной области с использованием праймеров: Sang7F GCCAACAGTTCATCACGGAA, Sang7R CTTTCGTGCTTTGGTGGGTC.
Кроме того, праймеры протестированы на популяциях трёх видов Sanguisorba (S. azovtsevii, S. alpina и S. officinalis) и одной популяции Poterium polygamum по 10 образцов в каждой для выявления внутривидового полиморфизма. Длины амплифицированных фрагментов указаны в таблице 3. На основе полученных длин ампликонов методом объединения соседних пар или ближайшего связывания Neighbor-Joining (NJ) была построена дендрограмма с использо-
ванием коэффициента DIST - среднее таксономическое расстояние (рис. 8). Вид Agrimonia pilosa Ledeb. выбран в качестве внешней группы.
Согласно дендрограмме, Poterium и Sanguisorba филогенетически разошлись давно и развивались самостоятельно. Вид S. minor стабильно уходит в кладу Poterium, возможно, его стоит рассматривать в системе рода Poterium. S. minor морфологически схож с видами рода Po-terium округлыми листочками с зубчатыми кра-
ями и формой соцветия. Цветки собраны в головчатые соцветия шаровидно-овальной формы с длинными цветоносами, чашелистики окрашены в красновато-коричневатый цвет.
Следует отметить и расположение вида S. canadensis на дендрограмме, чей ареал распространения захватывает области Северной Америки, Японии и Китая.
В одну кладу объединяются виды S. baicalensis (является синонимом вида S. officinalis (Govaerts, 2021)) и S. parviflora, которые сильно отличаются по морфологическим признакам (цвет и длина соцветия), однако по генетическим данным являются близкими видами, так что здесь нельзя исключать гибридизационные процессы.
Рис. 8. Консенсусная дендрограмма NJ, построенная по 7 локусам с помощью программы NTSYSpc.
Рис. 9. Кластеризация 4 популяций на основе анализа двумерной матрицы признаков с помощью программы NTSYSpc.
Виды S. officinalis, S. alpina и S. azovtsevii были собраны на территории Семинского перевала, где были выявлены процессы гибридизации и описан новый эндемичный вид (Pschenichnaja, Krasnoborov, 1986). Ранее на основании RAF-анализа было высказано предположение касательно гибридогенного происхождения вида S. azovtsevii и представлен анализ родительских видов с Семинского перевала (Kutsev et al., 2013). Однако в данном исследовании не указывалось, какой именно вид является материнским. Поэтому вместе с построением филогенетического дерева была проведена оценка относительных эволюционных расстояний между представителями 4 видов.
Методом главных компонент в программе NTSYSpc на основе анализа двумерной матрицы признаков выявлена кластеризация 4 видов Sanguisorba (Smouse, 1986), при этом все образцы S. officinalis образуют общую группу, а S. alpina и S. azovtsevii - отдельный кластер, что указывает на наследование хлоропластной ДНК (рис. 9). На филогенетическом дереве S. azovtsevii и S. alpina относятся к общей кладе, что также подтверждает их генетическое родство.
Максимальные показатели внутрипопуляци-онного генетического разнообразия отмечены для популяции Poterium (P = 85,50 %; He = 0,3522; Ho = 0,5589), S. azovtsevii (P = 87,50 %; He = 0,4625; Ho = 0,5399), S. officinalis (P = 86,88 %; He = 0,3663; Hoo = 0,5408), S. alpina (P = 86,30 %; He = 0,4522; Ho = 0,5376). Многолокусная оценка эффективности числа мигрантов (NM) составляет 0,424 при N = 10; 0,255 при N = 25; 0,190 при N = 50 (Slatkin, 1985). Согласно D. L. Hartl и A. G. Clark (2007), значения Fst менее 0,05 свидетельствуют о незначительной, 0,05-0,15 - об умеренной,
0,15-0,25 - о значительной генетической дифференциации. В данном исследовании среднее значение показателей находилось в диапазоне Fst = 0,1392. Таким образом, результаты анализа показали невысокий уровень внутрипопуляци-онного полиморфизма.
Заключение
Таким образом, разработаны новые прайме-ры, которые эффективны для идентификации родов из семейства Rosaceae, в особенности пары праймеров Sang1 и Sang4. Кроме того, полученные праймеры наиболее эффективны для ДНК-идентификации видов из рода Sanguisorba и применимы для изучения их популяционных характеристик.
С помощью полиморфизма длин амплифи-цированных фрагментов построена дендро-грамма, отображающая филогенетические связи между видами рода Sanguisorba на территории Евразийского континента. Найдены новые доказательства гибридогенного происхождения вида S. azovtsevii. Представлен анализ генетической идентичности и генетических дистанций между видами, который выявил наследование хпДНК S. azovtsevii по материнской линии от S. alpina.
Благодарности
Исследование выполнено в рамках реализации Программы развития университета на 2021-2030 гг. в рамках реализации программы стратегического академического лидерства «Приоритет 2030», проект «Изучение биохимических, морфологических и молекулярно-гене-тических аспектов рода Sanguisorba на территории России».
REFERENCES / ЛИТЕРАТУРА
Agarwal M., Shrivastava N., Padh H. 2008. Advances in molecular marker techniques and their applications in plant sciences. Plant Cell Rep. 27: 617-631.
Casper B., Jackson R. 1997. Plant competition underground. Annual Review of Ecology and Systematics 28: 545570.
Freitas A., da Anunciacao R., D' Oliveira-Matielo C., Stefenon V. 2018. Chloroplast DNA: A promising source of information for plant phylogeny and traceability. J. Mol. Biol. Methods 1, 1. DOI: 10.1007/978-1-4615-3276-7
Govaerts R., Nic Lughadha E., Black N., Turner R., Paton A. 2021. The world checklist of vascular plants, a continuously updated resource for exploring global plant diversity. Scientific Data 8: 215. DOI: 10.1038/s41597-021-00997-6
Guo D., Chen J., Tan L., Jin M., Ju F., Cao Z. 2019. Terpene glycosides from Sanguisorba officinalis and their antiinflammatory effects. Molecules 24: 2906. DOI: 10.3390/molecules24162906
Hartl D., Clark A. 2007. Principles of population genetics. Sinauer Associates: 37-63.
Hebert P., Cywinska A., Ball S., Waard J. 2003. Biological identifications through DNA barcodes. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences 270: 313-321.
Hong S., Cheon K., Yoo K., Lee H., Cho K., Suh J., Kim S., Nam, J., Sohn H., Kim Y. 2017. Complete chloroplast genome sequences and comparative analysis of Chenopodium quinoa and C. album. Front. Plant Sci. 8: 1696.
Im S., Wang Z., Lim S., Lee O., Kang I. 2017. Bioactivity-guided isolation and identification of anti-adipogenic compounds from Sanguisorba officinalis. Pharm. Biol. 55: 2057-2064. DOI: 10.1080/13880209.2017.1357736
Inkyu P., Junho S., Sungyu Y., Goya C., Byeongcheol M. 2021. A comprehensive study of the genus Sanguisorba (Rosaceae) based on the floral micromorphology, palynology, and plastome analysis. Genes 12: 1764. DOI: 10.3390/ genes12111764
JangE., Kim S., Lee N., Kim H., Chae S., Han C. 2018. Sanguisorba officinalis extract, ziyuglycoside I and II exhibit antiviral effects against hepatitis B virus. Eur. J. Integr. Med. 20: 165-172. DOI: 10.1016/j.eujim.2018.05.009
Ji H., Ahn K., Cho H., Kim H., Kim Y., Kim O. 2018. Sanguisorba officinalis L. extracts activate wnt/ß-catenin pathway, and subsequently control adipo-osteogenic differentiation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 504: 352-358. DOI: 10.1016/j.bbrc.2018.08.196
Jung D., Lee O., Kang I. 2016. Sanguisorba officinalis L. extracts exert antiobesity effects in 3t3-l1 adipocytes and c57bl/6j mice fed high-fat diets. J. Med. Food 19: 768-779. DOI: 10.1089/jmf.2016.3704
Kim H., Jang E., Kim S., Choi, J., Lee N., Kim D. 2018. Preclinical evaluation of in vitro and in vivo antiviral activities of kct-01, a new herbal formula against hepatitis b virus. evidence-based complement. Altern. Med. 2018: 1-9. DOI: 10.1155/2018/10735092018
KingR., Read D., TraugottM., Symondson W. 2008. Molecular analysis of predation: a review of best practice for DNA-based approaches. Molecular Ecology 17: 947-963.
Koressaar T., Lepamets M., Kaplinski L., Raime K., Andreson R., Remm M. 2018. Primer3_masker: integrating masking of template sequence with primer design software. Bioinformatics 34: 1937-1938.
KuangH., Li H., Wang Q., YangB., WangZ., Xia Y. 2011. Triterpenoids from the roots of Sanguisorba tenuifolia var. alba. Molecules 16: 4642-4651. DOI: 10.3390/molecules16064642
Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C., Tamura K. 2018. MEGA X: Molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms. Mol. Biol. Evol. 35(6): 1547-1549.
Kutsev M., Sinitsyna T., Kondo K. 2013. Genetic diversity between three species of Sanguisorba L. from West Siberia based on Randomly Amplified DNA Fingerprints. Turczaninowia 16, 2: 134-136. [In Russian] (Куцев М. Г., Синицына Т. А., Кондо К. Генетические различия между тремя видами Sanguisorba L. из Западной Сибири на основе на основе метода случайно амплифицированных фрагментов ДНК (RAF) // Turczaninowia, 2013. Т. 16, № 2. С. 134-137).
Lee S., Heo Ki., Cho J., Lee C., Chen W., Kim S. 2011. New insights into pollen morphology and its implications in the phylogeny of Sanguisorba L. (Rosaceae; Sanguisorbeae). Plant Syst. Evol. 291: 227-242. DOI: 10.1007/s00606-010-0384-0.
Leister D., Pesaresi P. 2018. The genomic era of chloroplast research. Ann. Plant Rev. 13: 1-29. DOI: 10.1002/9781119312994.apr0121
Lenzi A., Orlandini A., Bulgari R., Ferrante A., Bruschi P. 2019. Antioxidant and mineral composition of three wild leafy species: a comparison between microgreens and baby greens. Foods 8: 487. DOI: 10.3390/foods8100487
Li C., Ikeda H., Ohba H. 2003. Sanguisorba L. In: Z. Y. Wu, P. H. Rawen, D. Y. Hong (eds.). Flora of China. Vol. 9. Beijing: Science Press; St. Louis: Missouri Botanical Garden Press. Pp. 384-387.
Linder C., Moore L., Jackson R. 2000. A universal molecular method for identifying underground plant parts to species. Molecular Ecology 9: 1549-1559.
Linnaeus C. 1753. Species plantarum. Tomus 1: 116.
Liu M., Liao M., Dai C., Chen J., Yang C. 2016. Sanguisorba officinalis L. synergistically enhanced 5-fluorouracil cytotoxicity in colorectal cancer cells by promoting a reactive oxygen species-mediated, mitochondria-caspase-depen-dent apoptotic pathway. Sci. Rep. 6: 34245. DOI: 10.1038/srep34245
Mader M., Pakull B., Blanc-Jolivet C., Paulini-Drewes M., Bouda Z., Degen B., Small I., Kersten B. 2018. Complete chloroplast genome sequences of four meliaceae species and comparative analyses. Int. J. Mol. Sci. 19: 701.
MengX., Tang G., Liu P., Zhao C., Liu Q., Li H. 2020. Antioxidant activity and hepatoprotective effect of 10 medicinal herbs on ccl4-induced liver injury in mice. World J. Gastroenterol. 26: 5629-5645. DOI: 10.3748/wjg.v26.i37.5629 Morgan D., Soltis D., Robertson K. 1994. Systematic and evolutionary implications of rbcL sequence variation in Rosaceae. Am. J. Bot. 81: 890-903.
Nam S., Lkhagvasuren K., Seo H., Kim J. 2017. Antiangiogenic effects of ziyuglycoside ii a major active compound of Sanguisorba officinalis L. Phytother Res. 31: 1449-1456. DOI: 10.1002/ptr.5874
Potter D., Eriksson T., Evans R., Oh S., Smedmark J., Morgan D., KerrM., Robertson K., ArsenaultM., Dickinson T., Campbell C. 2007. Phylogeny and classification of Rosaceae. Plant Syst. Evol. 266: 5-43. DOI: 10.1007/s00606-007-0539-9
Pschenichnaja I. N., Krasnoborov I. M. 1986. A new species of the genus Sanguisorba (Rosaceae) from Semins-kiy pass (Altai). Izv. Sibir. otdel. Akad. nauk. Ser. Biol. Nauk 18: 3-5. [In Russian] (Пшеничная И. Н., Красноборов
И. М. Новый вид рода Sanguisorba (Rosaceae) с Семинского перевала (Алтай) // Изв. Сиб. отдел. Акад. наук. Сер. Биол. наук, 1986. № 18. С. 3-5).
RaymondM., Rousset F. 1995. GENEPOP (version 1.2): population genetics software for exact tests and ecumeni-cism. J. Heredity 86: 248-249.
Rohlf F. 2018. NTSYSpc: Numerical Taxonomy System, ver. 2.21r. Applied Biostatistics: 16-39. Romojaro A., Botella M., Obon C., Pretel M. 2013. Nutritional and antioxidant properties of wild edible plants and their use as potential ingredients in the modern diet. Int. J. Food Sci. Nutr. 64: 944-952. DOI: 10.3109/09637486.2013.821695
Rousset F. 2008. Genepop'007: a complete reimplementation of the Genepop software for Windows and Linux. Mol. Ecol. Resources 8: 103-106. DOI: 10.1111/j.1471-8286.2007.01931.x
Schulze-Menz G. 1964. Rosaceae. In: H. Melchior (ed.). Engler's Syllabus der Pflanzenfamilien II. 12th ed. Berlin: Gebrüder Borntraeger. Pp. 209-218.
Slatkin M. 1987. Gene flow and the geographic structure of natural populations. Science 236: 787-792. DOI: 10.1126/science.3576198
Smouse P., Long G., Sokal R. 1986. Multiple regression and correlation extensions of the mantel test of matrix correspondence. Syst. Zool. 35: 627-632.
Son D., Hwang S., Kim M., Park U., Kim B. 2015. Anti-diabetic and hepato-renal protective effects of ziyuglycoside II methyl ester in type 2 diabetic mice. Nutrients 7: 5469-5483. DOI: 10.3390/nu7075232
Su X., Ali I., Arooj M., Koh Y., Yang S., Kim Y. 2018. Chemical constituents from Sanguisorba officinalis L. and their inhibitory effects on lps-stimulated pro-inflammatory cytokine production in bone marrow-derived dendritic cells. Arch. Pharm. Res. 41: 497-505. DOI: 10.1007/s12272-018-1035-1
Su X., Guo R., Yang S., Kim Y., Kim Y. 2019. Anti-bacterial effects of components from Sanguisorba officinalis L. on vibrio vulnificus and their soluble epoxide hydrolase inhibitory activity. Nat. Prod. Res. 33: 3445-3449. DOI: 10.1080/14786419.2018.1478825
Taggart J., Cahill J., McNickle G., Hall J. 2011. Molecular identification of roots from a grassland community using size differences in fluorescently labelled PCR amplicons of three cpDNA regions. Molecular Ecology Resources 11: 185-195.
Takhtajan A. 1997. Diversity and classification flowering plants. New York: Columbia University Press. 643 pp. Tan Y., Shudo T., Yoshida T., Sugiyama Y., Si J., Tsukano C. 2019. Ellagic acid, extracted from Sanguisorba officinalis, induces G1 arrest by modulating PTEN activity in B16F10 melanoma cells. Genes Cells 24: 688-704. DOI: 10.1111/gtc.12719
Valentini A., Pompanon F., Taberlet P. 2009. DNA barcoding for ecologists. Trends in Ecology et Evolution 24: 110-117.
Wallinger C., Juen A., Staudacher K., Schallhart N., Mitterrutzner E., Steiner E. 2012. Rapid plant identification using species and group-specific primers targeting chloroplast DNA. PLoS ONE 7: e29473. DOI: 10.1371/journal. pone.0029473
Xiang-Xiao M., Yan-FangX., Li X., Dong Z., Yu-Hua S., Ming-Li W., Gang-Qiang D., Siu-Po I., Zhi-Xiu L., Lan
W., Wei S. 2018. Complete chloroplast genomes from Sanguisorba: Identity and variation among four species. Molecules 23: 2137. DOI: 10.3390/molecules23092137
Yasueda A., Kayama H., Murohashi M., Nishimura J., Wakame K., Komatsu K. 2020. Sanguisorba officinalis L. derived from herbal medicine prevents intestinal inflammation by inducing autophagy in macrophages. Sci. Rep. 10: 9972. DOI: 10.1038/s41598-020-65306-4
Ye J., Coulouris G., Zaretskaya I., Cutcutache I., Rozen S., Madden T. 2012. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics 13: 134.
Zhang L., Koyyalamudi S., Jeong S., Reddy N., Smith P., Ananthan R. 2012. Antioxidant and immunomodulatory activities of polysaccharides from the roots of Sanguisorba officinalis. Int. J. Biol. Macromol. 51: 1057-1062. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2012.08.019
Zhao Z., He X., Zhang Q., Wei X., Huang L., Fang J. 2017. Traditional uses, chemical constituents and biological activities of plants from the genus Sanguisorba L. Am. J. Chin. Med. 45: 199-224. DOI: 10.1142/S0192415X17500136
Zhu L., Chen L., Bai C., Wu A., Liang S., Huang F. 2020. A rapid and sensitive UHPLC-MS/MS method for the determination of ziyuglycoside I and its application in a preliminary pharmacokinetic study in healthy and leukopenic rats. Biomed. Pharmacother. 123: 109. DOI: 10.1016/j.biopha.2019.109756
