CC BY
0
Turczaninowia 26, 4: 78-87 (2023) DOI: 10.14258/turczaninowia.26.4.13 http://turczaninowia.asu.ru
ISSN 1560-7259 (print edition)
TURCZANINOWIA
ISSN 1560-7267 (online edition)
УДК 575.174:581.3
Исследование изменчивости хлоропластной ДНК некоторых видов Astragalus секции Helmia и Astragalus arcanus секции Erioceras (Fabaceae)
М. С. Князев1' 3*, Е. Г. Филиппов1' 4, О. Е. Черепанова1' 5, Д. А. Кривенко2' 6*
1 Ботанический сад УрО РАН, ул. 8 Марта, д. 202а, г. Екатеринбург, 620144, Россия 2 Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, ул. Лермонтова, д. 132, г. Иркутск, 664033, Россия 3 E-mail: knyasev_botgard@mail.ru; ORCID iD: https://orcid.org/0000-0002-3868-8010
4 E-mail: filorch@mail.ru; ORCID iD: https://orcid.org/0000-0001-5447-674X 5 E-mail: botgarden.olga@gmail.com; ORCID iD: https://orcid.org/0000-0001-7775-6488 6E-mail: krivenko.irk@gmail.com; ORCID iD: https://orcid.org/0000-0003-2658-1723 * Авторы для переписки
Ключевые слова: астрагал, интрон trnL, регион trnF-trnV хпДНК.
Аннотация. Анализ последовательностей хлоропластной ДНК выявил высокий полиморфизм длины и нуклеотидного состава регионов trnF-trnV и интрона trnL для видов секций Helmia рода Astragalus (Fabaceae). Молекулярно-генетические исследования видов Astragalus секции Helmia ранее практически не проводились; секвенирование регионов trnF-trnV и интрона trnL хпДНК для 7 видов секции, а также вероятного межсекционного гибрида Astragalus arcanus, проведено впервые. На основании проведённых генетических исследований уточнены таксономические отношения между видами секции Helmia; обсуждены возможные этапы эволюции секции. Доказана самостоятельность Astragalus permiensis - для него предполагается не уральское, а сибирское или центрально-азиатское происхождение. Подтверждена принадлежность A. ionae к секции Helmia. Сделано предположение, что A. depauperatus s. l. представляет комплекс видов-двойников. Один из них в этой статье рассматривается в статусе вида A. chakassiensis.
Investigation of the variability of chloroplast DNA of some Astragalus spp. of sect. Helmia and A. arcanus of sect. Erioceras (Fabaceae)
M. S. Knyazev1, E. G. Philippov1, O. E. Cherepanova1, D. A. Krivenko2
1 Institute Botanic Garden UB RAS, 8 Marta St., 202a, Yekaterinburg, 620144, Russian Federation 2 Siberian Institute of Plant Physiology & Biochemistry SB RAS, Lermontov St., 132, Irkutsk, 664033, Russian Federation
Keywords: cpDNA, intron trnL, Milkwetch, trnF-trnV.
Summary. Analysis of chloroplast DNA sequences revealed a high polymorphism of the length and nucleotide composition of trnF-trnV and the intron trnL for Helmia section species of the genus Astragalus (Fabaceae). Molecular genetic studies of Astragalus species of the Helmia section were previously practically not carried out; sequencing of trnF-trnV and the intron trnL of chloroplast DNA for 7 species of the section, as well as the probable intersection hybrid Astragalus arcanus held for the first time. On the basis of genetic studies, clarified the relationship between species included in the section Helmia. The possible stages of sect. Helmia evolution are discussed. The taxonomic isolation of Astragalus permiensis has been confirmed; it is assumed not to be of Uralic, but of Siberian or Central Asian origin. Astragalus ionae belongs to the section Helmia is confirmed. Astragalus depauperatus s. l. is thought to be a complex of twin species. In this article, one of them is considered in the status of the species A. chakassiensis.
Поступило в редакцию 01.03.2023 Принято к публикации 15.12.2023
Submitted 01.03.2023 Accepted 15.12.2023
Введение
Таксономический объём секции Helmia Bunge рода Astragalus L. является дискуссионным. Н. Ф. Гончаров и М. Г. Попов (Goncharov, Popov, 1946) приводят для флоры бывшего СССР только четыре вида, без данных о распространении за его пределами. D. Podlech и Sh. Zarre (2013) указывают, что секция насчитывает 25 видов, в том числе 14 видов встречаются в границах бывшего СССР и 11 - в Монголии и Китае; М. С. Князев (Knyazev, 2019) считает, что секция Helmia насчитывает девять видов и подвидов, распространённых только в Монголии и на территории бывшего СССР. Одним из частных дискуссионных моментов является таксономическое положение A. ionae Palib. ex Gontsch. et Popov в системе рода. Этот вид был описан в составе секции Dissitiflori DC. (= Xiphidium Bunge) (Goncharov, Popov, 1946), М. Г. Попов (Popov, 1949) предполагал, что A. ionae может быть межсекционным гибридом A. depauperatus Ledeb. (sect. Helmia) x A. angarensis Turcz. ex Bunge s. l. (sect. Dissitiflori). Однако D. Podlech & Sh. Zarre (2013) и М. С. Князев (Knyazev, 2019) относят этот вид к секции Helmia на основании значительного морфологического сходства с некоторыми типичными её представителями. Виды этой секции достаточно сложны для определения, отличаясь «мелкими» морфологическими признаками, что вызывает вполне понятные сомнения: имеем ли дело с самостоятельными видами или лишь с разновидностями. Очевидно, что классическая систематика, в данном случае, исчерпала возможности тонкой идентификации, что определило актуальность обращения к молекулярно-генетиче-ским исследованиям. Поэтому были проведены стандартные молекулярно-генетические исследования для проверки таксономического статуса видов Astragalus секции Helmia.
Изучение хлоропластного генома является одним из перспективных направлений современной геносистематики растений. В хлоро-пластной ДНК (хпДНК) содержится порядка 120 генов, среди которых около 30 генов тРНК, гены pPHK (4.5S, 5S, 16S и 23S) и более 80 генов белков (Shneer, 1991). Несмотря на то, что, в целом, пластом консервативен по размеру и составу генов, благодаря наличию ряда лабильных локу-сов, испытывающих повышенное мутационное воздействие (Shaw et al., 2007), он изменяется быстрее ядерного и митохондриального геномов, что может быть использовано при изучении микроэволюционных событий: видообразования,
гибридизации, в том числе, интрогрессивного взаимодействия и др. (Taberlet et al., 1991, 2007; Kress et al., 2005; Shaw et al., 2005, 2007; Kress, Erickson, 2007).
На первом этапе, для выявления регионов хпДНК с выраженной видоспецифичной изменчивостью у изученных видов, был проведён ре-стриктный анализ, результаты которого опубликованы ранее (Knyazev, Philippov, 2019). Были подобраны подходящие рестриктазы и прайме-ры, которые позволили установить изменчивые участки хпДНК, а также детектировать их видовую принадлежность. Наиболее чёткая внутривидовая изменчивость выявлена для двух участков хпДНК - межгенного спейсера trnF-trnV/Hinfl и интрона trnL/Hinfl. Кроме того, для региона psbA-trnH/Hinfl отмечено отличие между A. helmii Fisch. ex DC. и остальными таксонами секции. По другим изученным системам выявлена слабая внутривидовая изменчивость. Рестриктный анализ позволил выбрать для дальнейших молекулярно-генетических исследований Astragalus секции Helmia изменчивые регионы trnF-trnV и интрон trnL.
В данном сообщении представлены результаты, полученные при секвенировании региона trnF-trnV и интрона trnL хпДНК модельных видов Astragalus секции Helmia и вероятного межсекционного гибрида A. arcanus Knjaz., Krivenko et E. G. Philippov секции Erioceras Bunge.
Материал и методы
Большинство изученных видов относятся к секции Helmia. Это стелющиеся, иногда (почти) подушковидные полукустарнички, с укороченными годичными побегами (полурозетками); цветки, белые, реже розовые, очень редко пурпурные, в 1-5(10) цветковых головках на коротких цветоносах, примерно равных листьям; листочки обычно в числе 2-6 пар, густо покрыты прижатыми двуконечными волосками; прилистники при основании сросшиеся между собой и с черешком (формируют раструб, охватывающий стебель). Бобы от продолговато-яйцевидных до ланцетных, прямые, редко слегка изогнутые, густо опушённые длинными оттопыренными волосками. Четыре вида секции Astragalus chakassiensis Polozhij, A. depauperatus, A. helmii и
A. permiensis C. A. Mey. ex Rupr. произрастают на скалах и щебнистых осыпях, почти исключительно на известняках, мергелях и других карбонатных породах. Еще четыре вида A. gregorii
B. Fedtsch. et Basil. (= A. tuvinicus Timochina),
Л. heptapotamicus Sumnev., Л. kasachstanicus Golosk. s. l. и Л. tergeminus (Knjaz., Kulikov et E. G. Philippov) Knjaz. также являются петрофитами, но избегают горные породы, содержащие карбонаты. Наконец, Л. ionae произрастает преимущественно на аллювии в долинах рек и, вероятно, не имеет предпочтения к химическому составу горных пород. Как правило, представители секции аллопа-тричны; в тех случаях, когда их ареалы частично перекрываются, а экологические особенности близки или идентичны, они (практически без исключений) не произрастают совместно. Такая интересная пространственная сегрегация, вероятно, и обуславливает существенные генетические отличия хпДНК, установленные нами для многих таксонов. Ещё один изученный вид Л. arcanus, хотя и имеет значительное морфологическое сходство с типичными представителями секции Helmia, отнесён авторами вида к секции Erioceras (возможно, представляет собой межсекционный гибрид) (Knyazev et al., 2019). Представители этой секции невысокие (чаще стелющиеся) травы и полукустарнички, опушённые прижатыми, рыхло прижатыми или отстоящими двуконечными волосками; цветки обычно фиолетовые или пурпурные, в головчатых или зонтиковидных кистях, на цветоносах, равных или в 1,5-2 раза длиннее листьев; прилистники свободные или сросшиеся при основании между собой, но не с черешком. Бобы продолговатые, ланцетные, изогнутые, опушённые оттопыренными волосками. Большинство видов секции Erioceras произрастают в щебнистых и песчаных опустыненных степях и не проявляют какой-либо явной эдафической приуроченности.
Материалом для исследования послужили растения, собранные авторами в 2017-2019 гг. на Урале, в Казахстане и Сибири. Собран материал по 10 таксонам из 13 популяций (табл. 1). Ваучерные гербарные образцы хранятся в ботанической части Музея Института экологии растений и животных УрО РАН (SVER), некоторые дублеты гербария переданы в коллекцию Ботанического института РАН им. В. Л. Комарова (LE) и Гербарий Ботанического сада УрО РАН (Екатеринбург), ваучерный образец Лstragalus chakassiensis хранится в Гербарии им. П. Н. Крылова Национального исследовательского Томского государственного университета (TK). Было исследовано по пять образцов в каждой из 13 популяций (всего 65 образцов). Для генетических исследований собирались листья от отдельных особей по трансекте на расстоянии 5-10 м друг от друга, или - в случае нахождения
популяций на отвесных скалах - у всех доступных особей. Собранный материал замораживался и хранился в морозильной камере при -80 °C. В двух случаях - в популяциях «Ефремкино» и «Нура» - от 10-15 особей были собраны бобы, и для экстракции ДНК использовались проростки, полученные в лабораторных условиях.
Для экстракции ДНК были взяты навески листьев или проростки из семян. Тотальная ДНК была выделена с использованием CTAB метода (Devey et al., 1996). Для амплификации региона trnF-trnV и интрона trnL были использованы универсальные праймеры (Grivet et al., 2001). Амплификацию региона trnF-trnV проводили при температуре отжига 60 °С (2 мин) и времени элонгации 3 мин при 72 °С, а интрона trnL при температуре отжига 55 °С (1 мин) и времени элонгации 2 мин при 72 °С. Наличие ПЦР-про-дукта визуализировали в 1%-м агарозном геле с добавлением этидиум бромида в ультрафиолетовом свете. Продукты амплификации были использованы для последующего секвенирования методом Сэнгера при помощи BigDye v. 3.1 kit (Gene Analyzers 3130; Applied Biosystems, Foster City, CA).
Секвенирование региона trnF-trnV проводилось в несколько этапов с использованием разработанных праймеров: 5'-ATTCTGGC TGGTTAAACTTC-3', 5'-ATGGAGGTTTCATTC ATATC-3, 5'-CCGTTATTATATGTTTGCTC-3' и 5'-ATTGGTTCTATTCCTGATTC-3'. Редактирование и выравнивание полученных последовательностей выполнялось в программе MEGA6. Гаплотип каждого растения был определен путем объединения обоих регионов хпДНК.
Генетическая подразделенность (Nst, Gst) и параметры полиморфизма (Hd, п), а также дистанции (Fst) рассчитывались с помощью пакета программ DnaSP6. F рассчитывали для измерения молекулярной дивергенции между группами популяций и отдельными видами. Филогенетические отношения были реконструированы с использованием программы Network v.10.6.12 (method Reduced Median), филогенетическое дерево реконструировали в программе MEGA6 (Maximum Likelihood, Test of Phylogeny: Bootstrap method, Bootstrap Replications - 1000). В качестве внешней группы взят Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge var. membranaceus (KX255662.1) из GenBank.
Результаты
В результате секвенирования межгенного спейсера trnF-trnV и интрона trnL хпДНК 65
Таблица 1
Происхождение исследованного материала видов рода Astragalus
Таксон Популяция Происхождение
A. arcanus Жарык-18 Казахстан, Карагандинская обл., горный массив Бугалы, восточнее ж.-д. ст. Бурма, увал в 1,5 км к северо-востоку от горы Косшокы, 49.951949М, 72.930006Е
A. chakassiensis Ефремкино Россия, Респ. Хакасия, правый берег р. Белый Июс близ с. Ефремкино, 54.446196М, 89.467627Е
A. depauperatus var. depauperatus Бреды Россия, Челябинская обл., Брединский р-н, севернее пруда р. Бирсуат, петрофитные степи, 52.232690М, 58.879460Е
Он же Кизил Россия, Челябинская обл., Кизильский р-н, обнажение известняков по левому берегу р. Большой Кизил, 52.743235М, 60.660020Е
A. helmii Усень Россия, Респ. Башкортостан, Туймазинский р-н, правый берег р. Усень, северо-восточнее с. Новосуккулово, 54.499333^ 53.925248Е
Он же Куш-тау Россия, Респ. Башкортостан, северо-восточнее г. Стерлитамак, южная оконечность горы Куш-тау, 53.685260М, 56.082621Е
A. heptapotamicus Жарык-17 Казахстан, Карагандинская обл., горный массив Бугалы, северо-восточнее ж.-д. ст. Жарык, увал около 1,5 км к юго-западу от горы Косшокы, 49.906160М, 72.954554Е
A. ionae Красноярск Россия, г. Красноярск, западная окраина, южный склон холма севернее р. Бугач, западнее оконечности ул. Звёздная, скалы, 56.053898М, 92.795621Е
A. kasachstanicus Нура Казахстан, правый берег р. Нура выше с. Романовка, яры Аксингир, по краю и на дне карьера, 50.817852М, 71.374479Е
A. permiensis var. permiensis Дужной Россия, Пермский край, правый берег р. Чусовая, скалы Камень Дужной, около 8 км выше устья р. Серебрянка, 57.788238М, 58.759845Е
A. permiensis var. sacrimontis Тра-тау Россия, Респ. Башкортостан, правый берег р. Белой, юго-восточнее г. Стерлитамак, восточный склон г. Тра-тау, 53.552899М, 56.102904Е
A. tergeminus Губерля Россия, Оренбургская обл., вершина увала, 1 км юго-западнее ж.-д. ст. Губерля, 51.294572^ 58.166389Е
Он же Хабарное Россия, Оренбургская обл., г. Новотроицк, склоны холма 1-2 км севернее пос. Хабарное, 51.158528М, 58.222582Е
образцов различных таксонов Astragalus были получены последовательности длиной в среднем около 3412 п. н. После выравнивания было идентифицировано 24 гаплотипа, включая внешнюю группу, представленную A. membranaceus, отношения между которыми были визуализированы в виде сети в программе Network. Общее число проанализированных сайтов составило 3056 (включая гэпы), количество вариабельных сайтов - 68 (включая гэпы), среднее разнообразие гаплотипов по общей группе низкое (0,879 ± 0,039), общее количество мутаций - 69. Анализ региона trnF-trnV и интрона trnL хпДНК модельных тасконов Astragalus показал достаточно высокую вариабельность этого региона, позволяющую идентифицировать большинство изученных видов и разновидностей (табл. 2).
Одним из наиболее эффективных критериев дискретности популяций и интенсивности
потоков генов является критерий F , который можно вычислить на основе расшифрованных последовательностей ДНК. С помощью F критерия можно определить генетическую разобщенность между группами и популяциями организмов, изолированными как географическими барьерами, так и расстоянием.
Анализ межпопуляционных дистанций, рассчитанный на основании значений F , выявил
st
континуальность изученных регионов хпДНК для трёх таксонов и хорошо выраженную для остальных пяти. Характерный уровень межпо-пуляционной изменчивости (табл. 3) 0,250 (между тремя популяциями A. depauperatus), 0,048 (между популяциями A. helmii) и 0,091 (между популяциями A. permiensis).
Молекулярно-генетический анализ изменчивости не позволил различить четыре вида (табл. 4): Astragalus chakassiensis, A. depauperatus,
Таблица 2
Распределение гаплотипов и параметры генетической изменчивости по данным хпДНК (р > 0,001)
Таксон Популяция Hd п Fst N t st Gst № гаплотипа (всего)
Л. arcanus Жарык-18 1,0 0,00588 0,860 ± 0,123 0,979 ± 0,073 0,378 ± 0,318 19-23 (5)
A. chakassiensis Ефремкино 0 0 0,458 ± 0,153 0,852 ± 0,162 0,591 ± 0,193 15 (1)
Л. depauperatus Бреды 0 0 0,250 ± 0,820 0,591 ± 0,125 0,394 ± 0,123 1 (1)
Л. depauperatus Кизил 0,6 0,00652 0,318 ± 0,092 0,616 ± 0,091 0,142 ± 0,059 1, 2 (2)
Л. helmii Усень 0,6 0,00268 0,822 ± 0,061 0,781 ± 0,032 0,984 ± 0,237 3, 4 (2)
Л. helmii Куш-тау 0,4 0,00268 0,584 ± 0,046 0,765 ± 0,024 0,586 ± 0,072 3, 4 (2)
Л. heptapotamicus Жарык-17 0 0 0,911 ± 0,128 0,945 ± 0,137 0,719 ± 0,240 18 (1)
Л. ionae Красноярск 0 0 0,931 ± 0,015 0,984 ± 0,046 0,769 ± 0,133 14 (1)
Л. kasachstanicus Нура 0,7 0,00522 0,586 ± 0,047 0,925 ± 0,059 0,281 ± 0,034 15-17 (3)
Л. permiensis var. permiensis Дужной 0,8 0,01913 0,708 ± 0,148 0,684 ± 0,127 0,326 ± 0,064 8-10 (3)
Л. permiensis var. sacrimontis Тра-тау 0,7 0,01565 0,547 ± 0,028 0,841 ± 0,155 0,672 ± 0,075 11-13 (3)
Л. tergeminus Губерля 0 0 0,506 ± 0,149 0,635 ± 0,022 0,156 ± 0,540 5 (1)
Л. tergeminus Хабарное 0,8 0,00348 0,410 ± 0,125 0,636 ± 0,111 0,285 ± 0,012 5-7 (3)
межгрупповое 0,842 0,00160 0,885 ± 0,030 0,885 ± 0,03 0,564 ± 0,19 1-23 + Outside group
внутригрупповое 0,382 0,00020 0,764 ± 0,550 0,810 ± 0,29 0,573 ± 0,39
Примеч.: п - нуклеотидное разнообразие; Hd - разнообразие гаплотипов; F , N , Gst - индексы
фиксации генетической дифференциации между популяциями.
Л. kasachstanicus и Л. tergeminus. Показатель Ft между этими таксонами имеет уровень, характерный для межпопуляционной дифференциации (табл. 3, 4). Лstragalus arcanus резко отличается от всех остальных видов и разновидностей (F = 0,859-0,969). Поскольку он относится к секции Erioceras, то выявленный уровень F , в нашем случае, следует оценивать как межсекционный.
Как видно из таблицы 4, ещё один вид Л. ionae («Красноярск») столь же устойчиво отличается высоким значением F 0,829-1,000. Возможно,
st
эту особенность Л. ionae следует связать с его гибридогенным происхождением (Popov, 1949).
Для некоторых типичных представителей секции Helmia среднее значение F было проме-
жуточным, между межсекционным и межпопу-ляционым уровнями: 0,676-0,876 (А. ретт1еп$1$, популяции «Дужной» и «Тра-тау»), Р = 0,7201,000 (А. heptapotamicus), Р4 = 0,711-0,937 (А. helmii, популяции «Усень» и «Куш-тау»).
Среднее разнообразие гаплотипов (На) между популяциями составило 0,842; внутрипопу-ляционное не превысило 0,382, так как ряд популяций характеризуются нулевым значением по данному параметру. Также относительно стабильно и нуклеотидное разнообразие (п) в популяциях (табл. 2). Максимальные значение п отмечены для А. permiensis уаг. permiensis (0,01913) и А. permiensis уаг. sacrimontis Кщ'аг. (0,01565). Р5( оценивает степень генетической дифференциа-
ции субпопуляций на основании расчета стандартизированных варианс частот аллелей между популяциями. Достаточно высокие значения Fst отмечены для A. ionae (0,931), A. heptapotamicus (0,911), A. helmii (0,898), а минимальные для A. depauperatus (0,250-0,318). Значения, полученные для индексов фиксации генетической дифференциации между изученными популяциями подтверждают данные, выявленные при анализе гаплотипов. Межгрупповой и внутригрупповой индексы фиксации Nst (0,885 ± 0,030 и 0,810 ± 0,290, соответственно) несколько превышают G (0,564 ± 0,190 и 0,573 ± 0,390, соответственно). S
На рис. 1 и 2 изображены схемы филогенетических отношений семи видов рода Astragalus секции Helmia и A. arcanus по данным секвени-рования полиморфных регионов trnF-trnV и trnL хпДНК 65 образцов, построенные двумя методами.
В качестве внешней группы в обоих методах взята аналогичная последовательность регионов trnF-trnV и trnL хпДНК A. membranaceus. Все изученные виды относятся к подроду Cercidotrix Bunge рода Astragalus, тогда как A. membranaceus к типовому подроду Astragalus, поэтому отмечаемая на схемах дифференциация между внешней группой и остальными таксонами следует
оценивать как уровень между подродами.
Сеть гаплотипов (рис. 1) даёт сходную топологию с результатами анализа методом NJ (рис. 2). В обоих вариантах выделяются четыре группы: 1) A. arcanus, 2) диффузный субкластер A. heptapotamicus - A. ionae - A. permiensis; 3) весьма неоднородная группа A. depauperatus -A. kasachstanicus - A. tergeminus и 4) A. helmii. Сеть гаплотипов (рис. 1) более чётко показывает обособленность A. helmii.
Обсуждение
Дендрограмма, построенная методом Neighbour Joining (NJ) на основе данных секве-нирования FV TabCD хлоропластного генома показывает достоверное отличие четырёх из восьми изученных таксонов Astragalus (рис. 2). Наиболее резко отделяется A. arcanus. Он морфологически весьма близок к A. heptapotamicus, но, на основании строения бобов, отнесён авторами к секции Erioceras (Knyazev et al., 2019). Таким образом, данный уровень обособленности следует оценивать, как межсекционный (точнее, между представителями двух близких секций подрода Cercidothrix рода Astragalus). Остальные семь видов являются представите-
Средние межгрупповые дистанции (Fst) (р > 0,001)
Таблица 3
№ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
1 0
2 0,250 0
3 0,250 0 0
4 0,776 0,868 0,868 0
5 0,800 0,905 0,905 0,048 0
6 0,250 0 0 0,868 0,905 0
7 0,200 0,111 0,111 0,800 0,828 0,111 0
8 0,676 0,720 0,720 0,717 0,728 0,720 0,687 0
9 0,678 0,729 0,729 0,724 0,737 0,729 0,690 0,091 0
10 0,928 1 1 0,937 0,957 1,000 0,950 0,829 0,846 0
11 0,351 0,429 0,429 0,786 0,810 0,429 0,333 0,685 0,688 0,930 0
12 0,896 1 1 0,915 0,940 1 0,927 0,720 0,729 1 0,901 0
13 0,922 0,959 0,959 0,928 0,939 0,959 0,933 0,859 0,872 0,969 0,923 0,965 0
Примеч.: Номерами обозначены популяции: 1 - Astragalus depauperatus (Кизил); 2 - A. depauperatus (Бреды); 3 - A. chakassiensis (Ефремкино); 4 - A. helmii (Усень); 5 - A. helmii (Куш-тау); 6 - A. tergeminus (Губерля); 7 - A. tergeminus (Хабарное); 8 - A. permiensis (Дужной); 9 - A. permiensis (Тра-тау); 10 -A. ionae (Красноярск); 11 - A. kasachstanicus (Нура); 12 - A. heptapotamicus (Жарык-17); 13 - A. arcanus (Жарык-18).
№ Таксон 1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 A. depauperatus 0
2 A. chakassiensis 0,077 0
3 A. hemii 0,809 0,831 0
4 A. tergeminus 0,091 0,036 0,838 0
5 A. permiensis 0,667 0,599 0,705 0,680 0
6 A. ionae 0,926 0,930 0,918 0,957 0,755 0
7 A. kasachstanicus 0,323 0,429 0,777 0,370 0,599 0,930 0
8 A. heptapotamicus 0,894 1 0,890 0,937 0,610 1 0,901 0
9 A. arcanus 0,930 0,959 0,925 0,947 0,816 0,969 0,923 0,965 0
Таблица 4
A. depauperatus
0
A. chakassiensis
0,077
A. hemii
0,809
0,831
0
A. tergeminus
0,091
0,036
0,838
0
A. permiensis
0,667
0,599
0,705
0,680
0
A. ionae
0,926
0,930
0,918
0,957
0,755
0
A. kasachstanicus
0,323
0,429
0,777
0,370
0,599
0,930
A. heptapotamicus
0,894
1
0,890
0,937
0,610
1
0,901
0
A. arcanus
0,930
0,959
0,925
0,947
0,816
0,969
0,923
0,965
4
6
8
9
5
7
0
0
0
лями секции Helmia. Среди них резко выделяется Astragalus ionae (бутстреп поддержка 0,99), субкластер A. heptapotamicus - A. permiensis (0,97) и A. helmii (0,96). Еще четыре вида A. chakassiensis, A depauperatus, A. kasachstanicus и A. tergeminus на основании изменчивости FV TabCD хлоропластного генома и при использовании статистического метода NJ достоверно не различаются, хотя морфологически впол-
не обособлены, а некоторые отличаются числами хромосом. Так, у A. tergeminus 2n = 16, у A. depauperatus (уральские популяции) 2n = 32, у A. chakassiensis 2n = 64 (Krivenko et al., 2022 и оригинальные данные авторов).
В отличие от дендрограммы NJ (рис. 2), сеть гаплотипов (рис. 1.) более наглядно демонстрирует корреляцию между диплоидным уровнем плоидности и базальным положением таксонов
Рис. 1. Сеть гаплотипов, построенная на основании анализа 65 последовательностей FV TabCD хпДНК (65 образцов из 13 популяций 8 видов Astragalus) в программе Network v.10.6.12 (method Reduced Median). Заливкой обозначены гаплотипы диплоидных таксонов.
Рис. 2. Схема филогенетических взаимоотношений видов Astragalus секции Helmia, а также их вероятного гибридного производного - A. arcanus. Кладограмма построена методом NJ на основе данных секвенирования регионов trnF-trnV и trnL хлоропластного генома. Цифрами в узлах ветвей показаны значения бутстреп-под-держки > 50 %. Филогенетическое дерево реконструировали в программе MEGA 6.06 (140226).
в сети гаплотипов. Если диплоидный Л. helmii (гаплотипы h3, h4), очевидно, представляет независимую, сестринскую линию развития, то гаплотипы других диплоидных таксонов могли быть исходными для некоторых гаплоти-пов-дериватов. Так, гаплотип h5 (диплоидный Л. tergeminus), скорее всего, был исходным как для h6, h7 (некоторые образцы Л. tergeminus), так и для h1, h2, характерных для уральской тетра-плоидной расы Л. depauperatus s. l. Гаплотип h15 единственный, который отмечен одновременно у двух видов: Л. chakassiensis (у всех пяти изученных особей) и Л. kasachstanicus (у одной из пяти исследованных особей). Все остальные гаплоти-пы не только видоспецифичны, но и не совпадают у разных разновидностей. Наличие общего гаплотипа у Л. chakassiensis и Л. kasachstanicus, конечно же, не может быть основанием для их объединения - это морфологически, экологически и географически резко обособленные таксоны. Кроме того, Л. kasachstanicus диплоид - 2n = 2х = 16, тогда как Л. chakassiensis октоплоид -2n = 8х = 64 (Krivenko et al., 2022). Вероятно, частичное совпадение гаплотипов следует объяснить тем, что h15 был характерен для анцестора всех сибирских и среднеазиатских таксонов секции, а это значит, с определённой частотой может встречаться у всех или многих из них. Возможно, этим предковым видом является диплоидный Л. kasachstanicus.
Весьма примечательны положение и полиморфизм Л. permiensis s. l., демонстрируемые на рис. 1 и 2. Ранее (Goncharov, Popov, 1946) этот таксон считался синонимом Л. helmii. Однако, как показывают наши исследования, он проявляет большее генетическое сходство со среднеазиатским Л. heptapotamicus, и, вероятно, имеет среднеазиатское или сибирское, но не уральское, происхождение. Примечательно, что южноуральская разновидность Л. permiensis var. sacrimontis (гора Тра-тау близ г. Стерлитамак) и типовая Л. permiensis var. permiensis (Камень Дужной на р. Чусовая) не имеют общих гапло-типов, при этом гаплотипы последней могут рассматриваться как производные гаплотипов Л. permiensis var. sacrimontis. Перечисленные
факты можно объяснить следующим образом: 1) A. permiensis мигрировал на Урал из Средней Азии или Южной Сибири; 2) на первоначальной родине вымер, но распространился на Южном Урале, где представлен разновидностью A. permiensis var. sacrimontis, с исходными гапло-типами h3, hl 1—13) затем распространился на Средний и Северный Урал, где возникли производные гаплотипы h8-10.
Показано, что A. depauperatus генетически неоднороден - гаплотипы уральских популяций h1 и h2 представляют дериваты гаплотипа h5 (A. tergeminus), тогда как A. chakassiensis представлен гаплотипом h15, который рассматривается нами как исходный для всех сибирских и среднеазиатских представителей секции. Эти данные соответствуют разным числам хромосом уральского A. depauperatus s. l. - 2n = 32, A. chakassiensis - 2n = 64 (Krivenko et al., 2022) и образцов A. depauperatus var. depauperatus из Алтайского края - 2n = 48 (An'kova, Shaulo, 2012). Предположительно, A. depauperatus представляет комплекс, морфологически крайне близких видов-двойников. Наши исследования дают дополнительную аргументацию необходимости видовой самостоятельности A. chakassiensis.
Относительное сходство A. arcanus с представителями секции Helmia, демонстрируемое на графе сети гаплотипов (рис. 1), скорее всего, следует рассматривать как артефакт, обусловленный достаточно близким родством секций Helmia и Erioceras рода Astragalus. В этих группах видов, скорее всего, сохраняется значительное сходство FV TabCD хпДНК, восходящее к общему предку.
Благодарности
Авторывыражаютпризнательность А. Л.Эбе-лю, собравшему для наших исследований семена Astragalus chakassienis.
Acknowledgment
The authors express their gratitude to A. L. Ebel, who collected the seeds of Astragalus chakassienis for our research.
REFERENCES / ЛИТЕРАТУРА
An'kova T. V., Shaulo D. N. 2012. IAPT/IOPB chromosome data 14 (K. Marhold, ed.). Taxon 61(6): 1336. DOI: 10.1002/tax.616027
Devey M. E., Bell J. C., Smith D. N., Neale D. B., Moran G. F. 1996. A genetic linkage map for Pinus radiata based on RFLP, RAPD and microsatellite markers. Theor. Appl. Genet. 92(6): 673-679. DOI: 10.1007/BF00226088
Goncharov N. F., Popov M. G. 1946. Genus Лstragalus L. - Milkwetch. Section Helmia Bge. In: Flora SSSR [Flora of USSR]. Vol. 12. Moscow; Leningrad: Izdatelstvo AN SSSR. Pp. 545-549. [In Russian] (Гончаров Н. Ф, Попов М. Г. Род Лstragalus L. - Астрагал. Секция Helmia Bge // Флора СССР. Т. 12. М.; Л.: Изд-во АН СССР, 1946. С. 545-549).
GrivetD., Heinze B., Vendramin G. G., Petit R. J. 2001. Genome walking with consensus primers: application to the large single copy region of chloroplast DNA. Mol. Ecol. Notes 1(4): 345-349. DOI: 10.1046/j.1471-8278.2001.00107.x
KnyazevM. S. 2019. The review of genus Лstragalus section Helmia (Fabaceae). Novosti sistematiki vysshikh rasteniy [Novit. Syst. Pl. Vasc.] 50: 120-131. [In Russian with English abstract] (Князев М. С. Ревизия секции Helmia рода Лstragalus (Fabaceae) // Новости сист. высш. раст., 2019. Т. 50. С. 120-131). DOI: 10.31111/novitates/2019.50.120
Knyazev M. S., Krivenko D. A., Philippov E. G. 2019. New species of the genus Лstragalus (Fabaceae) from Central Kazakhstan. Bot. Zhurn. 104(5): 136-140. [In Russian and Latin] (Князев М. С., Кривенко Д. А., Филиппов Е. Г. Новый вид рода Лstragalus (Fabaceae) из Центрального Казахстана // Бот. журн., 2019. Т. 104, № 5. С. 136-140). DOI: 10.1134/S0006813619050089
Knyasev M. S., Philippov E. G. 2019. Investigation of chloroplast DNA variability of some representatives of section Helmia of the genus Лstragalus (Fabaceae). In: Modern synthesis methodologies for creating drugs and functional materials (MOSM 2018). Proceedings of the II International Conference 15-17 November 2018 Yekaterinburg, Russia. DOI: 10.1063/1.5087359
Kress W. J., Erickson D. L. 2007. A two-locus global DNA barcode for land plants: the coding rbcLgene complements the non-coding trnH-psbA spacer region. PLoS ONE 2(6): e508. DOI: 10.1371/journal.pone.0000508
Kress W. J., Wurdack K. J., Zimmer E. A., Weigt L. A., Janzen D. H. 2005. Use of DNA barcodes to identify flowering plants. PNЛS 102(23): 8369-8374. DOI: 10.1073/pnas.0503123102
Krivenko D. A., Kuzmina P. A., Chimitov D. G., Knyazev M. S., Vishnyakov V. S. 2022. IAPT chromosome data 38/5 (K. Marhold & J. Kucera, eds). Taxon 71(6): 1356-1357. DOI: 10.1002/tax.12836
Podlech D., Zarre Sh. 2013. A taxonomic revision of the genus Лstragalus L. (Leguminosae) in the Old World. Vol. 1-3. Vienna: Naturhistorisches Museum Wien. 2439 pp.
Popov M. G. 1949. Лstragalus ionae Palib. Catalogus Plantarum Herb. Fl. USSR (Leningrad) 11(67): 62-63. [In Russian] (Попов М. Г. Лstragalus ionae Palib. // Список раст. герб. Фл. СССР (Ленинград). 1949. Т. 11, вып. 67. С. 62-63).
Shaw J., Lickey E. B., Beck J. T., Farmer S. B., Liu W., Miller J., Siripun K. C., Winder C. T., Schilling E. E., Small R. L.
2005. The tortoise and the hare II: relative utility of 21 noncoding chloroplast DNA sequences for phylogenetic analysis. Лm. J. Bot. 92(1): 142-166. DOI: 10.3732/ajb.92.1.142
Shaw J., Lickey E. B., Schilling E. E., Small R. L. 2007. Comparison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies in Angiosperms: the tortoise and the hare III. Лm. J. Bot. 94(3): 275-288. DOI: 10.3732/ ajb.94.3.275
Shneer V. S. 1991. Chloroplast DNA as a source of information for the systematics and phylogeny of higher plants. Bot. Zhurn. 76(12): 1657-1673. [In Russian] (Шнеер В. С. Хлоропластная ДНК как источник информации для систематики и филогении высших растений // Бот. журн., 1991. Т. 76. № 12. С. 1657-1673).
Taberlet P., Coissac E., Pompanon F., Gielly L., Miquel C., Valentini A., Vermat T., Corthier G., Brochmann C., Willerslev E. 2007. Power and limitation of the chloroplast trnL (UAA) intron for plant DNA-barcoding. Nucleic Лcids Res. 35(3): e14. DOI: 10.1093/nar/gkl938
Taberlet P., Gielly L., Pautou G., Bouvet J. 1991. Universal primers for amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA. Plant Mol. Biol. 17(5): 1105-1109. DOI: 10.1007/BF00037152
