CC BY
11
Turczaninowia 26, 1: 83-94 (2023) D OI: 10.14258/turczaninowia.26.1.9 http://turczaninowia.asu.ru
ШШ ISSN 1560-7259 (print edition)
M TURCZANINOWIA
¡¡j| ISSN 1560-7267 (online edition)
УДК 582.736+575.857(470+571) О генетической структуре популяций Eversmannia subspinosa в России
Н. Ю. Степанова1' 2, А. В. Федорова1' 3, И. А. Шанцер1' 4*
1 Главный ботанический сад им. Н. В. Цицина РАН, ул. Ботаническая, д. 4, г. Москва, 127276, Россия 2E-mail: ny_stepanova@mail.ru; ORCID iD: https://orcid.org/0000-0002-8414-4794 3E-mail: alina_77777@mail.ru; ORCID iD: https://orcid.org/0000-0001-7362-2124 4E-mail: ischanzer@gmail.com; ORCID iD: https://orcid.org/0000-0003-4216-9923
* Автор для переписки
Ключевые слова: генетическая структура, популяция, Eversmannia, Fabaceae.
Аннотация. Проведено исследование генетической структуры популяций Eversmannia subspinosa (Fisch. ex DC.) B. Fedtsch. с территории России (г. Большое Богдо, Астраханская область; балка Кегульта, Республика Калмыкия) и ряда образцов из Средней Азии (Казахстан, Киргизия) с применением межмикросателлит-ных (ISSR) маркеров, секвенированных ядерных (ITS 1,2) и хлоропластных маркеров (trnL-trnF, atpB-rbcL, rpl32-trnL(UAG), trnV-ndhC). Анализ межмикросателлитных маркеров разделил исследованные образцы на три генетических кластера: популяция г. Большое Богдо, популяция из балки Кегульта, образцы из Средней Азии. Показано, что популяция из балки Кегульта является генетически вариабельной, тогда как популяция с г. Большое Богдо оказалась однородной. Результаты анализа хлоропластных участков ДНК показали общее родство популяций г. Большое Богдо и балки Кегульта. В то же время эти крайние западные популяции оказались наиболее родственными исследованным образцам из Западного Тянь-Шаня: Сырдарьинского Каратау, Таласского Алатау (гор Ичкеле-Тоо) и Кызылординской области Казахстана.
On the genetic structure of Eversmannia subspinosa populations in Russia
N. Yu. Stepanova, A. V. Fedorova, I. A. Schanzer*
Tsitsin Main Botanical Garden RAS, Botanicheskaya St., 4, Moscow, 127276, Russian Federation
* Corresponding author
Keywords: Eversmannia, Fabaceae, genetic structure, population.
Summary. We have studied the genetic structure of Eversmannia subspinosa (Fisch. ex DC.) B. Fedtsch. populations from the Russian Federation (the Bolshoe Bogdo Mt., the Astrakhan Region; Kegul'ta gully, Republic of Kalmykia) and a number of specimens from the Middle Asia (Kazakhztan and Kyrgyzstan) using inter-simple sequence repeats (ISSR) markers, sequenced nuclear (ITS 1, 2) and chloroplast markers (trnL-trnF, atpB-rbcL, rpl32-trnL(UAG), trnV-ndhC). The analysis of ISSR markers divided samples into three genetic clusters: the population from the Bolshoe Bogdo Mt., the population from the Kegul'ta gully, and samples from the Middle Asia. The population from the Kegul'ta gully appeared to be genetically variable, whereas the population from the Bolshoe Bogdo Mt. exhibited no variation. Populations from the Bolshoe Bogdo and Kegul'ta are more closely related according to the results of the chloroplast DNA analysis. At the same time, these westernmost populations turned out to be related to the samples from the Western Tian Shan: Syr-Darya Karatau, Talas Alatau (Ichkele-Too Mts.) and Kyzylorda Region of Kazakhstan.
Поступило в редакцию 06.10.2022 Принято к публикации 09.03.2023
Submitted 06.10.2022 Accepted 09.03.2023
Eversmannia Bunge - олиготипный род, включающий широко распространенный вид Eversmannia subspinosa (Fisch. ex DC.) B. Fedtsch. (E. hedysaroides Bunge) и три эндемика Памиро-Алая: E. botschantzevii Sarkisova (Гиссарский хребет), E. sarytavica Sarkisova (Заравшанский хребет), E. sogdiana Ovcz. (Туркестанский хребет) (Ovczinnikov, 1978; Sarkisova, 1981; Vassilyeva, 1987).
E. subspinosa (эверсмания почти-колючая) представляет собой небольшой кустарник 15-60 см высотой с растрескивающейся желтовато-серой корой, с восходящими ветвями и редкими пазушными шипами до 2 см длиной, годичные побеги, цветоносы и черешки листьев сероватые
от обильного прижатого опушения, листья непарно-перистые из 3-7 пар эллиптических или обратно-яйцевидных заостренных листочков, снизу так же обильно опушенных прижатыми волосками; цветки пурпурные, собраны в кисти на длинных, превышающих листья, пазушных цветоносах; чашечка прижато-волосистая (рис. 1). Как и остальные представители рода, E. sub-spinosa произрастает преимущественно на выходах пестроцветов, третичных глин, красных песчаников, на щебнисто-каменистых, сухих глинистых склонах, в песчаных и глинисто-солончаковых пустынях (ЗагЫзоуа, 1981; УаззП-уеуа, 1987).
Рис. 1. Eversmannia subspinosa из окрестностей п. Кегульта, Республика Калмыкия, Россия, 29 У 2021 (фото Н. Ю. Степановой).
Ареал E. subspinosa простирается от предгорий Западного Тянь-Шаня на востоке, через всю центральную часть Средней Азии, заходя южнее в Иран и Афганистан, а на западе доходит до юго-восточных районов европейской части России (8ууагеуа, КашеНп, 1986).
С территории России до недавнего времени было известно лишь одно достоверное место произрастания E. subspinosa - на склонах г. Большое Богдо в Астраханской области (Ьакйопоу, 2018). Это местонахождение на северо-западном пределе ареала, на территории Прикаспийской
низменности, связывают с сохранившимися подходящими условиями для произрастания вида на возвышенностях, которые не подверглись затоплению морскими водами во время Хвалынской трансгрессии Каспийского моря 11-16 тыс. лет назад - так называемые «острова рефугиумы» (Уашпа, 2012; Уо1оЬоеуа, Ьакйопоу, 2019; Ьакйопоу, Уо1оЬоеуа, 2021). В 2021 г. А. П. Лактионов с коллегами (Ьакйопоу е! а1., 2021) обнаружили новую точку распространения вида близ п. Кегульта (Республика Калмыкия), которая оказалась наиболее западной в ареале и удаленной от места произрастания на г. Большое Богдо более чем на 200 км к западу. Новая популяция была обнаружена исследователями в верховьях балки Кегульта на восточном макросклоне возвышенности Ергени. С точки зрения истории развития Прикаспийской низменности, на момент Хвалынской трансгрессии данная территория являлась высоким берегом Каспийского моря и могла не затапливаться подобно г. Большое Богдо (Уашпа, 2012). Соответственно, можно предположить, что популяции E. subspinosa из балки Кегульта и с г. Большое Бог-до являются реликтами-анклавами одной популяции, некогда более широко распространенной на территории Прикаспия. Нами предпринята
попытка изучить генетическую структуру этих популяций и сравнить с образцами из основной части ареала (Казахстан, Киргизия) для установления их вероятных родственных связей.
Материалы и методы
Общий объем выборки E. subspinosa составил 20 образцов: 4 образца из балки Кегульта (Республика Калмыкия), 6 образцов с г. Большое Богдо (Астраханская область) и 10 образцов из Средней Азии (Казахстан, Киргизия) были отобраны из гербариев Ботанического института им. В. Л. Комарова РАН (ЬБ) и Главного ботанического сада им. Н. В. Цицина РАН (МНА). Полный список всех исследованных образцов приведен в табл. 1. Географическое распространение исследованных образцов E. subspinosa показано на рис. 2, построенном в программе "81шр1еМаррг" ЬЬогЛоше, 2010).
Гербарные образцы под номерами К71 и предположительно могли принадлежать одному и тому же растению и представлять собой две отдельно смонтированные его части. Для проверки этого предположения образцы были исследованы независимо.
Рис. 2. Географическое положение исследованных популяций Eversmannia subspinosa. Буквенные обозначения популяций соответствуют таблице 1: Треугольники - популяции из России, кружочки - популяции из Средней Азии. Красным цветом обозначены популяции, составившие первую эволюционную линию по результатам анализа хлоропластных участков (atpB-rbcL, ^пУ-ndhC, ^32-^1, ^пЪ-^пБ) в программе ТС8, желтым -вторую.
Таблица 1
Исследованные популяции Eversmannia subspinosa и номера последовательностей ДНК, депонированных в GenBank NCBI, с указанием гаплотипов объединенного выравнивания хлоропластных участков (atpB-rbcL, trriV-ndhC, rpl32-trnL, trn\,-trn\ )
oo
СТ\
Образец Данные этикетки образца ITS1.2 trnL-trnF rptil- trnL (UAG) trnV-ndhC atpB-rbcL xn гаплотип
К1 Россия, Респ. Калмыкия, Кетченеровский р-н, 4,5 км к СВ от п. Кугульта. 11 V 2021. Н. Ю. Степанова, С. А. Полуэктов, Е. А. Ермакова. N46.95703, Е44.47135 (МНА) ОМ368599 ON237544 ON237504 ON237524 ON237484 А
К2 Россия, Респ. Калмыкия, Кетченеровский р-н, 4,5 км к СВ от п. Кугульта. 11 V 2021. Н. Ю. Степанова, С. А. Полуэктов, Е.А. Ермакова. N46.95703, Е44.47135 (МНА) ОМ368600 ON237545 ON237505 ON237525 ON237485 А
КЗ Россия, Респ. Калмыкия, Кетченеровский р-н, 4,4 км к СВ от п. Кегульта, балка, склон западной экспозиции, разнотравное сообщество. 29 V 2021. Н. Ю. Степанова. N46.95671, Е44.47212 (МНА) ОМ368601 ON237546 ON237506 ON237526 ON237486 В
К4 Россия, Респ. Калмыкия, Кетченеровский р-н, 4,4 км к СВ от п. Кегульта, балка, склон западной экспозиции, разнотравное сообщество. 29 V 2021. Н. Ю. Степанова. N46.95671, Е44.47212 (МНА) ОМ368602 ON237547 ON237507 ON237527 ON237487 С
GBl Россия, Астраханская обл., г. Большое Богдо близ оз. Баскунчак, ниж. часть ЮВ склона. 24 V 1990. Е Клинкова, Т. Рыбникова, В. Сагалаев, И. Шанцер (МНА0182612) ОМ368603 ON237548 ON237508 ON237528 ON237488 А
GB2 [Россия], Астраханская обл., у оз. Баскунчак, г. Большое Богдо. В верхней части склона С экспозиции. 29 V .1994. А. В. Попов (МНА0182613) ОМ368604 ON237549 ON237509 ON237529 ON237489 А
GB3 Россия, Астраханская обл., г. Б. Богдо. Осыпь под западной вершиной. 28-30 V 1994. А. К. Скворцов, М. В. Костина (МНА0086781) ОМ368605 ON237550 ON237510 ON237530 ON237490 А
GB4 Россия, Астраханская обл., г. Б. Богдо. Осыпь под западной вершиной. 28-30 V 1994. А. К. Скворцов, М. В. Костина (МНА0086780) ОМ368606 ON237551 ON237511 ON237531 ON237491 А
GB5 Россия, Астраханская обл., г. Б. Богдо. Осыпь под западной вершиной. 28-30 V 1994. А. К. Скворцов, М. В. Костина (МНА0086776) ОМ368607 ON237552 ON237512 ON237532 ON237492 А
GB6 Россия, Астраханская обл., г. Б. Богдо. Осыпь под западной вершиной. 28-30 V 1994. А. К. Скворцов, М. В. Костина (МНА0086775) ОМ368608 ON237553 ON237513 ON237533 ON237493 А
О
м п Я г>
S
■с
п
о *
о Я= о н "d
н
"d
п =
о
я
^
X Я Я
я=
£
то
а s
¡•О а н
К я
о- &
^ О S' » О fa
SC ьн а Д
hd S
О Я
я V
Таблица 1 (окончание)
Образец Данные этикетки образца ITS1.2 trnL-trnF rptil- trnL (UAG) trnV-ndhC atpB-rbcL xn гаплотип
KZ1 Казахстан, Джамбульская обл., Мойынкумский р-н б трасса Алма-Ата - Балхаш, 320 км от Алма-Аты. Глинистая пустыня. 13 V 2011. Т. Коновалова, Н. Шевырёва, Ю. Пирогов; det. В. Бочкин (МНА) ОМ368609 ON237554 ON237514 ON237534 ON237494 G
KZ3 Казахстан, Гурьевская обл. В15 км ВСВ Маката по дороге на Кандагач. Солончаковатый луг. 06 VI 1956. А. Юнатов, Л. Кузнецов (LE) ОМ368611 ON237555 ON237515 ON237535 ON237495 L
KZ4 [Казахстан], Мангышлакская обл. Плато Мангышлак (восточная часть). 10 км к ЮВ от кол. Сенек (пески Тьоесу). Эродированный склон чинка. Заросли Caragana grandiflora по саю. 18 V 1980. И. Н. Сафронова, М. Д. Уфимцева (LE) ОМ368612 ON237556 ON237516 ON237536 ON237496 H
KZ5 [Казахстан, Актюбинская область], Kazachstania occidentalis, prov. Aktjubinsk, южнее пос. Жаркамыс. Мел. хр. Чиркала. Останцы у оз. Акколь. 23 VII .1964. Г. Черкасова. LE ОМ368613 ON237557 ON237517 ON237537 ON237497 J
KZ6 [Казахстан], Карагандинская область, 12 км к вост. от ст. Жана-Арка. Псаммофит-разнотравно-ковыльная степь. 09 VII 1958. № 6286. И. В. Борисова(LE) ОМ368614 ON237558 ON237518 ON237538 ON237498 I
KZ7 [Казахстан] Восточный Бетпак-Дала. Западное побережье оз. Балхаш, вблизи Мын-Арал [Жамбылская область, Мойынкумский район, село Мынарал]. По глинистой пустыне. 07 VI 1949. В. П. Голоскоков (LE) ОМ368615 ON237559 ON237519 ON237539 ON237499 К
KZ8 [Киргизия] Казахская ССР, Карагандинская область, горы Кзыл-Джал. Лог с кустарниковыми зарослями. 29 VII 1958. 3. В. Карамышева (LE) ОМ368616 ON23756Ü ON23752Ü ON23754Ü ON237500 F
KZ9 Казахстан. Перевал возвышенности северного склона Сырдарьинского Каратау между сел. Чулак-Курган и Кумкат, окрестности оз. Кузылколь. [Туркестанская область, Сузакский район, в районе озера Кызылколь]. 17 V 1977. № 1705. Р. В. Камелин, М. И.Михайлова, А. П. Мишенкова, И. Н. Сафронова, В. И. Соловьев (LE) ОМ368617 ON237561 ON237521 ON237541 ON2375Ü1 D
KZ10 [Киргизия] Таласская долина, горы Ичкеле-Тоо, против с. Орловка. 3 VII 2005. Г. А. Лазьков (LE) ОМ368618 ON237562 ON237522 ON237542 ON2375Ü2 D
KZ11 [Казахстан], Кызыл-Ординск. округ. В глинистой степи у дороги от пос. Аман-Таш и кол. Колдын-Кудук. 11 VI 1929. С. Ю. Липшиц; № 58 (LE) ОМ368619 ON237563 ON237523 ON237543 ON2375Q3 E
Молекулярные методы
Тотальная ДНК была выделена из сухих листьев образцов коммерческим набором Nucleo-Spin Plant kit (Macherey-Nagel, Германия) согласно протоколу производителя. Наличие и качество ДНК оценивали визуально в 1%-м агароз-ном геле (Amresco) с окрашиванием бромидом этидия. По результатам скрининга праймеров для дальнейшей работы были отобраны следующие участки ДНК: внутренний транскрибируемый спейсер ядерного рибосомального оперона ITS1-5.8S-ITS2 (ITS) и четыре участка хлоропластной ДНК (trnL-trnF, atpB-rbcL, rpl32-trnL(UAG), trnV-ndhC). Последовательности праймеров взяты из работ (Shaw et al., 2007; Wen, Zimmer, 1996) и синтезированы в компании Син-тол (Москва, Россия) (табл. 2). Амплификацию проводили в амплификаторе MJ Research PTC-220 DNA Engine Dyad (Biorad Ltd., США) по следующим протоколам: для ITS, trnL-trnF: 94 °C -3 мин; 94 °C - 20 с, 58 °C - 30 с, 72 °C - 40 с (34 циклов); 72 °C - 3 мин; для rpl32- trnL (UAG), trnV-ndhC: 94 °C - 1 мин; 94 °C - 30 с, 57 °C - 40 с, 60 °C - 1 мин 20 с (35 циклов); 57 °C - 40 с, 60 °C -
Фрагментный анализ
Для фрагментного анализа ДНК (Bornet, Branchard, 2001) были использованы межмикро-сателлитные участки (ISSR), полученные с использованием 9 различных праймеров (табл. 3), комплементарных ди- и тринуклеотидным повторам, характерным для ядерной ДНК. Реакционная смесь (20 мкл) содержала 10-20 нг ДНК, 20 пмоль праймера и 4 мкл готового реакционного микса MasterMix 5X MagDDMIX-2025 (200 мкмоль каждого dNTP, 1,5 ммоль MgCl2, 1,5 ед. Taq-полимеразы и буфер, Диалат ЛТД, Россия). ПЦР с предварительной денатурацией (95 °С -3 мин) проводили в амплификаторе MJ Research
1 мин 20 с (2 цикла); для atpB-rbcL: 95 °C - 3 мин; 95 °C - 30 сек, 48 °C - 1 мин, 72 °C - 40с (28 циклов); 72 °C - 3 мин. Объем одной реакции ПЦР составил 20 мкл: 1,5-2 нг ДНК, 5 пмоль каждого праймера, 4 мкл готового реакционного микса MasterMix 5X MagDDMIX-2025 (200 мкмоль каждого dNTP, 1,5 ммоль MgCl2, 1,5 ед. Taq-полимеразы и буфер, Диалат ЛТД, Россия), а также 13 мкл деионизированной воды. Для всех случаев амплификации включали по одной реакции отрицательного контроля, чтобы исключить возможность контаминации реактивов. Продукты ПЦР разделяли на 1%-м агарозном геле в 0,5 х TBE (pH = 8,3) буфере, содержавшем бромид этидия и очищали переосаждением в 0,125 M/л растворе ацетата аммония в 70%-м этаноле. Очищенный ПЦР-продукт был секвениро-ван в двух направлениях с теми же праймерами на ДНК-анализаторе 3730 DNA Analyzer (Life Technologies, США) в компании Синтол (Москва, Россия). Все секвенированные нуклеотид-ные последовательности были депонированы в базу данных GenBank NCBI (https://www.ncbi. nlm.nih.gov/); их номера приведены в таблице 1.
PTC-220 DNA Engine Dyad (Biorad Ltd., США) в течение 35 циклов в режиме: денатурация при 94 °С - 30 с, отжиг при 50 °С - 30 с, элонгация при 72 °С - 40 с + прибавление 2 с на каждый цикл. Разделение продуктов ПЦР проводили электрофорезом в 1,7 % агарозном (Amresco) геле в 0,5 х TBE (pH = 8,3) буфере с окрашиванием бромидом этидия (0,5 мкг/мл) при 125 В и фотографировали. Фотографии электрофореграмм ISSR маркеров анализировали в программе Cross Checker 2.91 (Buntjer, 2000). В результате была получена матрица присутствия/отсутствия фрагментов одинаковой длины (1 - есть/ 0 - нет).
Таблица 2
Последовательности праймеров, использованных в работе
Название праймера Последовательность праймера
NNC-18S10 AGGAGAAGTCGTAACAA
C26A GTTTCTTTTCCTCCGCT
atpB GACTCGCACTTGATTTCGTTGC
rbcL CGGGGTGTAGTAAGTCAATTTATA
trn V(UAC)x2 GTCTACGGTTCGARTCCGTA
ndhC ATTAGAAATGYCCARAAAATATCAT
rpl32 CAGTTCCAAAAAAACGTACTTC
trnL (UAG) CTGCT TCCTAAGAGCAGCGT
trnL CGAAATCGGTAGACGCTACG
trnF ATTTGAACTGGTGACACGAG
Полученная матрица была проанализирована методом кластерного анализа (UPGMA) в программе PAST (Hammer et al., 2001) с использованием меры сходства Жаккара, а также мето-
дом объединения ближайших соседей (Neighbor Joining, NJ) в программе SplitsTree4 (Huson, Bryant, 2006).
Таблица 3
Последовательности ISSR праймеров, использованных в работе (Y = T C (пиримидины), R = G A (пурины))
Название праймера Последовательность праймера
HB12 (CAC)3GC
HB13 (GAG)3GC
M13 (AGC)4(C/T)
M12 (CA)6RY
M10 (CA)6(A/G)G
M4 (AG)8(C/T)C
M2 (AC)8(C/T)G
M1 (AC)8CG
17899a (AC)6AG
Филогенетический анализ
Полученные нуклеотидные последовательности были выровнены с помощью алгоритма ClustalW в программе BioEdit (Hall, 1999), с последующей оценкой качества прочтения вручную. Индели учитывались как отсутствующие данные для всех образцов. Анализировались два финальных выравнивания: 1) по данным нукле-отидных последовательностей ITS1, 2; 2) все выравнивания для участков пластидной ДНК были объединены в одно общее выравнивание. Филогенетический анализ проводился в программе RaxML 8.2.12 (Stamatakis, 2014; Edler et al., 2021). Для ML-анализа использовалась модель GTR. В качестве внешней группы мы использовали полные хлоропластные геномы, выгруженные из GenBank, следующих видов: Onobrychis viciifolia (NC053934), O. gaubae (LC647182), Hedysarum polybotrys (MZ327727), H. petrovii (MT120797). Из геномов были вырезаны только те участки хпДНК, которые анализировались у исследуемых образцов E. subspinosa, и добавлены в общее выравнивание. Определение хлоропластных га-плотипов исследуемых образцов и их генеалогический анализ проводились методом статистической парсимонии (Templeton, Crandall, 1993) в программе TCS (Clement et al., 2000).
Результаты
Результаты секвенирования
Все последовательности, секвенированные из образцов KZ1 и KZ2, а также их спектры ISSR маркеров оказались полностью идентичными,
что подтвердило принадлежность обеих частей гербарного образца к одному и тому же растению. В дальнейшем анализе оба образца рассматривались как один под обозначением К71.
Длина выравнивания участка 1ТБ1, 2 составила 658 п. н. Последовательности 1ТБ1, 2 оказались идентичными для всех образцов, за исключением двух образцов К79 и К711 из Восточного Казахстана, которые отличались наличием одной нуклеотидной замены в 197 позиции (замена С на Т). Так как данный маркер оказался малоинформативным, дальнейшему филогенетическому анализу он не подвергался.
Длина полученных нуклеотидных последовательностей хлоропластных участков составила: 1) atpB-rbcL - 742 п. н.; 2) rpl32-trnL(UAG) - 550 п. н.; 3) ^пЬ-^пБ - 680 п. н.; 4) ШУ-пйкС - 401 п. н. Анализ объединенного выравнивания длиной 2373 п. н. проводили методом статистической парсимонии в программе ТС8. Программа рассчитала максимально возможное число мутационных шагов при 95%-й вероятности пар-симонического решения равным 20 и объединила все последовательности Е. subspinosa в одну сеть, сгруппировав их в 12 гаплотипов (рис. 3). В данном анализе мы не учитывали последовательности внешней группы, так как они оказались эволюционно далеки от исследуемой выборки, и программа не смогла объединить их в общую сеть вместе с гаплотипами Е. subspinosa.
Полученная сеть не имеет петель, что позволяет однозначно оценивать генеалогические связи гаплотипов. Большинство исследуемых образцов обладают своими собственными га-
плотипами, только к гаплотипам А и Б отнесено более 1 образца. Из 12 гаплотипов сети 5 оказались внутренними, т. е. связанными более чем с 1 гаплотипом, и 7 - концевыми. Большинство гаплотипов отличаются друг от друга большим (312) числом мутаций, за исключением группы из четырех внутренних гаплотипов (А, В, Б, Б), различия между которыми составляют всего одну мутацию. Согласно результатам укоренения (см. ниже), корень сети должен располагаться между внутренними гаплотипами Б и Б, разделенными единственной мутацией. Гаплотип Б, таким образом, оказывается корневым гаплотипом первой эволюционной линии и присутствует у двух образцов: КЕ10 из Таласской долины (Западный Тянь-Шань) и К29 из Сырдарьинского Каратау. Внутренний гаплотип А, производный от Б и отличающийся от него одной нуклео-тидной заменой, характерен для двух образцов из Кегульты (К1 и К2) и для всех шести образцов с г. Большое Богдо на западном краю ареала Е. выЬвртова. Внутренний гаплотип В отличается от гаплотипа А также одной нуклеотидной заменой и встречен у единственного образца из Кегульты. Четвертый образец из Кегульты обладает концевым гаплотипом С, производным от внутреннего гаплотипа В и отличающимся от него тремя мутациями. К первой эволюционной линии следует отнести и концевой гаплотип Е, производный от внутреннего (корневого) га-плотипа Б и отличающийся от него 12 мутационными шагами. Этот гаплотип был встречен у единственного образца (К211) из Казахстана с северо-западной оконечности хребта Каратау. Вторая эволюционная линия представлена га-плотипами в-Ь, производными от внутреннего гаплотипа Б и распространенными преимущественно в Центральном и Западном Казахстане. Большинство этих гаплотипов отличаются друг от друга большим числом мутаций, и все представлены в нашей выборке единичными образцами (табл. 1, рис. 1). Для укоренения сети мы проанализировали выравнивание гаплотипов Е. выЬвртова с включенными в него последовательностями внешней группы методом максимального правдоподобия в программе КахМЬ (рис. 4).
Все гаплотипы, как и ожидалось, оказались монофилетичны относительно внешней группы и образовали две самостоятельные клады: первая образована гаплотипами от А до Е включительно; во вторую кладу попали гаплотипы от Б до Ь. Несмотря на низкие значения бутстреп поддержек узлов, топология дерева оказалась
идентичной топологии сети, построенной методом статистической парсимонии. Таким образом, согласно результатам анализа, корень сети должен располагаться между гаплотипами Б и Б. Так как эти гаплотипы разделены всего одним мутационным событием, мы можем считать их в равной степени близкими к внешней группе. Соответственно, гаплотипы Е. выЫртова образуют и на сети, и на дереве две независимые эволюционные линии.
Рис. 3. Сеть гаплотипов объединенного выравнивания хлоропластных участков (atpB-rbcL, trnV-ndhC, rpl32-trnL, trnL-trnF) изученных образцов в программе TCS. Размер кружка пропорционален числу образцов, обладающих данным гаплотипом. Красные кружки - первая эволюционная линия, желтые кружки - вторая эволюционная линия. Обозначения: A, B, C, D, E, F, G, H, J, K, L - гаплотипы изученных образцов. Маленькие кружки соответствуют гипотетическим гаплотипам, отсутствующим в выборке. Стрелка обозначает положение внешней группы.
Анализ ISSR маркеров
ISSR-маркированию подверглись только те образцы, у которых наблюдалась устойчивая амплификация для всех 9 праймеров. Итоговая матрица включала 73 ISSR маркера и 14 образцов: K1, K2, K4, GB1-GB6, KZ1, KZ4, KZ8, KZ9, KZ10. 37 неинформативных маркеров, которые присутствовали или отсутствовали только у одного образца, были исключены из анализа. Кластерный (UPGMA) анализ разделил выборку на
два кластера (бутстреп поддержки 97 и 82, соответственно) (рис. 5). В первый попали все образцы из Казахстана и Киргизии, а во второй -образцы из Кегульты и с г. Большое Богдо. Второй кластер разделяется на два подкластера: а) все образцы с г. Большое Богдо (бутстреп поддержка 100); Ь) образцы из Кегульты (бутстреп поддержка 100). Все образцы первого подкласте-ра оказались идентичными и расположились на ветвях нулевой длины. Во втором подкластере
идентичными оказались только два образца из трех изученных, что указывает на генетическую неоднородность популяции из Кегульты. Этот результат хорошо согласуется с результатом анализа нуклеотидных последовательностей, где у образцов калмыцкой популяции из балки Кегульта обнаруживаются три хлоропластных гаплотипа, в то время как все шесть образцов астраханской популяции с г. Большое Богдо обладают одним единственным гаплотипом А.
Рис. 4. Результаты ML (Maximum Likelihood) анализа объединенного выравнивания в программе RaxML (-lnL= 5893.837035). Число вариабельных признаков 459, парсимонически информативных признаков 90. В узлах отмечены значения бутстрепа. Изученные образцы указаны с соответствующими гаплотипами. Пунктирная линия отделяет разные эволюционные линии. Образцы внешней группы показаны с номерами GenBank.
Рис. 5. Результаты кластерного анализа (UPGMA) 14 образцов по 73 ISSR маркерам в программе PAST со значениями бутстрепа (1000 реплик). Обозначения: 1 - образцы из Средней Азии (KZ); 2 - все остальные образцы (a - образцы с г. Б. Богдо (GB); b - образцы из балки Кегульта (K)).
Рис. 6. Результаты анализа межмикросателлитных (188К) маркеров для части изученных образцов методом №1дЬЬог}о1шпд в программе 8рШ8Тгее4 со значениями бутстрепа (1000 реплик): 1 - образцы из Средней Азии (К2); 2 - образцы с г. Б. Богдо ^В); 3 -образцы из балки Кегульта (К).
Полученная бинарная матрица также была проанализирована методом объединения ближайших соседей (Neighbor Joining, NJ) в программе SplitsTree4. Результаты показаны на рисунке 6. Все исследуемые образцы четко разделяются соответственно своим природным популяциям: 1) образцы из балки Кегульта; 2) образцы с г. Большое Богдо; 3) образцы из Средней Азии (Казахстан и Киргизия). Результат принципиально не отличается от результата кластерного анализа. Все три группы (г. Большое Богдо, Кегульта и образцы с территории основного ареала) значительно удалены друг от друга, причем разрозненные образцы из Казахстана и Киргизии все же ближе друг к другу, чем к образцам из Кегульты и с г. Большое Богдо.
Обсуждение
Несмотря на небольшой размер исследованной выборки, нам удалось выявить немало интересных аспектов генетической структуры популяций E. subspinosa. Во-первых, оказалось, что популяция с г. Большое Богдо в Астраханской области действительно генетически крайне изолирована и мономорфна как по хлоропластным, так и по ядерным маркерам. Мономорфность данной популяции по пластидному гаплотипу A не вызывает особого удивления, у многих видов растений локальные популяции не проявляют изменчивости по пластидным маркерам. Однако в данном случае наблюдается также идентичность всех шести изученных образцов по спектрам межмикросателлитных (ISSR) фрагментов, а это уже однозначно указывает на то, что исследованные образцы с г. Большое Богдо обладают одним генотипом и составляют популяцию, представляющую собой вегетативный клон. Наш результат подтверждает более ранние наблюдения других авторов (Voloboeva, Laktionov, 2018; Laktionov et al., 2021), которые указывали, что эверсмания на г. Большое Богдо редко образует плоды и размножается преимущественно вегетативно за счет длинных корневищ. Более того, О. В. Волобоева и А. П. Лактионов в ходе исследований E. subspinosa на г. Большое Богдо обнаружили две популяции этого вида. По их наблюдениям, особи, произрастающие на северных склонах, размножаются только вегетативно, в то время как растения склонов южной экспозиции обильно цветут и плодоносят. Вполне вероятно, что в нашей выборке были представ-
лены образцы только с северных склонов (Уо1о-Ьоеуа, Ьакйопоу, 2018). Также нужно отметить, что проведенные ранее исследования анатомической структуры плодов Е. subspinosa из разных популяций тоже показали некоторые отличия образца из популяции с г. Большое Богдо от образцов из Казахстана (Мнопоу, Боко1оу, 2000). При этом авторы отмечали, что семена в бобах растения с г. Большое Богдо были незрелыми. Полученный нами результат в совокупности с перечисленными выше данными свидетельствует о том, что эверсмания почти-колючая - преимущественно перекрестно опыляемый вид, скорее всего, не способный к самоопылению или апомиктическому завязыванию семян. Однако для более надежного вывода необходимо исследование большей по размеру выборки из разных частей локальной популяции с г. Большое Богдо.
Ярким контрастом популяции с г. Большое Богдо служит популяция с Ергеней из окрестностей п. Кегульта (Калмыкия). Это географически ближайшая к г. Большое Богдо популяция, причем представляющая собой крайне западную точку распространения вида. В подобной краевой популяции логично было бы также предполагать генетическую обедненность, однако это не так. У четырех исследованных из данной популяции образцов было выявлено три (!) разных, хотя и родственных пластидных га-плотипа (А, В и С), первый из которых общий с популяцией г. Большое Богдо, а два других представляют собой его прямых потомков и не были встречены более нигде. По ядерным межмикро-сателлитным маркерам (здесь было исследовано три образца из четырех) два образца, обладавшие одним и тем же пластидным гаплотипом А, оказались идентичными, а третий - отличным от них, что говорит о присутствии в популяции как вегетативного, так и семенного возобновления, вероятно, в результате перекрестного опыления. Вместе с тем, обе популяции, и с г. Большое Богдо, и из балки Кегульта, по всем типам маркеров достаточно далеки от популяций с территории Казахстана, в том числе и популяций Западного Казахстана (К73, К74, К75). Генетически (по пластидным маркерам) наиболее близкими к популяциям с западной окраины ареала Е. subspinosa и принадлежащими к общей с ними эволюционной линии оказались образцы К710 из Таласской долины в Киргизии и К79 и К711 из Сырдарьинского Каратау в Казахстане, представляющего собой продолжение Та-
ласского Алатау, вдающееся вглубь территории Казахстана в северо-западном направлении и служащее водоразделом рек Сырдарья и Талас. Все остальные исследованные нами образцы из Северо-Восточного и Западного Казахстана и Киргизии оказались принадлежащими к другой эволюционной линии. Однако для того, чтобы делать какие-либо определенные выводы об истории Е. выЬвртова, необходимо исследование существенно больших выборок из популяций со всей территории ареала этого вида.
Благодарности
Авторы благодарят куратора раздела Средней Азии Гербария БИН РАН (ье) Л. М. Раенко за помощь при работе с образцами и предоставленную возможность отобрать материал для генетических исследований.
Работа выполнена в рамках государственного задания ГБС РАН № 122042700002-6. Благодарим Министерство науки и высшего образования за поддержку ЦКП «Гербарий ГБС РАН», грант № 075-15-2021-678.
REFERENCES / ЛИТЕРАТУРА
Воrnеt В., Вrаnсhard М. 200l. Nonanchored Inter Simple Sequence Repeat (ISSR) Markers: Reproducible and Specific Tools for Gеnоmе Fingerprinting. Plant Mol. Biol. Reporter. 19: 209-215.
Вuntjеr J. В. 2000. Cross Checker: computer assisted sroring of genetic AFLP data. In: Plant & Animal Genome: VIlI Conference (San Diego, СА, January 9-12). URL: http://wheat.pw.usda.gov/jag/papers99/paper599/indexp599. html
Clement M., Posada D., Crandall K. A. 2000. TCS: A computer program to estimate gene genealogies. Mol. Ecol. 9: 1657-1659.
Edler D., Klein J., Antonelli A., Silvestro D. 2021. raxmlGUI 2.0: A graphical interface and toolkit for phylogenetic analyses using RAxML. Meth. Ecol. Evol. 12: 373-377. DOI: 10.1111/2041-210X.13512
Hall T. A. 1999. BioEdit: A user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symp. Ser. 41: 95-98.
Hammer О., Harper D. A., Ryan P. D. 2001. PAST: Palaeontological Statistics software package for education and data analysis. Palaeont. Electronica 4(1): 9.
Huson D. H., Bryant D. 2006. Application of Phylogenetic Networks in Evolutionary Studies. Molecular Biology and Evolution 23(2): 254-267.
Laktionov A. P. 2018. Ewersmannia Bunge. In: Flora Nizhnego Povolzhya [Flora of the Lower Volga]. Vol. 2. Moscow: KMK Scientific Press. P. 744. [In Russian] (Лактионов А. П. Ewersmannia Bunge // Флора Нижнего Поволжья. Т. 2. М.: Изд-во КМК, 2018. С. 744).
Laktionov A. P., Korolyuk A. Yu., Voloboeva O. V. 2021. Eversmannia subspinosa (Fabaceae), a new species to the flora of Kalmykia. Bot. Zhurn. 106(3): 303-305. [In Russian] (Лактионов А. П., Королюк А. Ю., Волобоева О. В. Eversmannia subspinosa (Fabaceae) - новый вид для флоры Калмыкии // Бот. журн., 2021. Т. 106, № 3. С. 303-305).
Laktionov A. P., Voloboeva O. V. 2021. Relic species of flora of the Bogdo-Baskunchak salt dome region. Natural Sciences 1: 54-62. [In Russian] (Лактионов А. П., Волобоева О. В. Реликтовые виды флоры Богдинско-Баскун-чакского солянокупольного района // Естественные науки, 2021. № 1. С. 54-62).
Mironov E. M., Sokolov D. D. 2000. A carpological study of Eversmannia subspinosa (Fisch. ex DC.) Fedtsch. (Le-guminosae, Hedysarae). Feddes Repertorium 111(1-2): 1-8.
Ovczinnikov P. N. 1978. Ewersmannia Bunge. In: Flora Tadzhikskoy SSR [Flora of Tajik SSR]. Vol. 5. Leningrad: Nauka. Pp. 503-504. [In Russian] (Овчинников П. Н. Род Ewersmannia Bunge // Флора Таджикской СССР. Т. 5. Л.: Наука, 1978. С. 503-504).
Sarkisova S. A. 1981. Ewersmannia Bunge. In: Opredelitel rasteniy Sredney Azii [Conspectus Florae Asia Mediae]. Vol. 6. Tashkent. Pp. 357-358. [In Russian] (Саркисова С. А. Род Ewersmannia Bunge // Определитель растений Средней Азии. Т. 6. Ташкент, 1981. С. 357-358).
Shaw J., Lickey E. B., Schilling E. E., Small R. L. 2007. Comparison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies in angiosperms: The tortoise and the hare III. Amer. J. Bot. 94: 275-288. DOI: 10.3732/ajb.94.3.275
Shorthouse D. P. 2010. SimpleMappr, an online tool to produce publication-quality point maps. In: SimpleMappr create free point maps for publications and presentations URL: https://www.simplemappr.net Accessed 14 September 2022].
Stamatakis A. 2014. RAxML version 8: A tool for phylogenetic analysis and post-analysis of large phylogenies. Bioinformatics 30: 1312-1313.
Svyazeva O. A., Kamelin R. V. 1986. Eversmannia subspinosa (Fisch. ex DC.) Fedtsch. In: Arealy derevyev i kustarnikov SSSR [Areas of trees and shrubs of the USSR]. Vol. 3. Leningrad. Pp. 50, 182. [In Russian] (Связева О. А., Камелин Р. В. Ареалы деревьев и кустарников СССР. Т. 3. Л., 1986. С. 50, 182.
Templeton A. R., CrandallK. A. 1993. Empirical tests of some predictions from coalescent theory with applications to intraspecific phylogeny reconstruction. Genetics 134: 959-969.
Vassilyeva L. I. 1987. Ewersmannia Bunge. In: Flora yevropeyskoy chasti SSSR [Flora Partis Europaeae URSS]. Vol. 6. Leningrad: Nauka. Pp. 86-87. [In Russian] (Васильева Л. И. Род Эверсмания - Ewersmannia Bunge // Флора европейской части СССР. Т. 6. Л.: Наука, 1987. С. 86-87).
Voloboeva O. V., Laktionov A. P. 2018. Biological-ecological features of Eversmannia subspinosa (DC.) Fedtsch. in the North-Eastern Caspian Sea region. In: Scientific and ecological education activities in the specially protected natural territories: current state and development prospects: materials of the All-Russian Scientific and Practical Conference with international participation, dedicated to the 20th anniversary of the State Nature Reserve "Bogdinsko-Baskunchaksky" (Akhtubinsk, April 19-21, 2018). Moscow. Pp. 38-44. [In Russian] (Волобоева О. В., Лактионов А. П. Биолого-экологические особенности Eversmannia subspinosa (DC.) Fedtsch. в северо-западном Прикаспии // Научная и эколого-просветительская деятельность на ООПТ: современное состояние и перспективы развития: Материалы Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, посвящ. 20-летию государственного природного заповедника «Богдинско-Баскунчакский» (г. Ахтубинск, 19-21 апреля 2018 г.). М., 2018. С. 38-44).
Voloboeva O. V., Laktionov A. P. 2019. Eversmannia subspinosa (Fabaceae) and its "floristic suite" as representatives of relict flora of salt-dome hills of the Northern Caspian. Rastitelnyy mir Aziatskoy Rossii [Plant life of Asian Russia] 3: 53-56. [In Russian] (Волобоева О. В., Лактионов А. П. Eversmannia subspinosa (Fabaceae) и ее «флористическая свита» как представители реликтовой флоры соляно-купольных возвышенностей Северного Прикаспия // Растительный мир Азиатской России, 2019. № 3. С. 53-56). DOI: 10.21782/RMAR1995-2449-2019-3(53-56)
Wen J., Zimmer E. 1996. Phylogeny and biogeography of Panax L. (the ginseng genus, Araliaceae): Inferences from ITS sequences of nuclear ribosomal DNA. Molec. Phylogen. Evol. 6: 167-177. DOI: 10.1006/mpev.1996.0069
Yanina T. A. 2012. Neopleystotsen Ponto-Kaspiya: biostratigrafiya, paleogeografiya, korrelyatsiya [Neopleistocene of the Ponto-Caspian: biostratigraphy, paleogeography, correlation]. Moscow. 264 pp. [In Russian] (Янина Т. А. Неоплейстоцен Понто-Каспия: биостратиграфия, палеогеография, корреляция. М., 2012. 264 с.).
