CC BY
66
■■■ ■ I I I I I I I 4. I ■ ■ TT1
Новости клеточных технологий
НОВОСТИ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ
КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ
Уникальная микроархитектоника тканевой ниши нейральных стволовых клеток млекопитающих
Соматические стволовые клетки (СК) — резиденты тканей взрослого организма — находятся в постоянном контакте со специфическим микроокружением, так называемой тканевой нишей (stem-cell niche), транслирующей внешние сигналы и регулирующей самообновление и дифференцировку СК. Ниша стволовых клеток представляет собой вполне определенную анатомо-физио-логическую единицу, включающую как сами СК, так и взаимодействующие с ними клетки, компоненты внеклеточного матрикса и источники нейрогуморальных регуляторных сигналов: сосудистую сеть и нервные окончания [1]. Однако трехмерная реконструкция этой многокомпонентной системы по данным микроскопии стандартных гистологических препаратов затруднена, поскольку многие важные структурные элементы теряются в срезах тканей. Данная проблема особо актуальна в случае воссоздания микроархитектоники ниши для нейральных стволовых клеток (НСК), где многочисленные отростки нейронов и глиальных клеток, разветвленные капилляры и молекулы внеклеточного матрикса создают чрезвычайно сложную сеть.
Постнатальный нейрогенез в головном мозге млекопитающих, включая человека, отмечается в двух специфических областях: субвентрикулярной зоне (СВЗ) боковых желудочков, где локализованы клетки-предшественники нейронов обонятельных луковиц, и субграну-лярной зоне (СВЗ) зубчатой извилины гиппокампа, где образуются гранулярные нейроны, участвующие в поддержании памяти [2]. Непрерывная фоновая пролиферация клеток в обеих областях происходит на протяжении всей жизни, постепенно угасая к старости [3]. Расположенная под слоем эпендимных (Е) клеток СВЗ — наиболее крупная нейрогенная область, которая содержит стволовые и дифференцирующиеся клетки. Так, редко делящиеся GFAP+ астроцитоподобные стволовые клетки (клетки типа В) дают начало активно пролиферирующим DLX2+ С-клеткам — транзитным амплифицирующимся клеткам. Последние образуют коммитированные к диф-ференцировке р-Ш-тубулин+ PSA-NCAM + DLX2+ ней-робласты (А-клетки), которые цепочками мигрируют в направлении обонятельной луковицы, где дифференцируются в ингибиторные нейроны.
Следует отметить, что в эмбриогенезе нейрогенные стволовые клетки — клетки радиальной глии — контактируют с полостью нервной трубки, откуда получают регуляторные сигналы, необходимые, в частности, для контроля асимметричного деления [4]. Лишь в постнатальном организме стволовые клетки перемещаются вглубь —
в субвентрикулярную зону, оказываясь отграниченными от желудочков слоем эпендимных клеток. Поэтому до недавнего момента оставалось неясным, каким образом внешние сигналы контролируют пролиферацию нейрогенных СВЗ-астроцитов, изолированных с одной стороны плотным эпендимным слоем, а с другой — гематоэнцефалическим барьером, непроницаемым для большинства регуляторных молекул.
Существенного прорыва в изучении структурной организации нейрогенных зон во взрослом головном мозге мышей удалось достигнуть тесно сотрудничающим группам исследователей под руководством A. Alvarez-Buylla, J.M. Garcia-Verdugo, F. Doetsch и S. Temple. Сразу три работы, опубликованные в сентябрьском номере журнала Cell Stem Cell, пролили свет на важные детали трехмерной структуры и функциональной регуляции ниши НСК. Визуализация взаимодействий в нише НСК стала возможной благодаря использованию современных подходов в сканирующей конфокальной микроскопии, позволяющих проводить анализ по всему объему гистологического среза (whole-mount imaging). В раннем совместном исследовании [5] с той же целью F. Doetsch, J.M. Garcia-Verdugo и A. Alvarez-Buylla использовали электронную микроскопию
Z. Mirzadeh с соавт. (группа Arturo Alvarez-Buylla) смогли выяснить несколько уникальных аспектов организации нейрогенной субвентрикулярной зоны. Во-первых, авторы обнаружили, что с полостью бокового желудочка апикальными мембранами контактируют три типа реснитчатых клеток: 1) нейрогенные В1 -клетки с короткой одиночной ресничкой, 2) эпендимные (Е1) клетки с множеством (около 50) длинных ресничек и 3) ранее не описанные эпендимные (Е2) клетки с двумя длинными ресничками и комплексными базальными тельцами. Авторы полагают, что реснички на апикальной мембране обнаруженных Е2-клеток могут служить сенсорами химических и механических сигналов, поступающих из циркулирующей в желудочках спинномозговой жидкости. Фенотип клеток также различался: на апикальной поверхности В1 -клеток отмечена экспрессия маркерной молекулы нейральных стволовых клеток GFAP (glial fibrillary acidic protein), а также нестина и CD133, в то время как Е1- и Е2-клетки были GFAP~/CD24+/S100р+. Контактирующие с боковым желудочком В1 -клетки были обнаружены только в латеральной и передней медиальной его стенках, в отличие от клеток эпендимы, выстилающих поверхность желудочков головного мозга. По всей видимости, субпопуляция апикальных астроцитов
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, № 1, 2009
■ И I II II
■тп
Новости клеточных технологий
присутствует в субвентрикулярной зоне головного мозга человека [6]. Наличие популяции апикальных В1-клеток, контактирующих с желудочком, было также подтверждено в исследовании группы S. Temple.
Особенно интересно, что апикальные поверхности В1-клеток и клеток эпендимы сгруппированы особым образом в кластеры, напоминающие цветок или колесо (pinwheel): в центре располагаются одна или несколько апикальных мембран В1-клеток, окруженных плотным кольцом эпендимных клеток. Отмечено, что контакты между В1 -клетками и В1- и Е-клетками, по-видимому, участвуют в контроле симметричного и асимметричного деления НСК, а также ответственны за формирование характерных колесовидных кластеров в постнатальный период. Таким образом, авторам удалось ответить на вопрос, каким образом нейрогенные астроциты, тела которых расположены в субвентрикулярной зоне, могут получать регуляторные сигналы из желудочка. Неудивительно, что В1 -клетки, контактирующие с желудочком своей апикальной мембраной, долгое время не удавалось обнаружить методами электронной микроскопии. Как оказалось, средняя площадь апикальной поверхности В1-клеток составляет 24,1 мкм2, что более чем в 10 раз меньше, чем площадь апикальной поверхности эпендимных клеток (265,0 мкм2). Поэтому до недавнего момента считалось, что хотя одиночные В1-клетки могут контактировать с полостью желудочка, такие взаимодействия скорее исключение, чем правило [7]. Однако, несмотря на малую площадь контакта, В1 -клетки составляют приблизительно одну треть от всех клеток, контактирующих с желудочком, и поэтому могут рассматриваться как важнейшая клеточная популяция эпендимного слоя.
Во-вторых, Z. Mirzadeh и коллеги подтвердили нейрогенные свойства популяции GFAP+ В1-клеток, контактирующих с желудочком [8]. Выяснилось, что в головном мозге взрослых мышей значительная часть этих клеток митотически активна, о чем свидетельствовала окраска фосфорилированного гистона НЗ (клетки в фазе митоза) и маркера пролиферации Ki67. Кроме того, генетически меченные GFAP+ В1-клетки образовывали нейробласты и дифференцировались в нейроны, астроциты и олигодендроциты in vivo и in vitro.
В-третьих, группа A. Alvarez-Buylla проследила судьбу длинных базальных отростков, отходящих от GFAP+ В1-клеток. Реконструкция крупных стеков изображений, полученных в результате конфокального сканирования латеральной стенки бокового желудочка 50-мкм толщины, показала, что абсолютное большинство (более 96 %) GFAP-позитивных астроцитов с базальным отростком также имеют апикальную поверхность, взаимодействующую с полостью желудочка, а их базальные отростки, в свою очередь, контактируют с поверхностью кровеносных сосудов. Более того, базальные отростки нейрогенных В1-клеток формируют каналы, по которым цепочками мигрируют дифференцирующиеся нейробласты. Таким образом, авторы работы продемонстрировали, что В1-клетки — стволовые клетки центральной нервной системы — обладают уникальной полярной организацией: апикальной поверхностью эти клетки взаимодействуют с полостью желудочка, а длинным базальным отростком — с эндотелием сосудов. Схожую морфологию имеют эмбриональные предшественники В1 -клеток — клетки радиальной глии [2], что еще раз подчеркивает их преемственность. С другой стороны, многополярные GFAP-позитивные В2-клетки, локализующиеся под пучками отростков нейрогенных астроцитов, в отличие
от последних, характеризуются сильно разветвленными, многочисленными отростками (Shen и коллеги в своей работе обозначили такие клетки как «В-клетки глубокого слоя»),
М. Tavazoie с соавт. (группа Fiona Doetsch) и Q. Shen с соавт. (группа Sally Temple) основное внимание уделили описанию взаимодействий клеток субвентрикулярной зоны с сосудистой сетью (так наз. сосудистая ниша НСК). Редко ветвящиеся сосуды в СВЗ расположены в одной плоскости прямо под эпендимным слоем, обычно на расстоянии 10^20 мкм от его поверхности (О. Shen с соавт.). Оказалось, что абсолютное большинство делящихся Ki67+ клеток субвентрикулярной зоны располагаются в непосредственной близости от сосудистого сплетения (преимущественно капилляров). Следует отметить, что в отличие от второй нейрогенной зоны головного мозга — субгранулярной [9], эндотелиальным клеткам сосудов в СВЗ не свойственна пролиферативная активность.
Используя трансгенных мышей, клетки которых экспрессируют флуоресцентный маркер GFP под контролем промотора гена GFAP, М. Tavazoie с соавт. выяснили, что лишь некоторые Ki-67-позитивные клетки представляют собой GFAP+ астроциты, около половины из которых (51,2%) напрямую контактирует с эндотелием сосудов. Shen с соавт. использовали дополнительный маркер LeX для визуализации нейрогенных В1-клеток и пришли к сходным результатам: около 70% GFAP+/LeX+ клеток находились в 5 мкм от сосудов. Для идентификации медленно делящихся НСК in situ авторы обоих работ вводили мышам ДНК-метку (бромодезоксиуридин, BrdU). Анализ, проведенный М. Tavazoie с соавт. через 6 нед. после введения метки показал, что 55,4% клеток, накапливающих BrdU (label-retaining cells), были локализованы вблизи сосудов, при этом среднее расстояние GFAP+/BrdU+ стволовых клеток до сосудов составило 11,2 мкм. Аналогичный результат (55,5% BrdU-накапливающих клеток в 10 мкм от сосудов) получила группа S. Temple (анализ проводился через 24 сут). Еще ближе к сосудистой сети субвентрикулярной зоны (8,8 мкм) находились транзитные амплифицирующие-ся С-клетки, экспрессировавшие EGFR и Mashl (в исследовании О. Shen с соавт. 44% С-клеток с фенотипом LeX+/GFAP~ локализовались в 5 мкм от поверхности сосудов). С другой стороны, разветвленные цепочки DLX2+/ PSA~/NCAM+ нейробластов лишь в некоторых местах приближались к сосудам, в целом формируя собственную независимую сеть. Только в дорсальной части СВЗ сосуды сопровождали цепочки нейробластов, мигрирующих в направлении обонятельной луковицы.
М. Tavazoie с соавт. показали, что молекулярные факторы, присутствующие в периферической крови, могут проникать через стенки сосудов в субвентрику-лярную зону и таким образом регулировать функциональную активность НСК и клеток-предшественников. Так, в СВЗ и других перивентрикулярных областях боковых желудочков активно накапливались введенные в общий кровоток молекулы флуоресцеина (376 Да). Особенно важным оказался тот факт, что в местах контакта сосудов с клетками субвентрикулярной зоны гемато-энцефалический барьер характеризуется повышенной проницаемостью. Действительно, в некоторых местах сосуды лишены оболочки из перицитов (1\Ю2+/десмин+) и ножек астроцитов (экспрессируют аквапорин-4). Интересно, что 38% С-клеток контактировали с сосудами именно в тех местах, где отсутствовали астроцитарные ножки, а 70% EGFR+ С-клеток — в местах, где не было перицитарной оболочки. Кроме того, было обнаружено,
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 1, 2009
■ ИМИ!
Новости клеточных технологий
что Z0-1 + плотные контакты между эндотелиальными клетками, обеспечивающие низкую проницаемость ге-матоэнцефалического барьера [10], также могут отсутствовать на небольших участках сосудов.
Исследования группы S. Temple позволили выяснить, какие молекулы обеспечивают контакт стволовых В1-клеток с эндотелием сосудов субвентрикулярной зоны. Оказалось, что —бр1-интегрин; — рецептор к ла-минину, одному из основных компонентов базальной мембраны, окружающей сосуды, активно экспрессируется на LeX+/GFAP+ клетках, расположенных вблизи сосудов, а также на LeX+ клетках нейросфер, образующихся при культивировании нейрональных клеток-пред-шественниц. Более того, введение антител, блокирующих связывание —6-интегрина с молекулами ламинина, в боковые желудочки взрослых мышей приводило к откреплению клеток от сосудов и стимулировало их пролиферацию, что свидетельствовало о функциональной значимости контакта нейральных стволовых клеток с базальной мембраной сосудов ¡n vivo.
Взаимодействие с сосудами также оказалось необходимым для клеточной регенерации в субвентрикулярной зоне (группа F. Doetsch). Пролиферация стволовых клеток, вызванная гибелью С-клеток и нейробластов под действием цитозин-р-0-арабинофуранозида (Ага-С), была тесно ассоциирована с сосудистой сетью (более 60% BrdU+ клеток непосредственно контактировали с сосудами).
Стоит отметить, что ассоциация с эндотелиальными клетками сосудов была обнаружена и для других тканеспецифических стволовых клеток, к примеру, для гемо-поэтических стволовых клеток [11] и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток [12]. Взаимодействие с сосудами, по-видимому, требуется для более эффективного распознавания сигналов, поступающих от циркулирующих в крови молекулярных факторов.
Таким образом, нейральные стволовые клетки могут получать регуляторные сигналы от двух источников. Во-первых, апикальная поверхность НСК может служить сенсором растворимых факторов, присутствующих в спинномозговой жидкости боковых желудочков. Во-вторых, длинные отростки, отходящие от базальной части, контактируют с базальной мембраной сосудов, где могут воспринимать сигналы от эндотелиальных и пери-васкулярных клеток (например, VEGF, FGF2, IGF1, BDNF), базальной мембраны (ламинин) и небольших молекул, циркулирующих в крови. Взаимодействие НСК с сосудами происходит в уникальных сайтах, которые лишены типичных структур гематоэнцефалического барьера и поэтому проницаемы для молекул, присутствующих в кровяном русле.
Обнаружение высокопроницаемых участков сосудистого эндотелия, с которыми контактируют НСК и клетки-предшественники, в субвентрикулярной зоне говорит о повышенной чувствительности нейрогенных клеток к химическим агентам, присутствующим в периферической крови, как лекарственным, так и токсическим, что следует в дальнейшем учитывать при разработке и тестировании лекарственных препаратов. Кроме того, изучение тонких механизмов контроля функциональной активности стволовых клеток в естественном микроокружении открывает новые возможности для регенеративной медицины. В частности, большие надежды возлагаются на неинвазивные терапевтические подходы, предполагающие модуляцию активности эндогенных СК in situ посредством введения специфических фармакологических агентов и рекомбинантных факторов [13]. Поэтому первостепенную значимость для дальнейших исследований представляет обнаружение конкретных молекулярных факторов, способных проникать к клеткам субвентрикулярной зоны из крови и спинномозговой жидкости и регулировать активность НСК.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Scadden D.T. The stem-cell niche as an entity of action. Nature 2006; 441 [70971: 1075-9.
2. Doetsch F. The glial identity of neural stem cells. Nat. Neurosci. 2003; 6(111: 1127-34.
3. Luo J., Daniels S.B., Lennington J.B., Notti R.Q., Conover J.C. The aging neurogenic subventricular zone. Aging Cell 2006; 5t2): 139-52.
4. Kosodo Y., Riiper K., Haubensak W. et al. Asymmetric distribution of the apical plasma membrane during neurogenic divisions of mammalian neuroepithelial cells. EMBO J.; 23(111: 2314—24.
5. Doetsch F., GarcHa-Verdugo J.M., Alvarez-Buylla A. Cellular composition and three-dimensional organization of the subventricular germinal zone in the adult mammalian brain. J. Neurosci. 1997; 17[131: 5046-61.
6. Sanai N.. Tramontin A.D., Quicones-Flinojosa A. Unique astrocyte ribbon in adult human brain contains neural stem cells but lacks chain migration. Nature 2004; 427[69761: 740—4.
7. Doetsch F., GarcHa-Verdugo J.M., Alvarez-Buylla A. Regeneration of a germinal layer in the adult mammalian brain. PNAS 1999; 96C201: 11619-24.
8. Doetsch F., Caillfi I., Lim D.A., GarcHa-Verdugo J.M., Alvarez-Buylla A. Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. Cell 1999; 97[61: 703—16.
9. Palmer T.D., Willhoite A.R., Gage F.H. Vascular niche for adult hippocampal neurogenesis. J. Comp Neurol. 2000; 425C41: 479—94.
10. Abbott N.J., Riinnbflck L., Flansson E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat. Rev. Neurosci. 2006; 7C11: 41—53.
11. Kiel M.J., Yilmaz O.H., Iwashita T. et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 2005; 121 [71: 1109—21.
12. Crisan M., Yap S., Casteilla L. et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell 2008; 3[31: 301-13.
13. Lindvall 0., Kokaia Z. Stem cells for the treatment of neurological disorders. Nature 2006; 441 [70971: 1094—6.
Подготовил А А. Лелявский
По материалам: Mirzadeh Z„ Merkle F.T., Soriano-Navarro M„ García-Verdugo J.M., Alvarez-Buylla A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell 2008; 3(3): 265-78. Tavazoie M„ Van der Veken L„ Silva-Vargas V. et al. A specialized vascular niche for adult neural stem cells. Cell Stem Cell 2008; 3(3): 279-88. Shen G„ Wang Y., Kokovay E. et al. Adult SVZ stem cells He in a vascular niche: a
quantitative analysis of niche cell-cell Interactions. Cell Stem Cell 2008:3(3): 289-300
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, hl< 1, 2009
