CC BY
85
46
Оригинальные исследования
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
УНИКАЛЬНАЯ БЕТА-ПОДОБНАЯ ДНК-ПОЛИМЕРАЗА ИЗ ХРОМАТИНА КЛЕТОК ОСТРОГО МИЕЛОИДНОГО ЛЕЙКОЗА ЧЕЛОВЕКА HL-60
А.А. Бухвостов 1, А.П. Орлов 2, О.А. Шаталов 3, Д.А. Кузнецов 24
1 Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова, Москва
2 Российский Национальный Исследовательский Медицинский Университет им. Н.И. Пирогова, Москва, Россия
3 Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Д. Рогачева, Москва, Россия
4 Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, Москва
unique beta-like DNA polymerase from хроматин of human acute myeloid leukemia HL-60 cells
AA. Buchvostov1, A.P. Orlov s, O.A. Shatalov 3, DA. Kusnetsov 24 11.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Moscow, Russia
2 N.I. Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow, Russia
3 D. Rogachev Federal Scientific Clinical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology, and Immunology, Moscow, Russia
4 N.N. Semenov Institute of Chemical Physics of RAS, Moscow, Russia
Предложена оригинальная экстракционно-хроматографическая методика выделения мономерной ДНК-полимеразы бета из хроматина клеток миелоидного лейкоза человека HL-60. Степень очистки фермента составила 1:122000 относительно общего белка клетки. Обнаружено, что фермент обладает рядом свойств, позволяющим отнести его к семейству ДНК-полимераз бета (КФ 2.7.7.7).Так, он обеспечивает процессирование коротких последовательностей однотяжевой ДНК (200—250 нуклеотидов), ИЭТ = 8,45, для него характерны гиперактивация в присутствии 200 mM KCl, высокая устойчивость к N-этилмалеимиду (0,5 mM) и амфидиколину (4—5 мг/мл), полное отсутствие следов 3', 5'-экзонуклеазной активности. Уникальность фермента связана с отсутствием четвертичной структуры, молекулярной массой (66,5 кДа) и выраженным преобладанием альфа-спиралей в нативной глобуле. Обсуждается роль фермента в канцерогенезе и его возможное значение как мишени для атаки со стороны ингибиторов — цито-статиков.
Ключевые слова: ДНК-полимераза бета, миелоид-ный лейкоз, клетки HL-60, ферменты-мишени в лечении рака.
Human acute myeloid leukemia cells HL-60 over expresses a beta-like DNA polymerase (EC 2.7.7.7) which is found to be a chromatin associated single subunit protein (66.5 kDa) purified by original extraction/gel filtration procedure allowing to gain the 122,000-fold purification degree as corrected to a total cell protein. The enzyme possesses some key DNA pol в-specific catalytic properties such as the processing of short (200—250 n) single strand DNA sequences, activation in the presence of 200 mMKCl, resistance to N-ethyl-melamide and Aphidicolin, lack of 3',5'-exonuclease activity. A possible significance of the unique enzyme studied as a target for its pharmaceutical inhibitors is under discussion.
Key words: DNA polymerase, myeloid leukosis, HL-60 cells, target enzymes in cancer treatment.
Введение
ДНК-полимераза бета (КФ 2.7.7.7 — ДНК-полимераза р), представляет собой популяцию богатого и разнообразного семейства ДНК-полимераз. Отличительная особенность ДНК полимеразы р связана с ее участием в репарации однотяжевых фрагментов ДНК [1—4]. Доказано, что, будучи хро-матин-связанными белками [4—5], большинство видов ДНК-полимераз р гиперэкспрессивны во многих злокачественных опухолях [6—12]. Это делает ферменты данной группы легитимными мишенями для ингибиторов-фармакофоров или, точнее, для атаки химиотерапевтических агентов с высокой аффинностью к ферменту [13—17].
Последнее обстоятельство привлекает внимание не только энзимологов, но также онкологов и фармакологов [14, 18, 19]. Однако, широкое структурное разнообразие видов ДНК-полимераз р, выделенных
е-mail: [email protected]
из нормальных и раковых клеток, диктует необходимость детальной, структурной и функциональной (каталитической) характеристики каждого, как правило опухоль-специфического вида ферментов этой группы.
В большинстве случаев образцы ДНК-полимеразы Р являются Mg2+-зависимыми ферментами, имеющими изоэлектрическую точку в диапазоне 8,3—8,7 и молекулярную массу 35—55 кДа [19—21]. Роль этих особых ферментов заключается в том, чтобы с относительно небольшой скоростью, что исключает появление ошибок считывания, синтезировать цепи однотяжевой ДНК, длина которых не превышает 300 нуклеотидов (восстановление ДНК, репарация). Эти ферменты обнаруживают высокую устойчивость к таким ингибиторам большинства ДНК-полимераз (ДНК-полимеразы альфа, гамма, эпсилон и т.д.) как амфидиколин и W-этилмеламид [19, 22]. Полное
Гены & Клетки Том IX, № 2, 2014
Оригинальные исследования
47
отсутствие 3',5'-экзонуклеазной активности также является отличительным признаком ДНК полимеразы р [20-24].
С другой стороны, существует целый ряд примеров ферментов с типичной для ДНК-полимераз р каталитической активностью, особенности структуры которых (например, исключительно высокие — до 260 кДа — величины молекулярной массы) отличаются от критериев,считающихся идентификационными. Для таких ферментов предложен термин «бета-подобные ДНК-полимеразы» [7, 23, 24]. Более того, сам размер молекулы ДНК-полимеразы Р может быть критическим параметром в структурной организации хроматина, влияя на контроль экспрессии генома, что особенно важно для ферментов с молекулярной массой выше 100 кДа [5, 24].
Хотя исследования ДНК-полимеразы р имеют уже 20-летнюю историю, список опухолей, для которых известны структурно-функциональные особенности экспрессированных в них ферментов этого типа, следует признать весьма неполным. В частности, одна из распространённых злокачественных опухолей крови, острый миелоидный лейкоз человека (ОМЛ), до настоящего времени не изучалась в этой связи. Настоящая работа посвящена восполнению этого пробела.
Целью настоящего исследования является выяснение вопроса о том, имеет ли место гиперэкспрессия ДНК-полимеразы р в клетках острого миелоидного лейкоза HL-60 и если да, то каковы структурно-функциональные особенности данного фермента, как возможной мишени для воздействия ингибиторами-цитостатиками.
Материал и методы
Культура клеток. Клеточная линия острого миелоидного лейкоза HL-60 получена из Венгерского Банка Клеток (Венгерский Институт Пастера, СегедNCBI, код C427). Клетки находились в виде суспензии при температуре +37°C при 5% CO2 в среде RPMI 1640 (Gibco, США) с 10% FBS (Biowest, Франция) и антибиотиками: 100 E/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Gibco, США). Процедура пассажей и мониторинга жизнеспособности клеток осуществлялась по методу, описанному A. Olins с соавт. (2000) [25], и модифицированному M. Roy с соавт. (2004) [26].
Выделение хроматина. Клетки осаждали центрифугированием при 12000 об/мин в течение 20 мин ( + 4°C). Осадки суспензировали и гомогенизировали в 5 объемах 15 mMT рис-HCl (pH 7,8)/20 mMMg Cl2 /250 mM сахарозы/1,5 mM ЭДТА, используя стеклянный гомогенизатор Поттера с плотно пригнанным тефлоновым пестиком (1800 об./мин).
Гомогенаты фильтровали через 5-слойные грубоволокнистые целлюлозные фильтры, после чего фильтраты центрифугировали при 800 дв течение 30 мин ( + 4°C). Осадки ресуспендировали в 10 объемах 15 mM Tris-HCl (pH 8,0)/1,5 mM ЭДТА/ 10 mMMg Clg/1,5 mM KCl/25 mM сахарозаы/ 20 мкг/мл трипсина (w/v) и инкубировали при +37°C в течение 1 ч с последующим центрифугированием при 800 д, 40 мин ( + 4°C). Полученные таким образом осадки (фракция P0.8), так называемые «грубые ядра», использовали в дальнейшем для выделения хроматина и нуклеоплазмы.
Для получения образцов нуклеоплазмы часть материала фракции P0.8 обрабатывали Тритоном X-100
(2%, v/v) и затем центрифугировали при 150000g в течение 2 ч при +4°C в роторе SV40.2 (OptimaL-90K Ultracentifuge, Beckman Coulter, США).
Для выделения хроматина фракции P0.8 гомогенизировали в 5 объемах 15 mM Tris-HCl (pH 7,6)/2% Тритона X-100(v/v)/10 mMMg Cl2/ 2,5 mM KCl/2,5 mM ЭДТА/0,02% глутатиона (Merck, Германия)/0,05 гепарина (Serva Heidelberg, Германия) при +4°С. Гомогенаты подвергали обработке нуклеазой S (80—100 E/мл, Worthington, США) и рибонуклеазой А (50 мкг/мл, Fluka, Швейцария) в течение 60 мин при +37°С. Затем образцы центрифугировали при 150 000 g в течении 2 ч ( + 4°C) в ротореSW 27.1, Spinco L5-75B Ultracentrifuge (Beckman, Австрия). Полученные осадки суспендировали в 6—7 объемах (w/v) 25 mM Tris-HCl (pH 8,0)/3,0 mM ЭДТА/5,0 mM NaCl / 1,l% 2-меркаптоэтанола (v/v) при 50°C в течение 1 ч с последующей фенол-хлороформной экстракцией белка. С этой целью использовали смесь фенола и хлороформа (1:1, w/v),насыщенную 20 mM Tris-HCl (pH 7,6)/2,5 mM NaCl/1,5 mM ЭДТА/0,25% DMSO/1% 2-меркаптоэтанолом [27, 28]. Фазы бе-лок-содержащего экстракта отбирали и смешивали с 10 объемами ацетона при 0°С, после чего инкубировали при +4°С в течение 12 ч. Ацетон-нерас-творимый материал осаждали центрифугированием (20000 об./мин, 20 мин, +4°C). Осадки затем тщательно отмывали ацетоном на фиберглассовых фильтрах Millipore HJ08 (Millipore, США) и растворяли в 5—6 объемах (w/v) 25mM калий-фосфатного буфера (pH 6,30)/0,5% NaCl/1,5 mM ЭДТА/0,01% глутатиона/0,05% гепарина/1,0% 2-меркаптоэта-нола/80—100 U/mL нуклеазы S, а потом инкубировали в течение 40 мин при +37°C. Затем образцы подвергали ультразвуковой обработке (80 КГц, 30 мин, +60°C) и насыщали (при помощи ступенчатого 30—70% градиента) сульфата маммония, далее центрифугировали при 12000 об/мин в течение 20 мин и растворяли в 10 объемах 15 mM калийфосфатного буфера (pH 6,0)/0,2% NaCl. Растворы подвергали диализу в 20 mM калий-фосфатном буфере (pH 6,2) для удаления избытка сульфата аммония ( + 4°C, 12—16 ч). Получаемые образцы лиофилизировали для дальнейшего использования на следующем этапе очистки выделяемого фермента (гель-фильтрация). Данная процедура является модификацией метода, описанного D. Voss с соавт. (1967) [27], и усовершенствованного M. Lerman с соавт. (1976) [28].
Гель фильтрация. Лиофилизированные порошки растворяли в 15 mM калий-фосфатном буфере (pH 6,30)/5,0 mM MgCl2/1,5 mM ЭДТА/0,0001% азида натрия и пропускали через фиброглассовые фильтры с диаметром пор 0,3—0,4 ^ (Millipore 5R, Millipore, США). Прозрачные растворы подвергали ультрафильтрации на мембранах с пределом молекулярной эксклюзии, равным 25 кДа, при 800 psi (Diaflo Y25, Amicon BV, Нидерланды). К фильтратам добавляли 2-меркаптоэтанол до конечной концентрации 1,0% (v/v). Получаемые образцы концентрировали в роторном испарителе, доводя их конечный объем до 1,5—2,5 мл.
Образцы наносили на колонку размером 1,8x70 см, заполненную гелем TOYOPEARLHW 55F и уравновешенную 15 mM калий-фосфатным буфером (pH 6,30)/5,0 mM MgClg/0,0001% азидом натрия. Скорость элюции — 0,8 мл/мин (при комнатной
Гены & Клетки Том IX, № 2, 2014
48
Оригинальные исследования
температуре). Для регистрации поглощения при 280 нм использовали УФ-детектор. В каждой из последовательно элюированных фракций объемом 2,0 мл измеряли удельную каталитическую активность ДНК-полимеразы р по методу, описанному ранее [29, 30]: оценивали скорость включения де-зокситимидинтрифосфата (дТТФ) в растущие цепи однотяжевых ДНК, отнесенную на 1 мг чистого фермента (см. ниже). Количество белка определяли с помощью колориметрического метода Бредфорда [31].
Колонку калибровали, используя стандартный набор белковых маркеров DXL400 (Serva Heidelberg, GmbH, Германия):12,5 kDa (цитохром c), 24 кДа (трипсин), 45 кДа (яичный альбумин), 70 кДа (ЧСА), 145 кДа (L- аспарагиназа).
Электрофорез. Электрофорез белков. Для определения молекулярной массы и степени очистки фермента использовали SDS-PAGE анализ по методу Лэмли [32].Состав разделяющего геля: 10% ПААГ/20 mM Tрис-mицин (pH 8,30)/0,5% додецил-сульфат натрия(размеры пластины 0,1 х100х100 мм, напряжение 180 V). Для калибровки гелей использовали набор белковых маркеров QR 460/5 с величинами молекулярных масс от 12,5 до 120,0 кДа (Miles Laboratories, США).
Электрофорез ДНК. Использовали рутинную процедуру 2,0% агарозного гель-электрофореза [33]. Для определения размеров синтезированных de novo однотяжевых цепей ДНК использовали маркеры полиШТ), 200 —300 (Calbiochem — Novabiochem International, Inc., США).
Изоэлектрическое фокусирование белков (ИЭФ). Для определения изоэлектрического фокусирования белков использовали линейный понижающий градиент рН (10,0—3,0) в ПААГ-пластинах с размерами 1,0x80x80 мм (Koma Biotech, Ltd., Республика Корея) по методу, описанному J. Walker (1994) [34], и модифицированному R. Katoh (2011) [35]. В отдельных сериях экспериментов использовали также иммобилизованные на целлофановой основе пластины ПААГ с размерами 0,12x260x125 мм, содержащие линейный понижающий градиент рН — 10,0—3,0 Pharmalyte EQ108 (Health Care Europe, GmbH, Германия) [36]. В последнем случае нефиксированные гели использовали после проведения ИЭФ для выявления и количественной оценки 3',5'-экзонуклеазной активности во фракциях ДНК-полимеразы р [36, 37]. Эти же процедуры изоэлектрического фокусирования применяли для получения и анализа белковых профилей субклеточных фракций(хроматина и нуклеоплазмы), выделенных из клеток HL-60 и из миелоцитов здоровых взрослых доноров-мужчин [27, 28] (контроль на уровень экспрессии фермента). Все доноры подписывали развернутое информированное согласие.
Измерение активности ДНК-полимеразы
Использовали стандартную инкубационную среду [22], содержащую 0,25 мкмоль [Метил-1,2-3Ж дТТФ (90—120 Ки/ммоль, NET520A, New England Nuclear, Inc., США) и оптимизированную по величинам рН в диапазоне 6,0—9,0 и по концентрации хлорида магния (5,0—50,0 1Т|М).Оптимизированную инкубационную среду предварительно инкубировали при +37°C в течение 60 мин. Затем 5,0—7,5 мкг чистого фермента добавляли к инкубационной среде ещё на 60 мин при +37°C. В контрольных тестах
образцы инкубировали при 0°C 60 мин после предварительной инкубации. В качестве дополнительного контроля использовали образцы, обработанные трипсином (Merck GmbH, Германия), 20 мкг/мл, + 37°C, 60 мин.
После окончания инкубации концентрацию NaCl в каждом из образцов доводили до 1,0 Ми помещали их в ледяную ванну (0°C). Через 30 мин образцы пропускали через мембраны Millipore FG 600 (диаметр пор 0,2—0,4 д, Millipore, США).Фильтраты обрабатывали ледяным 2-метиленпентан-2,4-диолом (МПД), доводя его конечную концентрацию до 16,0% (v/v). Сверхмалое количество ДНК в полученном растворе затем было подвергнуто количественной экстракции с использованием набора Accu Prep Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer Corp., Республика Корея) по методу, описанномуТ. Mikami с соавт.(2004) [38], и модифицированному K. Haratianс соавт. (2007) [39].
ДНК-содержащие экстракты использовались затем для электрофоретического определения размеров цепей однотяжевых ДНК, синтезированных выделенным ферментом [33]. Для определения величин суммарной [3Ж-радиоактивности этих ДНК использовали стандартную диоксановую сцин-тилляционную систему (Wallac 2200LXLS Counter, WallacOY, Финляндия). Величину удельной каталитической активности ДНК-полимеразы р выражали в количестве [3H] дТТФ, включенного в растущие цепи однотяжевых ДНК в течение 1 мин, отнесенном на 1 мг чистого фермента, т. е. ([3H] имп./мин)/мг белка. Определение микроколичеств белка проводили по методу, описанному Т. Fukami с соавт. (1996) [40]. Измерение микроколичеств ДНК осуществляли по методу, описанному W. Muller с соавт. (1974) [41].
Для выявления известной устойчивости ДНК-полимеразы р к W-этилмеламиду (0,5 mM, Sigma, США) и амфидиколину (5,0 дд/mL, Fluka, Швейцария) была проведена отдельная серия тестов, как рекомендовано в работе K. Sakaguchi с соавт. (1985) [22]. Ингибиторы добавляли к образцам до начала предварительной инкубации. Также тестировали влияние на активность фермента высокой концентрации KCl (200 mM) и дидезокситимидинтрифос-фата (ддТТФ, 2,5 мкМ, Serva Heidelberg, GmbH, Германия). Для отрицательного контроля использовали образцы, обработанные трипсином (20 мкг/мл, Fluka, Швейцария), добавленным до начала предварительной инкубации.
Основные кинетические константы, K..(мМ) и K _ ([м^д^Ф/мин^мг фермента), определяли по величине скорости истощения пула свободного дТТФ [42], для мониторинга за которым применяли ЖХВД анализ ацетон-растворимых фракций пре- и постин-кубированных образцов. Применявшийся в этом случае хроматографический режим включал следующие параметры: колонка Altex 1800E (18x220 мм)/ста-ционарная фаза ODS-S5CN/подвижная фаза — 10— 60% линейный градиент пиридина на основе 10% водного метанола/2,000 p.s.i., +22°C/WatersDL600 HPLCAnalyticalSystem [42, 43].
Спектрометрия. Для оценки нативности выделенного фермента использовали стандартные версии метода сканирующей УФ-спектрофотомерии (Lambda 1050 ScanningSpectrophotometer, PerkinElmer, Inc., США) и метода спектрометрии кругового дихроизма (КД-спектрометрия) (J815 CD Spectrometer, JASCO, Inc., США). Для обработки данных использовали
Гены & Клетки Том IX, № 2, 2014
Оригинальные исследования
49
пакет программного обеспечения SpectraManager 2А (JASCOInc., США).
Результаты и обсуждение
Предложенная нами процедура позволяет выделить высокоочищенный 66,5 к Дамономерный белок (рис. 1), обладающий выраженной каталитической ДНК-полимеразной активностью и способный синтезировать отрезки ДНК в пределах 200—250п (рис. 1A). Выделенный высокоочищенный фермент обладает следующими свойствами: ИЭТ = 8,45 (рис. 1Б, В, Д), pH-оптимум 8,0, оптимальная концентрация иона-драйвера — 15 mM. Кинетические константы,
определённые по скорости утилизациид ТТФ, равны Km = 0,016 mM, Kcat = 0,622 [мкМдТТФ/мин.]/мг белка.
Изучаемый фермент гиперэкспрессирован в клетках острого миелоидного лейкоза HL-60 по сравнению с нормальными миелоцитами и обладает прочной связью с хроматином, но не с нуклеоплаз-мой (рис. 1Д). В ИЭФ экспериментах обнаружено полное отсутствие 3',5'-экзонуклеазной активности у очищенного фермента [36, 37].
УФ-спектрофотомерия выделенного фермента показывает не только отсутствие таких примесей как поли- и олигонуклеотиды, но также и подтверждает факт нативности белка [44] (рис. 2).
Рис. 1. Разделение белков хроматина из клеток hl-60 на колонке toyopearlhw 55f и последующая оценка физико-химических свойств и каталитической активности выделенной ДНК-полимеразы р. Колоночная гель — хроматография: синяя линия — А280, красная линия — удельная каталитическая ДНК-полимеразная активность.
А — электрофорез ДНК в агарозном геле: 1, 3 — коммерческие маркеры однотяжевой ДНК; 2 — фрагменты ДНК, процессированные выделенной из хроматина клетокHL-60 ДНК-полимеразой р.
Б, В — ИЭФ очищенного фермента (бета — подобной ДНК-полимеразы) и коммерческих маркеров.
Г — SDS — РАЭЕанализ: 1 — коммерческие маркеры; 2-5 — очищенный фермент (5,0; 1,0; 0,5; 0,1 мкг/гель).
Д — ИЭФ продуктов фракционирования ядер клеток HL-60 и миелоцитов здоровых доноров: 1 — маркер, кислый гликопротеин плазматической мембраны клеток HeLa; 2 — маркер, гистон Н1А клеток HeLa; 3 — ДНК-полимераза р из хроматина ядер клеток HL-60; 4, 6, 7 — суммарный белок хроматина ядер миелоцитов здоровых доноров;
5 — суммарный белок ядер клеток HL-60; 8, 9 — суммарный белок хроматина ядер клеток HL-60; 10 — суммарный белок нуклеоплазмы ядер клеток HL-60
УФ-спектры поглощения ДНК-полимеразой в из хроматина клеток HL-60
Гены & Клетки Том IX, № 2, 2014
50
Оригинальные исследования
Высокий уровень нативности выделенного фермента и преобладание в его глобуле альфа-элементов вторичной структуры [44] видны из данных КД-спектрометрии (рис. 3).
Фермент, будучи устойчивым к амфидиколину и N-этилмеламиду, чувствителен к такому ингибитору как ддТТФ. Высокая концентрация KCl (200 mM) ведет к резкому увеличению его каталитической активности (табл.).
Рис. 3. Спектр кругового дихроизма бета-подобной ДНК-полимеразы, выделенной из хроматина клеток HL-60 (pH 8.0)
Каталитическая активность бета-подобной ДНК-полимеразы, выделенной из хроматинаклеток HL-60: воздействие ингибиторов и KCl
Испытываемые реагенты Активность ДНК-полимеразыр, ([3Н]ДНК имп/мин)/ мг белка n = 6 (M± m)
Амфидиколин, 5,0 мкг/мл 30,789 ± 398
N-этилмалеимид, 0,5 mM 27,632 ± 437
dd^, 2,5 мкМ 1,370 ± 186
Трипсин, 20 мкг/мл 207 ± 16
KCl, 200 mM 74,613 ± 441
Без добавления реагентов (оптимальная инкубационная среда) 29,838 ± 322
Единственная причина, по которой обнаруженный нами фермент следует называть именно бета-подобной ДНК-полимеразой, а не просто ДНК-полимеразой р, является необычно большая величина его молекулярной массы (66,5 кДа) (см. рис. 1) в сочетании с отсутствием четвертичной структуры у этого белка. Только это делает данный фермент исключением из соответствующей терминологической конвенции [1, 2, 19—21]. Для таких редких и особенных случаев и был специально предложен термин «бета-подобная ДНК полимераза» [45—47].
Сравнение результатов определения величин молекулярной массы выделенного фермента, полученных методами (а) гель-фильтрационной хроматографии низкого давления (условия сохраняют активность фермента), и(б) SDS-PAGE анализа (жесткие денатурирующие условия)не обнаруживает различий в величинах молекулярной массы (66,5 кДа) (см. рис. 1). Эти данные подтверждают мономерную природу фермента, т.е. отсутствие четвертичной структуры, что само по себе привлекает внимание как исключительно редко встречающаяся особенность представителей семейства ДНК-полимераз р [1—12, 18].
С другой стороны, многие специфические признаки ДНК-полимеразы р («таксономические критерии»), такие как способность к гиперактивации в присутствии 200 mMKCl [22], высокая устойчивость к амфидиколину и W-этилмеламиду [19, 22, 24], сравнительно небольшой размер синтезируемых фрагментов ДНК (до 300 n) [1, 3 , 4, 24], полное отсутствие 3', 5'-экзонуклеазной активности [2, 5, 20, 45], медленный темп роста синтезируемой цепи ДНК (низкая процес-сивность) [1, 10, 12, 18] ясно показывают, что выделенный нами фермент принадлежит именно к группе ДНК-полимераз р (см. рис. 1, см. табл.).
Обе измеренные кинетические константы говорят о медленно протекающем катализе, означающем высокую точность считывания информации с матриц, необходимую для эффективной репарации ДНК — т.е. для обеспечения единственной функции ДНК-полимераз р [1, 10, 12, 18, 47].
Что же касается установленного нами значения ИЭТ [8, 45], Mg2+ зависимости и чувствительности к ддТТФ выделенного фермента (см. рис. 1, см. табл.), то эти свойства являются общими для всех представителей обширного семейства ДНК-полимераз, включая и группу ДНК полимераз р [13,19, 22].
Выделенный фермент гиперэкспрессирован в опухолевых клетках по сравнению с нормальными (см. рис. 1Д). Это согласуется с довольно противоречивыми данными о важной роли ДНК-полимераз р в канцерогенезе [6—17]. Некоторые из этих данных лежат в основе концепции цитостатического эффекта, достигаемого направленным выключением функции ДНК-полимераз р в опухоли как части химиотерапии рака, сфокусированной на избирательном ингибировании фермента-мишени [14,17—19]. С позиций этого подхода детальное изучение очищенной ДНК-полимеразы р, выделенной из раковых клеток, представляется практически такой же задачей, как и поиск опухоль-специфических молекулярных мишеней для аффинных фармакофоров [13, 16, 17].
Поскольку ранее отмечалась положительная корреляция между выраженностью неблагоприятного клинического прогноза солидных опухолей и некоторых лимфобластных лейкозов с гиперэкспрессией ДНК полимераз р в этих опухолях [7—12], то понятным является внимание фармакологов
Гены & Клетки Том IX, № 2, 2014
Оригинальные исследования
51
к возможности применения специфических ингибиторов ферментов этой группы в качестве цитоста-тиков [13—17]. При этом большинство таких инги-биторов-цитостатиков относятся к синтетическим антиметаболитам дезоксирибонуклеозидтрифосфа-тов [14, 18—19]. Фармакологический потенциал этих ингибиторов выглядит сомнительным в свете разнообразных данных об их токсичности [14, 17—19]. Однако некоторый оптимизм в этой связи может быть связан с результатами исследований, свидетельствующих о высокой избирательности ингибиторов ДНК-полимераз из клеток некоторых лейкозов человека и животных, относящихся к группе олигогетероциклических металлоорганических соединений, обладающих низкой токсичностью [48— 49]. Таким образом, поиск возможных цитостатиков среди ингибиторов ДНК полимераз семейства бета представляется целесообразным в тех случаях, когда есть убедительное доказательство гиперэкспрессии этих ферментов в клетках опухолей.
Говоря о молекулярном механизме цитостатического действия ингибитора ДНК-полимераз р опухолевых клеток, важно отметить, что его ключевым моментом является подавление репарации ДНК [1—4]. Исключительная важность этого обстоятельства определяется тем, что в бурно растущих опухолях нарастает частота появления ошибок транскрипции, за удаление которых и отвечают ферменты семейства ДНК полимераз р [6—10]. Подавление же каталитической активности последних лишает клетку опухоли возможности элиминировать дефекты фрагмента экспрессируемого генома, что уменьшает уровень выживания злокачественных клеток [17—19].
Следует отметить и то, что хроматографический этап нашей методики очистки фермента позволяет полностью избавиться от примесей гистонов и пептидных ингибиторов ДНК-полимераз (см. рис. 1).
Спектры УФ поглощения указывают на некоторые особенности ДНК-полимеразы р (рис. 2). Так, нет заметного поглощения в диапазоне, близком к 210 нм (пептидная связь) при pH 5,2, в то время как максимум поглощения зарегистрирован при pH 8,3. Поскольку рН-оптимум фермента равен 8,0, а ИЭТ = 8,45 (см. рис. 1Б, В, Д), то логично ожидать, что этот белок покажет высокий уровень нативности при УФ-спектрофотометрии его растворов с pH 8,3. Таким образом, отсутствие поглощения при 210 нм (pH 5,2) отражает ограниченный «мягкий» мисфолдинг, происходящий в кислой среде [44]. Рост поглощения в области 280 нм (радикалы ароматических аминокислот) имеет умеренно-низкий профиль, что отличает данный белок от большинства тканевых белков вообще, делая особенно контрастным мощный пик А225. Очень значительный уровень поглощения в этой области (225 нм), проявляющийся при любых значениях рН (см. рис. 2), определяется, вероятно, вкладом триптофана и диаминомонокарбоновых аминокислот, характерным для многих белков хроматина [44].Спектры поглощения очищенного фермента в ультрафиолетовой области выглядят необычно для большинства белков из-за низкой интенсивности поглощения, регистрируемого при длине волны 280 нм. Отметим, что это уникальная структурная особенность выделенного нами фермента, и она способна служить его идентификационным критерием.
Отсутствие же поглощения при 280 нм (см. рис. 3), вероятно, говорит о незначительном вкладе
ароматических аминокислот в первичную структуру данного фермента. Такая особенность первичной структуры ранее отмечалась для ряда белков хроматина нормальных и опухолевых клеток [44]. При этом вклад гетероциклических аминокислот, включая триптофан, в структуру этих белков обычно значителен, что и проявляется интенсивным поглощением при длине волны 225 нм [44, 50]. Ограниченный дефол-динг белковой глобулы, достигаемый при значениях рН 5,2 и 8,3 (см. рис. 3,) также соответствует ожидаемым спектральным характеристикам, типичным для белков, не содержащих поверхностно расположенных ароматических радикалов, поглощающих при 280 нм [51].Данные УФ-спектрофотометрии, так же, как и данные КД-спектрометрии (см. рис. 3), говорят о нативности фермента при pH, близких к 8,0 и высокую степень очистки белка.
Топология полученного КД-спектра является типичной для «дальних» УФ (190—240 нм) и показывает нативность вторичной структуры белка с доминированием альфа-спиралей, включающей незначительное количество бета-складок [44, 52]. Такие спектры зависят от асимметрии окружающих пептидных групп и показывают наличие вторичной структуры белка, вид структуры и ее количество [44]. Пептидные группы оптически возбуждаются в «дальних» УФ частотах при длинах волн около 200— 220 нм. КД-спектры ароматических остатков выражены при 250—280 нм, хотя «хвосты» этих спектров могут доходить до области 220 нм [44, 52].
Итак, выделенный фермент — это альфа-структурный мономер с типичной для белков хроматина основной ИЭТ. Последнее обстоятельство определяется высоким содержанием положительно заряженных диаминомонокарбоновых аминокислот, Lys и Arg (см. рис. 1Б, В, Д; см. рис. 2, 3). Поверхностное, УФ-доступное, расположение остатков Trp (см. рис. 2), как правило расположенных на терминальных участках альфа-структур, обычно означает прочную глобулярную конструкцию, обогащенную альфа-спиралями [44, 50], что хорошо соответствует нашим результатам (см. рис. 2) и данным литературы [50].
Выводы
Таким образом, следует считать, что в клетках острого миелоидного лейкоза человека (HL-60) имеет место опухоль-специфическая гиперэкспрессия ассоциированной с хроматином p-подобной ДНК полимеразы (КФ 2.7.7.7), отличающейся от большинства известных ферментов этого типа отсутствием четвертичной структуры и большой молекулярной массой (66,5 кДа) каталитически самодостаточного мономера.
Структурно-функциональные особенности обнаруженного и выделенного фермента позволяют рассматривать его в качестве возможной молекулярной мишени для действия аффинных фармакофоров, т. е. ингибиторов, тормозящих процессы репарации ДНК в клетках опухоли.
Для полной очистки фермента была предложена оригинальная экстракционно-хроматографическая методика, включающая этапы нуклеазной обработки хроматина, фенол-хлороформной экстракции белка, ступенчатого градиента насыщения сульфатом аммония, ультрафильтрации, диализа и гель-проникающей колоночной хроматографии низкого давления.
Гены & Клетки Том IX, № 2, 2014
52
Оригинальные исследования
ЛИТЕРАТУРА:
1. Dianov G.L., Parsons J.L. Coordination of DNA single strand break repair. DNA Repair2007; 6: 457—60.
2. Parsons J.L., Dianova I.I., Khoronenkova S.V. et al. USP47 is a deubiquitylating enzyme that regulates base excision repair by controlling steady-state levels of DNA polymerase beta. Mol. Cell2011; 41: 609-15.
3. Grieseking S., Bergen K., Di Pasquale F. et al. Human DNA polymerase beta mutations allows efficient abasic site bypass. J. Biol. Chem. 2011; 286: 4011-20.
4. Kidane D., Jonason A.S., Gorton T.S. et al. DNA polymerase beta is critical for mouse meiotic synapsis. EMBO J. 2010; 29: 410-23.
5. Aves S.J., Liu Y., Richards T.A. Evolutionary diversification of eukaryotic DNA replication machinery. In: McNeil S., editor. Subcellular Biochemistry Series. Dordrecht - Heidelberg-New York: Springer; 2012. p. 19-36.
6. Falcieri E., Cataldi A., Di Baldassarre A. et al. Morphological patterns and DNA polymerase regulation in apoptotic HL-60 cells. Cell Struct. Funct. 1996; 21: 213-20.
7. Bergoglio V., Pillare M.J., Lacroix-Triki M. Deregulated DNA polymerase beta induced chromosome instability in tumorogenesis. Cancer Res. 2002; 62: 3511-14.
8. Albertella S., Lau A., O'Connor M.J. The over expression of specialized DNA polymerases in cancer. DNA Repair 2005; 4: 583-93.
9. Lang T., Dalal S., Chikova A. The E29K DNA polymerase beta gastric cancer - associated variant interferes with base excision repair and induces cellular transformation. Mol. Cell Biol. 2007; 27: 5587-96.
10. Dalal S., Chikova A., Jaeger J. et al. The Leu22PRO tumor-associated of DNA polymerase beta is DRP lyase deficient. Nucl. Acids Res. 2008; 36: 411-8.
11. Yang J., Parsons J., Nikolay N.H. et al. Cells deficient in the base excision repair protein, DNA polymerase beta. Oncogene 2010; 29: 463-8.
12. Ljungmann M. The DNA damage response - repair or despair?Environ. Mol. Mutat. 2010; 51: 879-89.
13. Kodvanj L., Aranyi J., Fesus N. et al. Chromatin associated DNA polymerases and their inhibitors. In: Attorjai I., Madi A., editors. Protocols in Mammalian Genome Research. Miskolc-Sztged-Budapest: Miskolc University Press; 2004. p. 449-68.
14. Mizushina Y. Specific inhibitors of Mammalian DNA polymerases.Biosci. Biotechnol. Biochem. 2009; 73: 1239-51.
15. Ljungmann M. Targeting in the DNA damage response in cancer. Chem. Rev. 2009; 109: 2929-36.
16. Martin S., McCabe N., Mullarkey M. et al. DNA polymerases as potential therapeutic targets in cancers. Cancer Cell, 2010; 17: 235-48.
17. Sanjeev B., Aneja R., Sarkar F.N. et al. DNA polymerase beta as a novel target for chemotherapeutic intervention of colorectal cancer. PLoS ONE, 2011; 6: e16691.
18. Rechkunova N.I., Lavrik O.J. Nucleotide excision repair in higher eucaryotes. Subcell. Biochem. 2010; 50: 251-77.
19. Roettger M.P., Bakhtina M., Kumar S. et al. Catalytic mechanism of DNA polymerases. In: Rahr A., Wilhelmie P., editors. Comprehensive Natural Products. Part 2. Amsterdam:Elsevier; 2010. p. 349-83.
20. Sobol R.W., Horton J.K., Kohn R. et al. Requirement of mammalian DNA polymerase beta in base - excision repair. Nature 1996; 379: 183-6.
21. Podulitsky A.J., Dianova I.T., Podust V.N. Human DNA polymerase beta inhibits DNA synthesis during long-patch repair of reduced AP sites in DNA. EMBO J.2001; 20: 1477-82.
22. Sakaguchi K., Boyd J.B. Techniques for purification and characterization of DNA polymerase beta. J. Biol. Chem. 1985; 260: 10406-11.
23. De Recondo A.M., Frayssient C. High molecular weight DNA polymerase of LF hepatoma. Purification and properties. Biochim. Biophys. Acta 1975; 407: 133-46.
24. Btard W.A., Willson S.H. Structure and mechanism of DNA polymerase beta. Chem. Rev. 2006; 106: 361-82.
25. Olins A.L., Hermann H., Lichter P. et al. Retinoic acid differentiation of HL-60 cells promotes cytoskeleton polarization. Exp. Cell Res. 2000; 254: 130-42.
26. Roy M.R., Thalang V.N., Trakoontivakom G. et al. Mechanism of mahanine - induced apoptosis in human leukemia cells tHL-60).
Biomed. Pharmacol. 2004; 67: 41-51.
27. Voss D.O., Plaut G.W.E., Hagihara H.et al. Fractionation of chromatin compounds isolated from the Mammalian neoplastic cell nuclei. Meth. Enzymol.1967;10: 326-41.
28. Lerman M.I., Abakumova E.V., Podobed O.V. Isolation and properties of the DNP- and RNP-particles from the Ehrlich ascite carcinoma cells. In: Orekhovich V.N., editor. Advanced Methods in Biochemistry. Moscow: Meditsina Publ;1976. p. 74-89.
29. Matsumoto Y., Kim K. The nuclear DNA polymerases beta: activity shifts and the DNA gaps beta - elimination control. Science 1995; 269: 699-702.
30. Piersen C.E., Prasad R., Wilson S.H. et al. Evidence for an imino intermediate in the DNA polymerase beta deoxyribose phosphate excision reaction J. Biol. Chem. 1996; 271: 1781-5.
31. Bradford M.M. An improved colorimetric technique for protein measurement. Analyt. Biochem. 1976; 72: 348-54.
32. LaemmliU.L.An efficient polyacrylamide gel electrophoresis system for proteins separation. Nature 1970; 227: 690-5.
33. Reichman M.E., Rice S.A., Thomask C.A. et al. Further examination of the molecular weight and size of deoxyribonucleic acid. J. Amer. Chem. Soc. 1957; 76: 3047-53.
34. Walker J.M. Isoelectric focusing of proteins in polyacrylamide gels. In: Walker J.M., editor. Methods in Molecular Biology. Series B. Berlin-Heidelberg: Springer; 1994. 32: p. 59-65.
35. Katoh R. Analytical Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. Berlin - Dortrecht - Heidelberg: Springer; 2011.
36. Gorg A., Postel W., Westermeyer R. Ultrathin-layer isoelectric focusing in polyacrylamide gels on cellophane. Analyt. Biochem. 1978; 89: 60-70.
37. Rule G.S. Quantitative assay of deoxyribonuclease activity after isoelectric focusing in polyacrylamide gels. Analyt. Biochem. 1984; 138: 99-106.
38. Mikami T., Satoh N., Hatayama I. et al. The inhibition effect of buthioninesulfoximine on cytopathic effect and apoptosis induced by human echovirus 9. Arch. Virol. 2004; 149: 1117-28.
39. Haratian K., Shahrabadi M.S., Sardari S. Buthioninesulfoximine inhibits cytopathic effects and apoptosis induced by infection with AIK-HDC strain of measles virus. Iran. Biomed. J. 2007; 11: 229-35.
40. Fukami T., Uchiyama K., Yoshimura Y. et al. Ultramicroanalysis by use of light-scanning photoacoustic densitometry of electrophoresed protein in human hair. Analyt. Biochem. 1996; 238: 60-4.
41. Muller W.E., Obermeyer J., Totsuka A. et al. Influence of template inactivators on the binding of DNA polymerases to DNANucl. Acids Res. 1974; 1: 63-74.
42. Varfolomeyev S.D. Enzymatic catalysis: kinetics, catalytic site structures, bioinformatics. In: Burlakova E.V., Varfolomeyev S.D., Zaikov G.E., editors. Chemical and Biological Kinetics. Part 2. Biological Kinetics. Moscow: Chemistry Publ; 2005. p. 175-214.
43. Kuznetsov D.A., Govorkov A.V., Zavijalov N.V. et al. Estimation of the nucleotide contents and ratios in a cell-free translation system. J. Biochem. Biophys. Methods1986; 13: 53-7.
44. Finkelstein A.V., Ptitsyn O.V. Physics of Proteins. Moscow:University Publishing House tUPB); 2005.
45. Kornberg A., Baker T.A. DNA Replication.2nd ed. New York: Nucleic Acids Research Science Books Publishers; 2005.
46. Nunthawarasilp P., Petmitr S., Chavalitshewinkoon-Petmitr P. Partial purification and characterization of DNA polymerase beta-like enzyme from Plasmodium falciparum. Mol. Biochem. Parasitol. 2007; 154: 141-7.
47. Sungchul J. Molecular Theory of a Living Cell. New York-Dordrecht-Berlin: Springer; 2012.
48. Орлов А. П., Кузнецов Д.А., Чехонин В.П. и др. Бета-подобная ДНК-полимераза клеток HL-60. Онкогематология. 2011; 2: 47.
49. Fallahi M., Amirshahi N., Roumyantsev S.A. Non-Markov population dynamics in the anti-cancer drugs pre-clinical trial strategy. Bulletin of RSMU 2010; 3: 11-7.
50. Dolgikh D.A., Lebedev Y.O., Tiktopulo E.I. et al. Spectroscopy methods in protein structure studies. In: Radchenko A.V., Kharms E.S., editors. Advanced Techniques in Molecular Biology and Biophysics. Kiiv: Naukova Dumka; 2000. p. 101-122.
51. Naidoo K.J., Brady J., Field M.J. et al. Modelling molecular structure and reactivity in biological systems. Cambridge [UK]: Royal Society of Chemistry; 2006.
52. Dolgikh D.A., Abaturov L.V., Bolotina I.A. et al. Compact state of a protein molecule with pronounced small - scale mobility. Biophys. J.1985; 13: 109-21.
Поступила 17.06.2014
Гены & Клетки Том IX, № 2, 2014
