CC BY
31
Журнал фундаментальной медицины и биологии краткие сообщения
УДК 57.085.23
АТИПИЧНАЯ ß-ПОДОБНАЯ ДНК-ПОЛИМЕРАЗА КЛЕТОК
РЕТИНОБЛАСТОМЫ КАК МИШЕНЬ ДЛЯ СПИН-СЕЛЕКТИВНЫХ ИНГИБИРУЮЩИХ ЦИТОСТАТИКОВ
Бухвостов А.А.1, Павлов К.А.1, Ермаков К.В.1, Сидорук К.Н.1, Рыбакова И.В.2,
Кузнецов Д.А.1, Румянцев С.А.2
ФГБОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет
имени Н. И. Пирогова» МЗ РФ Кафедра медицинских нанобиотехнологий Медико-биологического факультета 2Кафедра онкологии, гематологии и лучевой терапии Педиатрического факультета Россия, 197997, Москва, ул. Островитянова, 1 [email protected]
Реферат
Доказано, что клетки ретинобластомы человека WERI-RB-1 и Y-79 содержат уникальные, необычные по структуре и свойствам ß-подобные репарационные формы ДНК-полимеразы. Будучи мономерами с молекулярной массой 23,5 кДа, что весьма необычно для семейства ДНК-полимераз ß, эти, ассоциированные с хроматином, белки обладают основными отличительными функциональными особенностями ДНК-полимераз семейства ß, что делает их мишенями для действия цитостатиков, подавляющих репарацию ДНК в опухолях.
Обнаружено, что эти опухоль-специфичные ферменты чувствительны к магнитным изотопным эффектам, индуцированным ионами 25Mg2+, 43Ca2+ и 67Zn2+, что снижает процессивность действия этих ферментов и, как следствие, приводит к образованию укороченных фрагментов ДНК (50n—100n), непригодных для репарации. В сочетании со спин-селективным ингибированием активности обнаруженных ферментов это способствует проявлению цитостатических свойств изученных изотопов, что связано с их магнитными изотопными эффектами. При этом отмечено наличие положительной корреляции между наблюдавшимися магнитными изотопными эффектами и параметрами летальности клеток, определенными по данным МТТ-тестирования, что свидетельствует о значительном фармакологическом потенциале магнитных изотопов ряда двухвалентных металлов как безопасных и эффективных цитостатиков.
Ключевые слова: ретинобластома; цитостатики; ДНК-полимераза ß; магнитные изотопные эффекты.
AN ATYPICAL p-LIKE DNA POLYMERASE OF RETINOBLASTOMA CELLS AS A TARGET FOR SPIN-SELECTIVE INHIBITORY CYTOSTATICS
Bukhvostov A.A.1, Pavlov K.A.1, Ermakov K.V.1, Sidoruk K.N.1, Rybakova I.V.2,
Kuznetsov D.A.1, Rumyantsev S.A.2
Russian national research medical University named after N. I. Pirogov department of medical nanobiotechnology of Biomedical faculty 2Department of Oncology, Hematology and radiotherapy of Pediatric faculty 1, Ostrovityanova str., Moscow, 197997, Russia [email protected]
Abstract
WERI-RB-1 and Y-79 human retinoblastoma cell lines were found possessing atypical, very unusual in both structural and functional properties, p-like DNA Polymerases. Being 23.5 kDa monomers, which itself
краткие сообщения
Журнал фундаментальной медицины и биологии
v4
is rather unique for DNA Polymerases P family, these chromatin associated proteins show all major DNA Polymerase P specific peculiarities which makes them the legitimate targets for cytostatics capable to suppress the DNA repair processes in tumors. It has been also found that these cancer specific enzymes are sensitive to Magnetic Isotope Effects (MIE) induced by 25Mg2+, 43Ca2+ and 67Zn2+ ions leading to enzymatic processivity decrease and, consequently, to formation of shorted (50n— 100n) DNA fragments totally insufficient for the DNA repair purpose. Along with a spin-selective inhibition of catalytic activity of these enzymes this means the MIE-related revealing of cytostatic outcome promoted by the isotopes studied. Noteworthy, there is a marked positive correlation between MIE observed and the MTT-elucidated cell lethality patterns which is in a favor of conclusion stated an existence of essential pharmacological potential of some bivalent metal magnetic isotopes introduced as the safe and efficient cytostatics.
Keywords: retinoblastoma; cytostatics; DNA Polymerase P; magnetic isotope effects.
Введение
Как следует из полученных за последнее десятилетие данных, определенные эпигенетические факторы, такие как репарация поврежденной ДНК, необходимо учитывать в создании эффективных подходов к лечению ретинобластомы [1, 2]. Высокая частота ошибок репликации в клетках многих опухолей определяет особую роль процессов репарации ДНК для обеспечения выживания раковых клеток [3]. Это привлекает внимание к ДНК-полимеразам в (ЕС 2.7.7.7), семейству репарационных ДНК-полимераз [1, 3]. Обнаружено, что эти ферменты гиперэкспрессированны в ряде новообразований, причем уровень этой гиперэкспрессии обычно коррелирует с вероятностью фатального прогноза для онкологических больных [4].
Таким образом, ферменты, связанные с репарацией ДНК, можно считать мишенями для их специфических ингибиторов, действие которых способно понизить выживаемость раковых клеток [1-4]. Магнитный изотопный эффект (МИЭ), производимый ионами некоторых двухвалентных металлов, может оказывать противоопухолевое воздействие при замещении эндогенного Mg2+ в каталитических центрах ДНК-полимеразы. МИЭ - это не что иное, как воздействие «магнитного», т.е. обладающего некомпенсированным ядерным спином, изотопа металла, которое влияет на каталитические функции фермента в сравнении с эффектом, обеспечиваемым «немагнитными» изотопами того же химического элемента [2].
В настоящей работе нами обнаружены некоторые необычные и фармакологически перспективные (МИЭ-мишени) свойства в-подобных ДНК-полимераз, впервые выделенных нами из хроматина клеток ретинобластомы человека.
Материалы и методы исследования
В стандартных условиях культивировали две линии клеток ретинобластомы человека, WERI-RB-1 и Y-79 (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия); для мониторинга состояния культуры проводили рутинный анализ пролиферации на основе МТТ-теста. Связанную с хроматином фракцию в-подобной ДНК-полимеразы выделяли из образцов клеточных лизатов в условиях сохранения нативности белка с использованием модифицированной нами методики, состо-
ящей в рутинном выделении ядер из лизатов клеток (800g х 3,20 мин, +4°С), в выделении фракции хроматина [5] и в обработке хроматина Тритоном Х100/ДТТ, фенол-хлороформом/сульфатом аммония/нуклеазой S с последующей гель-фильтрацией на колонке 1,5 х 90 см со стационарной фазой TOYOPEARL HW 55F [6].
Каталитическую активность ß-подобной ДНК-полимеразы определяли по количеству [Метил-1,2-3Н] дТТФ (90-120 Ки/ммоль, NET520A, NEN), включенного в растущие цепи ДНК, и выражали в (имп/мин [3Н] ДНК)/мг белка. Количество белка определяли методом [7], а количество ДНК - методом [6]. Использовали стандартные ингибиторы ферментов: ддТТФ, 2,5 мкМ (Boehringer-Mannheim, Германия); Афидиколин, 5,0 мкг/мл (Serva-Гейдельберг, Германия); N-этилмеламид, 0,5 мМ (Sigma-Aldrich, США); KCl, 200 мМ (Sigma-Aldrich, США) [6]. Кинетические константы, Km (мМ) и Kcat ([мкМдТТФ/мин]/мг чистого фермента) определяли по величине скорости истощения пула свободного дТТФ, для мониторинга за которым применяли ЖХВД-анализ (стационарная фаза ODS-CN, 2000 p.s.i., пиридин-метанол 10:1, колонка Altex 150LQ, хроматограф Shimadzu MLJ-800) ацетон-растворимых фракций пре- и постинкубированных образцов, отобранных в процессе определения активности ß-подобной ДНК-полимеразы [8].
Электрофоретическое исследование белков (SDS -PAGE) и электрофоретическое фракционирование ДНК в агарозном геле проводили для оценки молекулярной массы/чистоты выделенного фермента и длины синтезированных этим ферментом фрагментов ДНК соответственно [6]. Для обнаружения 3'-5'-экзо-нуклеазной активности в образцах очищенного фермента использовали традиционный метод [9].
При проведении исследования использовали: 25MgCl2, 43CaCl2 и 67ZnCl2 изотопной чистоты 96,897,7% (GammaLab AS., Испания), [Метил-1,2-3Н]дТТФ с удельной активностью 90-120 Ки/ммоль, NET520A (New England Nuclear, Inc., США); агарозу, не содержащую дезоксирибонуклеазу (Helicon Co., Великобритания); этидиум бромид (AppliChem AG., Швеция); наборы маркеров однотяжевых ДНК, 30и-550и (SibEnzyme Ltd., Россия); AccuPrep набор для экстракции микроколичеств ДНК (Bioneer Ltd., Корея); и RX5[3H] - пленки для авторадиографии гелей (Fuji Corp., Япония).
При оценке активности ферментов использовали оптимальные уровни концентраций двухвалентных
pV Журнал фундаментальной медицины и биологии
краткие сообщения
металлов [2, 6]. Для определения величин суммарной [3Н]-радиоактивности синтезированных de novo ДНК использовали стандартную диоксановую сцинтилля-ционную систему (Wallac 2200LX LS 48 Counter, Wallac OY, Финляндия). Тритиевую авторадиографию агароз-ных гелей, фиксированных после фракционирования новосинтезированных фрагментов ДНК, проводили согласно описанному в [5].
Результаты исследования
Будучи практически идентичными по основным структурно-функциональным характеристикам (таблица), ферменты, выделенные из обоих исследован-
ных типов клеток, являются низкопроцессивными, о чем свидетельствуют кинетические константы: WERI-RB-1, Кт = 0,010 мМ, Ксаг = 0,418 (мкМ дТТФ/мин)/ мг фермента; Y-79, Кт = 0,013 мМ, Ксаг = 0,394 (мкМ дТТФ/мин)/мг фермента. Следует отметить, что низкая процессивность является одним из таксономических критериев ДНК-полимераз семейства в [6].
Максимально достижимые размеры фрагментов ДНК, синтезируемые ферментами из обеих клеточных линий в присутствии оптимальной концентрации (20 мМ) «магнитных» изотопов, составляли 50и-100и, что значительно меньше размеров фрагментов ДНК, синтезируемых в тех же условиях в присутствии «немагнитных» изотопов (250и-350и), и что также указы-
Таблица
Каталитические свойства ß-подобных ДНК-полимераз клеток ретинобластомы человека
Характеристика фермента Тип клетки
Y-79 WERI-RB-1
Четвертичная структура нет нет
Молекулярная масса, кДа 23.5 23.5
ИЭФ 8.20 8.50
Km, мМ (дТТФ) 0.013 0.010
Kcat, мкМ ([мкМ дТТФ/мин]/мг ферментного белка ) 0.394 0.418
3',5'-экзонуклеазная активность нет нет
KCl (200 мМ) ф2.2 ф1.8
ддТТФ (2.5 мкМ) Ф28.0 Ф33.8
Афидиколин (5.0 мкг/мл) нет нет
N-этилмеламид (0.5 мМ) нет нет
Магнитный Изотопный Эффект* 25Mg2+ Ф1.9 Ф2.2
43Ca2+ Ф2.7 Ф2.5
67Zn2+ Ф3.0 Ф2.4
*МИЭ выражается как удельная каталитическая активность р-подобных ДНК-полимераз, измеренная в присутствии «магнитных» изотопов двухвалентных металлов, отнесенная к величине удельной каталитической активности этих же ферментов, измеренной в присутствии того же количества (20 мМ) «немагнитных» изотопов тех же элементов [10-12].
вает на принадлежность этих ферментов к семейству ДНК-полимераз р [3, 6].
В экспериментах с р-подобными ДНК-полимера-зами из двух линий клеток нами выявлено (таблица) выраженное (в 1,9-3,0 раза) ингибирование каталитической активности, соответствующее уровню МИЭ.
Кратность увеличения величин уровней летальности клеток как функция МИЭ при их инкубировании с исследованными изотопами составила для Y-79: 1,85±0,08 (2^)/2,06±0,09 (43Са)/3,43±0,10 (6^п); для WERI-RB-1: 2,66±0,10 (2^)/4,04±0,15 (43Са)/3,21±0,18 (6^п).
Обсуждение результатов
Высокая устойчивость к Афидиколину и Л^-этилме-ламиду наряду с выраженной чувствительностью к
ддТТФ и гиперактивацией, индуцированной высокой концентрацией KCl (таблица), являются таксономическими критериями семейства ДНК-полимераз ß; полное же отсутствие 3'-5'-экзонуклеазной активности, установленное нами в очищенных образцах ферментов, также соответствует природе ß-подобных ДНК-полимераз [3, 4, 6].
Из полученных нами данных также следует, что МИЭ-индуцированное подавление активности ß-по-добных ДНК-полимераз сопровождается формированием укороченных (50и-100и), «незрелых», фрагментов ДНК.
Это означает очевидную невозможность полноценной репарации ДНК с участием таких «аномально коротких» фрагментов ДНК, что подтверждает концепцию [4, 6, 10, 13], в соответствии с которой ß-подобная
краткие сообщения
Журнал фундаментальной меднннны н бнологнн
v4
ДНК-полимераза может являться мишенью для противоопухолевых агентов, поскольку её ингибирование лишает опухолевую клетку возможности репарации ДНК.
Так как ион-радикальный механизм МИЭ хорошо изучен [2, 10, 14], есть возможность планирования и проведения исследований по «раскрытию» фармакологического потенциала этого пути регуляции работы ключевых ферментов.
В свете некоторых недавно полученных данных, в которых предложены безопасные и удобные нано-контейнеры для адресной доставки парамагнитных катионов в клетки опухолей in vivo [2, 10, 13], наши результаты могут служить ориентиром для оптимизации стратегии доклинических исследований МИЭ-ин-дуцирующих фармакофоров.
Следует отметить, что в основе природы магнетизма, отличающего МИЭ, лежит спин-селективная биохимия [10, 14], рассматривающая Кулоновское сверхтонкое взаимодействие между «магнитными» ядрами металлов (акцепторы электрона) и кислородом фосфатной группы (донором электрона) внутри ион-радикальной пары как процесс, при котором «магнит» индуцирует синглет-триплетную конверсию этой пары [15, 16]. Соответственно, изотопы металлов с некомпенсированным ядерным спином принято обо-
значать как «магнитные» в многочисленных биохимических исследованиях, посвященных феномену МИЭ [2, 10, 13-16].
В частности, механизмы и фармакологический потенциал МИЭ ионов 25Mg2+, 43Ca2+ и 67Zn2+ в реакции ß-подобных ДНК-полимераз были исследованы на клетках острого миелобластного лейкоза человека [11, 12]. Однако до сих пор этот тип опухолей был единственным злокачественным новообразованием, изученным с применением спин-селективного ингибиро-вания каталитической активности ДНК-полимеразы ß.
Настоящая работа является первым опытом изучения фармакологического потенциала МИЭ в клетках ретинобластомы человека - злокачественной опухоли, химиотерапия которой, по мнению экспертов, нуждается в серьезном улучшении [1, 2].
Вывод
МИЭ ионов 25Mg2+, 43Ca2+ и 67Zn2+ может быть эффективно использован для ограничения пролифера-тивной активности клеток ретинобластомы человека, что достигается благодаря подавлению каталитической активности репарационных ß-подобных ДНК-полимераз, сочетающимся с МИЭ-зависимым снижением процессивности этих ферментов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Zhang J, Benavente CA, McEvoy J, Flores-Otero J, Ding L, Chen X, et al. Novel retinoblastoma therapy from genomic and epigenic analyses. Nature. 2012; 481 (7381): 329-334.
2. Udvardi L, Loewenhaupt H, Berthault M. Medicinal Paramagne tic. Alba Regia: Szeged; 2017.
3. Sungchul J. Molecular Theory of a Living Cell. Springer: New York; 2012.
4. Martin S, McCabe N, Mullarkey M, Gummins R, Burgess DJ, Nakabeppu Y, et al. DNA polymerases as potential therapeutic targets in cancers. Cancer Cell. 2010; 17: 235-248.
5. Katoh R. Analytical Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. Springer: Berlin -Dortrecht - Heidelberg; 2011.
6. Bukhvostov AA, Shatalov OA, Orlov AP, Kuznetsov DA. An atypical DNA polymerase beta overexpressed in human AML/ HL-60 malignant cells. J Cancer Sci Therap. 2013; 5: 94-99.
7. Fukami T, Uchiyama K, Yoshimura Y, Watanabe T, Nakazawa H. Ultramicro-analysis by use of light-scanning photoacoustic densitometry for electrophoresed protein in human hair. Anal Biochem. 1996; 238: 60-64.
8. Kuznetsov DA, Govorkov AV, Zavijalov NV, Sibileva TM, Richter V, Drawczek JA. Fast estimation of ATP/ADP ratio as a special step in pharmacological and toxicological studies using the cellfree translation systems. J Biochem Biophys Methods. 1986; 13: 53-56.
9. Rule GS. Quantitative assay of deoxyribonuclease activity after isoelectric focusing in polyacrylamide gels. Analyt Biochem. 1984; 138: 99-106.
10. Buchachenko AL, Lawler RG. New possibilities for magnetic control of chemical and biochemical reactions. Acc Chem Res. 2017; 50: 877-884.
11. Buchachenko AL, Orlov AP, Kuznetsov DA, Breslavsraya NN. Magnetic control of the DNA synthesis. Chem Phys Lett. 2013; 586: 138-142.
12. Bukhvostov AA, Napolov JK, Buchachenko AL, Kuznetsov DA. A new platform for anti-cancer experimental pharmacology: the DNA repair enzyme affected. Brit J Pharmacol Toxicol. 2014; 5: 35-41.
13. Orlova MA, Osipova EY, Roumiantsev SA. Effect of 67Zn-nanoparticles on leukemic cells and normal lymphocytes. Brit J Med Med Res. 2012; 2 (1): 21-30.
14. Buchachenko AL. Why magnetic and electromagnetic effects on biology are ambiguous and contradictory. Bioelectromagnetics. 2016; 37 (1): 1-13.
15. Buchachenko AL, Kuznetsov DA, Breslavsraya NN. Ion-radical mechanism of enzyme ATP synthesis: DFT calculations and experimental control. J Phys Chem B. 2010; 114: 2287-2292.
16. Buchachenko AL, Kuznetsov DA, Breslavsraya NN. Chemistry of enzymatic ATP synthesis: an insight through the isotope window. Chem Rev. 2012; 112: 2042-2058.
