CC BY
21
УДК 616.126
УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ ДЕПОЗИТОВ КАЛЬЦИЯ У БОЛЬНЫХ ПОЖИЛОГО И СТАРЧЕСКОГО ВОЗРАСТА С КАЛЬЦИНИРУЮЩИМ СТЕНОЗОМ АОРТАЛЬНОГО КЛАПАНА
Н.И. Гуляев, Л.С. Онищенко, О.В. Костина, А.Е. Коровин, А.С. Кусай, И.Б. Олексюк
Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова, Санкт-Петербург, Россия
Цель исследования. Патоморфологические ультраструктурные особенности каль-цификации межуточной ткани аортальных полулуний у больных с кальцинирующей болезнью клапана аорты.
Материал и методы. На основании ультраструктуры биопсийного материала, полученного в ходе оперативного вмешательства по поводу протезирования аортального клапана у 10 больных (7 мужчин и 3 женщин) в возрасте от 60 до 82 лет, исследованы патоморфологические ультраструктурные особенности кальцификации межуточной ткани аортальных полулуний у больных с кальцинирующей болезнью клапана аорты.
Результаты. Патогенез кальцификации аортального клапана до настоящего времени остается недостаточно изученным. В исследовании с помощью трансмиссионной и сканирующей электронной микроскопии показаны начальные проявления кальцификации практически неизмененного коллагена, задокументировано наличие в ткани клапана кальцифицирующих наночастиц, показан характер формирования депозитов кальция в клапане. Выделены различные варианты поверхности кальцинатов. Полученные данные свидетельствуют о необходимости дальнейшего углубленного исследования проблемы кальцификации аортального клапана с целью разработки новых подходов к патогенетическому лечению. Выводы. Начальные участки кальцификации и отложение солей кальция происходят в участках коллагеновых волокон, расположенных вблизи фибробластов, имеющих признаки морфофункционального напряжения или деструкции. В дальнейшем рост кристаллов гидроксилапатита кальция происходит вдоль коллагено-вых волокон межуточной ткани клапана аорты. В процессе уплотнения мезопорис-того аморфного фосфата кальция в щелочной среде образуются плотные конгломераты гидроксилапатита кальция, являющегося основой крупных кальцинатов аортальных полулуний. Кальцифицирующие наночастицы потенциально способны являться самостоятельным «ядром» кальцификации коллагена аортальных по-лулуний.
Ключевые слова: аортальный клапан, кальцинирующий аортальный стеноз, коллаген, внеклеточный матрикс, фибробласты, самореплицирующиеся кальцифицирующие наночастицы, поверхность кальцинатов, ТЭМ, СЭМ
Авторы заявляют об отсутствии возможных конфликтов интересов
ULTRASTRUCTURAL FEATURES OF THE FORMATION OF CALCIUM DEPOSITS IN PATIENTS WITH CALCIFIC AORTIC STENOSIS
N.I. Gulyev, L.S. Onischenko, O.V. Kostina, F.E. Korovin, A.S. Kusay, I.B. Olecsuk
S.M. Kirov Military Medical Academy, 6 ul. Ac. Lebedev, St. Petersburg 194044; e-mail: nig27@mail.ru
Objective. Pathological ultrastructural features of the interstitial tissue calcification of the aortic crescents in patients with aortic valve disease calcining.
Subjects abd methods. Based on the ultrastructure of the biopsy material obtained during surgery for aortic valve replacement in 10 patients (7 men and 3 women) aged 60 to 82 years were studied the pathological ultrastructural features of calcification of interstitial tissue of aortic crescents in patients with calcining disease of aortic valve. Results. The pathogenesis of calcification of the aortic valve are by far from being unraveled. In the present research using transmission and scanning electron microscopy shows the initial manifestation of calcification among nearly unmodified collagen. Documented the presence in the tissue valve calcifying nanoparticles shows the character of the formation of calcium deposits in the valve. Allocated different variants surface of calci-nates.The findings suggest evidence of need for further deep research of the problem of calcification of the aortic valve, which can be useful for development of new approaches to treatment.
Conclusions. The initial parts of calcification and deposition of calcium salts occur in areas of collagen fibers, fibroblasts located near showing signs morpho-functional voltage or degradation. In the future, the growth of hydroxyapatite crystals of calcium occurs along the collagen fibers interstitial tissue aortic valve. There are four different variants of the surface morphology of calcifications, which are likely to represent various forms of amorphous calcium phosphate deposition.
Keywords: aortal valve, calcific aortic stenosis, collagen, extracellular matrix, fibroblasts, self-replicating calcifying nanoparticles, surface of calcinates, TEM, SEM
Наряду с гипертонической и ишемической болезнью сердца пороки аортального клапана являются третьей по частоте группой сердечнососудистых расстройств. Частота аортального стеноза среди клапанных нарушений в общеклинической практике и в структуре кардиохирурги-ческих вмешательств возрастает и составляет в настоящее время 34 и 47% соответственно. Распространенность кальцинирующего аортального стеноза устойчиво увеличивается с возрастом, составляя до 15—20% у лиц старше 80 лет [2].
С развитием кардиохирургии и появлением возможности оперативного лечения пороков сердца в пожилом возрасте в удаленных естественных и искусственных биологических клапанах сердца было обнаружено наличие зрелой кос-
Authors declare lack of the possible conflicts of interests
тной ткани с функционирующим костным мозгом, а также впервые отмечен рецидивирующий характер кальцификации и остеогенеза. При этом гистоморфологическая картина створок аортального клапана при кальцинирующем аортальном стенозе (КАС) характеризовалась лим-фогистиоцитарной инфильтрацией, неоангиоге-незом, скоплениями тучных клеток и наличием очагов кальцификации. Выявленные признаки некоторыми авторами были расценены как результат не дегенеративного, а регенеративного характера кальцификации при КАС [6].
Дальнейшие исследования данной проблемы способствовали выявлению в кальцинатах наличие роста самореплицирующихся кальцифи-цирующих наночастиц (КНЧ, calcifying nano-
particles — CNP, «нанобактерии», «наноны»), присутствие которых уже было выявлено при заболеваниях сонных артерий, аневризме брюшной аорты, желчнокаменной и мочекаменной болезнях, в кальцинированных человеческих сосудах и клапанах [10].
Таким образом, несмотря на значительное количество работ, посвященных данной теме, длительную историю изучения этиопатогенеза КАС, сохраняется неопределенность большинства этиологических факторов и патогенетических механизмов начального этапа формирования депозитов солей кальция в структурах аортального клапана, что в конечном итоге не позволяет разработать единый подход к комплексной терапии заболевания.
Цель исследования: Исследовать патомор-фологические ультраструктурные особенности кальцификации межуточной ткани аортальных полулуний у больных с кальцинирующей болезнью клапана аорты.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Исследовали ультраструктуру биопсийного материала, полученного в ходе оперативного вмешательства по поводу протезирования аортального клапана у 10 больных (7 мужчин и 3 женщин) в возрасте от 60 до 82 лет.
Для трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) кусочки клапана аорты фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида на фосфатном буфере pH 7,4 не менее 6 ч при 4C, промывали тем же буфером, постфиксировали 2% раствором четы-рехокиси осмия в течение 1 ч, обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации и ацетоне, заливали в смесь эпона с аралдитом и подвергали полимеризации в термостате около 72 ч при температуре от 37 до 60°C [5].
Ультратонкие срезы толщиной до 70 нм, изготовленные на ультратоме LKB-3 (Швеция), «окрашивали» уранилацетатом и цитратом свинца и фотографировали в электронном микроскопе JEM-100CX (Япония) при ускоряющем напряжении 80 kV. Полученные негативы оцифровывали и исследовали их компьютерные изображения.
Для сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) клапаны, фиксированные так же как и для ТЭМ, обезвоживали, высушивали при критической точке с использованием устройства НСР-2 (Hitachi, Япония), анализировали и изучали в сканирующем
электронном микроскопе JEOL JSM35C (JEOL, Япония) при ускоряющем напряжении 7 и 15 kV.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На электронограммах кальцинированных створок клапана аорты (ТЭМ и СЭМ) определили крупные полиморфные депозиты солей кальция (рабочее название «кальцинаты» — calcinates) различного размера (рис. 1).
При исследовании в трансмиссионном электронном микроскопе установлено, что клеточный состав внеклеточного матрикса исследованных биоптатов представлен преимущественно фибробластами, окруженными коллагеном с различной степенью его дезинтеграции, степень которой уменьшается при удалении от клетки. Важно отметить, что как в практически сохраненном коллагене, так и в участках с его выраженными изменениями отмечаются очаги начальной кальцификации. Эпизодически выявляется пролиферация фибробластов, которая практически не определяется в участках, близких к кальцинатам.
В исследованных образцах клапанов при ТЭМ дифференцировали разреженные участки расположения коллагеновых фибрилл, скопления коллагена без типичной исчерченности, вакуолизиро-ванные участки разных размеров, окруженные как измененным, так и типичным коллагеном. Обнаруженные ультраструктурные изменения
Рис. 1. Биоптат аортального клапана пациента Ф.Б., 62 г. Участок створки аортального клапана с полиморфными кальцинатами на поверхности. Кальцинаты располагаются среди элементов интерстиция. Сканирующая электронная микроскопия ( X 15).
Рис. 2. Биоптат аортального клапана пациента С.А., 68 лет. Фибробласт в состоянии морфофункциональ-ного напряжения с различными включениями: МХ — митохондрия (с почти прозрачным содержимым вследствие умеренного исчезновения матрикса и крист), ГФС — гетерофагосома, ФЛ — фаголизосо-мы; начальные отложения солей кальция обозначены стрелками. Трансмиссионная электронная микроскопия (Х20 000).
Рис. 3. Биоптат аортального клапана пациента С.А., 68 лет. Кристаллы кальцината среди коллагеновых волокон. Трансмиссионная электронная микроскопия Х3300.
являются свидетельством патологических процессов в аортальных клапанах в целом.
В участках межуточной ткани с явлениями морфофункционального напряжения фиброблас-тов выявляли участки начальной инициации кальцификации коллагеновых волокон (рис. 2).
Подобные очаги начальной кальцификации коллагеновых волокон в дентине зуба ранее были показаны в работах [7 и 16]. Также при ТЭМ нам удалось обнаружить участок кальцината с группой параллельно расположенных коллагеновых волокон, причем некоторые из них с характерной поперечной исчерченностью на значительном протяжении заполнены солями кальция (рис. 3).
В работе [1] показано, что при pH > 4,2 единственным термодинамически стабильным фосфатом кальция в водном растворе является гидроксилапатит кальция (ГАП), который и определяется наиболее часто в депозитах солей кальция артерий человека [8]. Кристаллическая структура биоминералов на основе кальция и фосфатов, в том числе ГАП, определяет термодинамически равновесную форму кристаллов в виде шестигранной призмы (иглы), вытянутой вдоль оси [1]. Данная особенность, вероятнее всего, облегчает формирование кристаллов ГАП вдоль вытянутого коллагенового волокна в клапане аорты (рис. 3).
Помимо этого, при ТЭМ в участках, прилежащих к крупным отложениям солей кальция внутри плотных участков коллагеновых фибрилл обнаружили крупные умеренно осмиофильные тельца (рис. 4), окруженные светлым кольцом и имеющие плотный осмиофильный ободок, со-
Рис. 4. Биоптат аортального клапана пациента С.А., 68 лет. Умеренно осмиофильные крупные тельца (показаны стрелками). Трансмиссионная электронная микроскопия, увеличение А Х26 000, Б Х33 000.
Рис. 5. Биоптат аортального клапана пациента С.А., 68 лет. Кальцифицирующие наночастицы среди кол-лагеновых волокон. Сканирующая электронная микроскопия, Х14 000.
Рис. 6. Биоптат аортального клапана пациентки З.В., 81 г. Скопление сферических наночастиц на поверхности кальцината. Сканирующая электронная микроскопия (х 30 000).
Рис. 7. Биоптат аортального клапана пациентки З.В., 81 г. Первый тип поверхности кальцината аортального клапана, представленный большим скоплением сферических нано- и микрочастиц. ИК — иммунокомпетентная клетка. Сканирующая электронная микроскопия (АХ 10 000, Б Х25 000).
стоящий из сильно измененного нитевидного коллагена, что соответствует описанию кальци-фицирующих наночастиц (КНЧ, self-replicating calcifying nanoparticles, CNP) [12,13]. Роль последних как самостоятельного источника формирования «ядра» кристаллизации до настоящего времени не определена. На наш взгляд, не исключается, что данные образования могут являться изолированными коллагеном очагами начальной кристаллизации межуточной ткани аортальных полулуний, что позволило предотвратить их дальнейший рост (рис. 4).
При исследовании в сканирующем электронном микроскопе скопления кальцифицирующих
наночастиц определяются в участках дезорганизации коллагеновых волокон (рис. 5).
Возможно, кальцифицирующие наночастицы имеют самостоятельное значение в формировании депозитов солей кальция в структуре межуточной ткани аортальных полулуний (гидроксил-апатит кальция наряду с карбонатапатитом кальция являются основой структуры кальцифи-цирующих наночастиц) [4,10], что частично подтверждается и полученными нами данными (см. рис. 4, 5, 6).
При СЭМ определены четыре варианта поверхности кальцинатов:
Первый тип представляет собой скопление достаточно однородных по размеру сферических
* у» * 7 ' »1 к тКК ■
| » * «\11 '» ^ > * • л 9 » ^В* V* щй
^М |ДГ| ь - ' 11с яо с * - . * 4 ¿Л« Ягх^^ГшЛ^ ' ** . ^ 11
* и
15кУ Х14,000 1рт 0061 08/АРРУ14 .л
Рис. 8. Биоптат аортального клапана пациента И.К., 74 г. Второй тип поверхности кальцината. Сканирующая электронная микроскопия (АХ 14 000, БХ12 000).
Рис. 9. Биоптат аортального клапана пациентки Л.Д., 76 лет. Третий тип поверхности кальцината аортального клапана. А — скол участка кальцината, видны монолитные депозиты солей кальция, Х6 000, Б — мезопористая поверхность, Х22 000. Сканирующая электронная микроскопия.
кальцифицирующих наночастиц диаметром около 200 нм (рис. 6 и 7). Довольно часто на подобной поверхности обнаруживаются иммуноком-петентные клетки (возможно, макрофаги), чего не наблюдается на других типах поверхностей (рис. 7А).
Второй тип характеризуется наличием множественных уплощенных округлых и линейных структур, интимно спаянных между собой, представляя единый конгломерат (рис. 8). Не исключено, что источником формирования подобного рода кальцината могут являться КНЧ, на что указывает как характер поверхности, так и результаты исследований финских ученых (Ка]а^ег Е.О. е! а1.) [13], описавших аналогичные образования на других поверхностях.
Третий тип поверхности характеризуется наличием на поверхности кристаллического микропористого «покрывала», под которым находится конгломерат плотного монолитного отложения солей кальция (рис. 9).
Четвертый тип поверхности встречался реже остальных, однако имел наиболее характерные черты в виде фигурных пластинчатых образований и встречался как на поверхности кальцина-та, так и самостоятельно «прорастая» из участков коллагена (рис. 10).
В 1998 г. К. Отипа и соавт. указали, что подобные отложения относятся к категории аморфного фосфата кальция, являющегося предшественником образования гидроксилапатита кальция в водной среде в широкой области произведения начальных концентраций. При этом
7кV Х9,000 2цт 0168 09/SEP/14
Б
1SkV Х10,000 1рт 0203 09/SEP/14
Рис. 10. А — биоптат клапана аорты пациентки Л.Д., 76 лет, Х9000. Б — биоптат клапана аорты пациентки С.М., 78 лет, X 10 000. Четвертый тип поверхности кальцината аортального клапана. Сканирующая электронная микроскопия.
на начальном этапе осаждения гидроксилапати-та образуются частицы размером около 1 нм, что соответствует размеру ионного ассоциата Cag(PO4)6 [14]. При дальнейшем развитии процесса кристаллизации формируются два морфологических типа аморфного фосфата кальция: сферические частицы диаметром 20—200 нм (см. рис. 6, 7), которые, в свою очередь, с течением времени трансформируются в волокнистый продукт [9,11] (см. рис. 9Б). Оба варианта представляют собой мезопористую структуру с широким распределением пор по размерам — 5—50 нм. С увеличением pH усиливается кристаллообразование, так как отрицательный заряд поверхности кристаллов ГАП в щелочной среде способствует «захвату» ионов Ca , CaOH+ , что и обеспечивает рост кристаллов [3].
С другой стороны, нельзя исключить, что КНЧ, выявляемые в участках межуточной ткани, близкой к депозитам солей кальция, непосредственно контактирующие с коллагеновыми волокнами за счет сульфатированных гликопро-теидов коллагена и, вследствие этого, смещения pH в щелочную сторону, способствуют формированию кристаллических и кристаллоподобных структур в матриксе клапана [15].
ВЫВОДЫ
1. Начальные участки кальцификации и отложение солей кальция происходят в участках коллагеновых волокон, расположенных вблизи фибробластов, имеющих признаки морфофунк-ционального напряжения или деструкции. В даль-
нейшем рост кристаллов гидроксилапатита кальция происходит вдоль коллагеновых волокон межуточной ткани клапана аорты.
2. Имеется четыре различных морфологических варианта поверхности кальцинатов, которые, вероятно, представляют собой различные формы отложения аморфного фосфата кальция.
3. В процессе уплотнения мезопористого аморфного фосфата кальция в щелочной среде образуются плотные конгломераты гидроксил-апатита кальция, являющегося основой крупных кальцинатов аортальных полулуний.
4. Кальцифицирующие наночастицы потенциально способны являться самостоятельным «ядром» кальцификации коллагена аортальных полулуний.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Вересов А.Г., Путляев В.И., Третьяков Ю.Д. Химия неорганических биоматериалов на основе фосфатов кальция. Рос. хим. журн. (Журн. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева/ 2004; XLVIII(4): 52-64.
2. Иртюга О.Б., Жидулева Е.В., Казакова Е.Е., Моисеева О.М. Особенности патогенеза аортального стеноза у пациентов с артериальной гипертензией. Артериальная гипертензия. 2013; 19(6): 496-500.
3. Казанова Т. Неорганические фосфатные материалы. (Пер. с япон.). Киев: Наукова думка; 1998: 17-109.
4. Кайдашев И.П. Кальцифицирующие наночастицы: современное состояние проблемы. Журн. НАМН Ук-раши. 2013; 19(3): 277-285.
5. Миронов А.А., Комиссарчик Я.Ю., Миронов В.А. Методы электронной микроскопии в биологии и медицине. СПб.: Наука; 1994: 400 с.
6. Назаренко Г.И., Андропова О.В., Анохин В.Н. Дегенеративный (кальцинированный) аортальный стеноз, атеросклероз и остеопороз: клинико-морфологические параллели. Клиницист. 2006; 1: 11-17.
7. Перькова Н.И. Ультраструктурная характеристика пульпы и дентина зуба человека при различных клинических стадиях генерализованного пародонтита: Авто-реф. дис. ... канд. мед. наук. Л.: 1 ЛМИ; 1990: 14 с.
8. Пухов Д.Э., Васильев С.В., Зотов А.С., Ильин М.В., Рудый А.С. Особенности локализации и состав минеральных отложений атеросклеротических бляшек коронарных артерий по данным сканирующей электронной микроскопии и рентгенодифракционного анализа. Атеросклероз и дислипидемии. 2014; 1: 40-49.
9. Abbona F., Baronet A.J. A XRD and TEM study on the transformation of amorphous calcium phosphate in the presence of magnesium. Crystal Growth. 1996; 165: 98-105.
10. Bratos-Pérez M.A., Sánchez P.L., García de Cruz S., Vil-lacorta E., Palacios I.F., Fernández-Fernández J.M., Di Stefano S., Orduña-Domingo A., Carrascal Y., Mota P., Martín-Luengo C., Bermejo J., San Roman J.A., Rodríguez-Torres A., Fernández-Avilés F. Association between self-replicating calcifying nanoparticles and aortic stenosis: a possible link to valve. Eur. Heart. J. 2008: 29-371.
11. Kibalczyc W., Christoffersen J., Christoffersen M.R. Apparent solubilities of two amorphous calcium phosphates
and of octacalcium phosphate in temperature range 30—42°C. Crystal Growth. 1990; 106: 355-366.
12. Jelic T.M., Chang H.H., Roque R., Malas A.M., Warren S.G., Sommer A. P. Nanobacteria-associated calcific aortic valve stenosis. J. Heart Valve Dis. 2007; 16(1): 101-105.
13. Kajander E.O., Ciftijglu N. Nanobacteria: an alternative mechanism for pathogenic infra- and extracellular calcification and stone formation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998.
14. Omuna K. Ito A. Chem. Mater. 1998; 10: 3346-3351.
15. Scott J.E. Structure and function in extracellular matrices depend on interactions between anionic glycosaminogly-cans. Pathol Biol (Paris). 2001; 4: 284-289.
16. Teti G., Salvatore V., Ruggeri A., Manzoli L., Gesi M., Orsini G., Falconi M. In vitro reparative dentin: a biochemical and morphological study. Eur. J. Histochem. 2013; 57(3): e23.
Поступила 02.11.2015 Принята к опубликованию 28.03.2016 Received 02.11.2015 Accepted 28.03.2016
Сведения об авторах
Гуляев Николай Иванович — к.м.н., доцент кафедры госпитальной терапии Военно-медицинской академии. E-mail: nig27@mail.ru
Онищенко Людмила Семеновна — к.б.н., старший научный сотрудник научно-исследовательской лаборатории (электронной микроскопии и гистохимии) научно-исследовательского отдела (медико-биологических исследований) научно-исследовательского центра Военно-медицинской академии. E-mail: ludonis1947@yandex.ru Костина Ольга Валерьевна — к.б.н., младший научный сотрудник научно-исследовательской лаборатории (электронной микроскопии и гистохимии) научно-исследовательского отдела (медико-биологических исследований) научно-исследовательского центра Военно-медицинской академии. E-mail: olga.kostina@list.ru
Коровин Александр Евгеньевич — д.м.н., старший научный сотрудник научно-исследовательской лаборатории (военно-полевой терапии) научно-исследовательского отдела (экспериментальной медицины) научно-исследовательского центра Военно-медицинской академии. E-mail: korsyrik@mail.ru
Кусай Александр Сергеевич — начальник отделения реанимации и интенсивной терапии Первой клиники хирургии (усовершенствования врачей) Военно-медицинской академии. E-mail: alex-kusay@rambler.ru
Олексюк Игорь Богданович — начальник отделения Первой клиники хирургии (усовершенствования врачей) Военно-медицинской академии. E-mail: ig_oleksjuk@mail.ru
About the authors
Gulyaev Nikolay Ivanovich — PhD, assistant professor of Department of Department of Hospital Therapy, Military Medical Academy. E-mail: nig27@mail.ru
Onishchenko Ludmila Semenovna — PhD, senior fellow at the research laboratory (electron microscopy, and histology) Research Department (biomedical research) Research Center of the Military Medical Academy. E-mail: ludonis1947@yandex.ru
Kostina Olga Valerevna — PhD, junior fellow at the research laboratory (electron microscopy, and histology) Research Department (biomedical research) Research Center of the Military Medical Academy. E-mail: olga.kostina@list.ru
Korovin Alexandr Evgenyevich — MD, PhD, senior fellow at the research laboratory (Military Field Therapy) research department (Experimental Medicine) Research Center of the Military Medical Academy. E-mail: korsyrik@m ail. ru
Kusay Alexandr Sergeevich — Head of the intensive care unit of the First Surgery Clinic (Postgraduate Studies) Military Medical Academy. E-mail: alex-kusay@rambler.ru
Oleksiuk Igor Bogdanovich — Head of unit of the First Surgery Clinic (Postgraduate Studies) Military Medical Academy. E-mail: ig_oleksjuk@mail.ru
