CC BY
31
УДК 616.126
ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ МЕЖУТОЧНОЙ ТКАНИ АОРТАЛЬНЫХ ПОЛУЛУНИЙ У БОЛЬНЫХ С КАЛЬЦИНИРУЮЩИМ АОРТАЛЬНЫМ СТЕНОЗОМ
Н.И. Гуляев1, Л.С. Онищенко1, О.В. Костина1, А.Е. Коровин1, И.Б. Олексюк1, К.Л. Козлов1, Н.А. Михеева1, И.О. Скигин2
1 ФГБОУВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» Минобороны России», Санкт-Петербург, Россия
2
СПбГБУЗ «ГМПБ № 2», Санкт-Петербург, Россия
Цель исследования. Изучить ультраструктурные особенности межуточной ткани аортальных полулуний у больных с кальцинозом клапана аорты. Материал и методы. Методом трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) исследовали кусочки клапана аорты у 10 больных (7 мужчин и 3 женщин) в возрасте от 60 до 82 лет.
Результаты. С помощью трансмиссионной электронной микроскопии показаны начальные проявления кальцинации среди практически неизмененного коллагена, впервые выделены типы морфофункциональной дегенерации фибробластов. Выявлены миелиноподобные включения, предположен возможный механизм их генеза. Полученные данные свидетельствуют о необходимости дальнейшего углубленного исследования проблемы кальцификации аортального клапана, что может оказаться полезным для разработки новых подходов к патогенетическому лечению. Выводы. Морфофункциональная картина изменений межуточной ткани аортальных полулуний характеризуется признаками активного воспалительного процесса. Наличие миелиноподобных образований в аортальных полулуниях, вероятнее всего, указывает на высокую активность процесса перекисного окисления липидов. Большая часть фибробластов аортальных полулуний имеет различную степень выраженности морфофункционального напряжения, которая, вследствие накопления в них большого количества фаголизосом, может привести к дегенерации двумя различными путями — по «светлому» или «темному» типам. Вблизи фибробластов, имеющих признаки деструкции, структура коллагена носит характер выраженной дезинтеграции с начальными участками кальцификации волокон. Ключевые слова: аортальный клапан, кальцинирующий стеноз, ТЭМ, коллаген, внеклеточный матрикс, фибробласты, миелиноподобные структуры
Авторы заявляют об отсутствии возможных конфликтов интересов.
PATHOMORPHOLOGICAL FEATURES OF THE STRUCTURE OF THE AORTIC SEMILUNAR CUSPS IN PATIENTS WITH CALCIFIC AORTIC STENOSIS
N.I. Gulyev1, L.S. Onishchenko1, O.V. Kostina1, A.E. Korovin1, I.B. Oleksyuk1, K.L. Kozlov1, N.A. Mikheeva1, I.O. Scigin2
1 S.M. Kirov Military Medical Academy, St. Petersburg, Russia
2
«Multi-disciplinary City Hospital № 2», St. Petersburg, Russia
Objective. To study the ultrastructural features of the interstitial tissue crescents of aortic calcification in patients with aortic valve.
Material and methods. By transmission electron microscopy, aortic valve slices studied in 10 patients (7 men and 3 women) aged 60 to 82 years.
Results. Fine mechanism(s) underlying the aortic valve calcifyingis (are) by far from being unraveled. In the present research using transmission electron microscopy shows the initial manifestation of calcification among nearly unmodified collagen, were found first time the types of morphological and functional degeneration of fibroblasts. Identified inclusions like myelin, suggested a possible mechanism of their genesis. The findings suggest evidence of need for further deep research of the problem of calcification of the aortic valve, which can be useful for development of new approaches to treatment. Conclusion. Morphological and functional changes in the interstitial tissue picture aortic crescents were characterized by signs of active inflammation. The presence of myelin formation in the aortic semilunar, likely indicated a high activity of lipid peroxidation. Most aortic fibroblasts crescents have different degree of morphofunctional stress, which, due to the accumulation of a large number of phagolysosomes in them can lead to degeneration in two different ways — by «bright» or «dark» type. Near to fibroblasts showing signs of degradation of collagen structure has the character marked with the disintegration of the initial portion of calcification fibers.
Key words: aortal valve, calcific stenosis, TEM, collagen, extracellular matrix, fibroblasts, like myelin structures
Кальцинирующий аортальный стеноз — результат генетически детерминированного имму-ноопосредованного воспалительного процесса в створках аортального клапана, приводящего, как правило, после 60 лет к патологическому фиброзированию и (или) эктопической осси-фикации в них. При этом уплотнение и кальциевое (гидроксилапатитовое) утяжеление створок приводят к возникновению обструкции выносящего тракта и нарушению внутрисердечной гемодинамики без первичного формирования комис-суральных сращений [1].
По данным ряда исследований, основное звено патогенеза кальцинированного аортального стеноза — асептическое воспаление. Особая роль принадлежит окисленным липопротеидам низкой плотности с предполагаемой активацией в интерстициальных клетках аортального клапана оксидативного стресса, сигнальные каскады которого, в свою очередь, создают свободные радикалы кислорода, прежде всего перекись водорода и супероксид [2]. J.D. Miller et al. впервые продемонстрировали проостеогенную патогенную роль радикалов кислорода при кальцинирующей болезни аортального клапана [3]. В гладкомы-шечных клетках сосудов, фибробластах перекись водорода активирует и остеогенные Cbfa1/Runx2 [4], и Msx2/Wnt [5] сигнальные каскады, ко-
Authors declare lack of the possible conflicts of interests.
торые способствуют минерализации клапанов. Приведенные механизмы предопределяют повреждение клеток и внеклетчного матрикса аортального клапана.
При оценке клеточного состава матрикса аортального клапана основное внимание уделяется клеткам воспалительной реакции [6]. В меньшей степени исследователей интересует наиболее многочисленная группа клеток — фиброблас-ты. Предполагается, что при кальцинирующей болезни аортального клапана большая часть этих клеток необратимо подвергается процессу апоп-тоза [7].
Таким образом, изучение патогенеза повреждения структуры аортального клапана требует дальнейшего проведения исследований ультраструктурных процессов повреждения аортального клапана, происходящих при его кальцинации. Отсутствие в доступной нам литературе подробных исследований ультраструктурных особенностей клеточных изменений межуточной ткани аортального клапана при прогрессировании кальцинирующей болезни послужило основанием для проведения данного исследования.
Цель: исследовать патоморфологические ультраструктурные особенности межуточной ткани аортальных полулуний у больных с кальцинирующей болезнью аортального клапана.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Исследовали ультраструктуру биопсийного материала, полученного в ходе оперативного вмешательства по поводу протезирования аортального клапана у 10 больных (7 мужчин и 3 женщин) в возрасте от 60 до 82 лет.
Для трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) кусочки клапана аорты фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида на фосфатном буфере рН 7,4 не менее 6 ч при 4°С, промывали тем же буфером, постфиксировали 2% раствором четырех-окиси осмия в течение 1 ч, обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации и ацетоне, заливали в смесь эпона с аралдитом и подвергали полимеризации в термостате около 72 ч при температуре от 37 до 60° [8].
Из полученных блоков сначала изготавливали полутонкие срезы толщиной 1 мкм, которые окрашивали толуидиновым синим и исследовали в световом микроскопе.
Ультратонкие срезы толщиной до 70 нм изготавливали из этих же блоков на ультратоме LKB-3 (Швеция) и ультракате (Австрия), окрашивали ура-нилацетатом и цитратом свинца и фотографировали в электронном микроскопе JEM-100CX (Япония) при ускоряющем напряжении 80 kV. Полученные негативы отцифровывали и исследовали их компьютерные изображения.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При исследовании в трансмиссионном электронном микроскопе установлено, что клеточный состав внеклеточного матрикса исследованных биоптатов представлен преимущественно фибро-бластами, часть из которых (до 25% общего количества) обнаруживает признаки морфофунк-ционального напряжения (рис. 1) с начальными элементами разрушения структуры клетки. В них, как правило, определяются различной степени измененные митохондрии, гетерофаго-сомы, вакуоли и липидные капли. Эти фиброб-ласты окружены коллагеном с различной степенью его дезинтеграции, степень которого уменьшается при удалении от клетки. Иногда вблизи участков разрушенной цитолеммы фибробластов были видны крупные осмиофильные образования неправильной формы, содержащие внутри себя гетерофагосомы, что может объяснить разрушение коллагеновых волокон в непосредственной близости от фибробласта. Важно отметить,
Рис. 1. Биоптат аортального клапана пациента С.А., 68 лет. Фибробласт в состоянии морфофункциональ-ного напряжения с различными включениями: МХ — митохондрия (с почти прозрачным содержимым вследствие умеренного исчезновения матрикса и крист), ГФС — гетерофагосома, ФЛ — фаголизосо-мы, начальные отложения солей кальция обозначены стрелками. Трансмиссионная электронная микроскопия (X 20 000).
что как в почти сохранном коллагене, так и в участках с его выраженными изменениями отмечались очаги начальной кальцификации. Изредка встречалась пролиферация фибробластов, но она почти не определялась в участках, близких к кальцинатам.
Большая часть фибробластов (до 60% общего их количества) находилась в состоянии дегенерации различной степени (рис. 2, 3). Одни из них дегенерировали по «светлому», другие по «темному» типу, при этом преобладал первый вариант (3:2). Цитолемма в обоих случаях часто имела участки повреждения, а коллагеновые волокна, расположенные в непосредственной близости с клетками, практически полностью разрушены. Вероятно, дегенерацию по «светлому» типу можно считать необратимым патоморфологическим процессом, поскольку в цитоплазме такого фиб-робласта, как правило, не обнаруживаются ядра, а также происходит полное разрушение орга-нелл. Эти фибробласты на расстоянии от тела клетки окружены почти неизмененными колла-геновыми фибриллами, при этом в непосредственной близости от клетки коллаген необратимо разрушен (см. рис. 2, рис. 4). Сохраненная структура коллагена на удалении от разрушенных фибробластов, вероятно, свидетельствует о быстрой гибели клеток по «светлому» типу.
В свою очередь при дегенерации по «темному» типу в цитоплазме сохраняются органеллы, что предполагает обратимость процесса. Наличие вокруг «темных» фибробластов измененного коллагена в виде коллагеноподобных структур позволяет думать о длительном морфофункциональ-ном торможении этих клеток.
На рис. 3 представлены 3 фибробласта, деструктивно измененных по «темному» типу, в среднем из которых отмечается выраженная дегенерация органелл цитоплазмы, их вакуолизация, что вероятнее всего не позволит в дальнейшем восстановить структуру фибробласта. В расположенных по краям снимка фибробластах, несмотря на выраженность изменений, сохраняются регенераторные структурно-функциональные возможности. В промежутках между фибробластами находится сильно измененный коллаген.
Пролиферация фибробластов носила редкий характер и практически не определялась в участках, близких к кальцинатам.
В отдельных участках исследованных клапанов как на полутонких срезах, окрашенных толу-идиновым синим (см. рис. 4) и исследованных светооптически, так и при электронномикро-скопическом изучении нередко обнаруживались пенистые клетки, описанные другими исследователями как активные макрофаги [9]. Наличие данных клеток свидетельствует об активно протекающем воспалительном процессе, имеющем место в клапанном аппарате аорты при их каль-цификации (см. рис. 4, рис. 5).
В исследованных образцах клапанов отмечались разреженные участки расположения кол-лагеновых фибрилл, скопления коллагена без типичной исчерченности, вакуолизированные участки, представленные вакуолями разных размеров, окруженные как измененным, так и типичным коллагеном (рис. 6). Обнаруженные картины являются свидетельством патологических изменений клапана в целом.
Другой заслуживающей внимания находкой в нашей работе оказались структуры, расположенные внеклеточно, с весьма толстой (толщина 20—50 нм) и неравномерной осмио-фильной миелиноподобной оболочкой, не имеющей четкого ламеллярного строения, характерного для обычной структуры миелина (рис. 7). В поврежденных полулуниях аортального кла-
Рис. 2. Биоптат аортального клапана пациента Ф.Б., 62 года. Дегенерация фибробласта (Ф) по «светлому» типу. Трансмиссионная электронная микроскопия (X 26 000).
Рис. 3. Биоптат аортального клапана пациента С.А., 68 лет. Дегенерация крупных фибробластов (стрелки) по «темному» типу. Трансмиссионная электронная микроскопия (х 13 000).
Рис. 4. Биоптат аортального клапана пациента В.Т., 72 года. Полутонкий срез ( X 400). Ф — фибробласт, ПК — пенистые клетки, В — вакуоли. Подробности в тексте.
Рис. 5. Биоптат аортального клапана пациента С.А., 68 лет. Межуточная ткань створок аортального клапана диффузного вида без коллагеновых волокон. Видны также пенистые клетки (обозначены стрелками). Трансмиссионная электронная микроскопия (X 3300).
Рис. 6. Биоптат аортального клапана пациента С.А., 68 лет. Дезорганизация коллагена. В — вакуоли. Трансмиссионная электронная микроскопия (X 3300).
Рис. 7. Биоптат аортального клапана пациента С.А., 68 лет. Дезорганизация элементов межуточной ткани створок аортального клапана с миелиноподобны-ми тельцами (обозначены стрелками). Трансмиссионная электронная микроскопия (X 13 000).
пана они отмечались только в пораженной части клапана, и такое их внеклеточное расположение в ткани аортального клапана в доступной нам литературе никем ранее не отмечалось. Пространства внутри этих структур были почти прозрачными и не были похожими на осевые цилиндры нервных волокон. Морфологически сходные миелиновые волокна с гетеро-генно осмиофильной миелиновой оболочкой и почти пустыми осевыми цилиндрами были описаны в бляшках рассеянного склероза 4-го типа у пациентов с длительностью заболевания свыше 10 лет (рис. 8) [10]. При этом следует отметить, что осмиофилия оболочки нервных волокон в бляшке была слабее, чем в обнаруженных нами миелиноподобных осмиофильных структурах.
Обнаруженные патоморфологические изменения в клапане аорты (изменение структуры фибробластов, нарушение структуры и плотности коллагеновых фибрилл, миелиноподоб-ные структуры и наличие пенистых клеток) позволяют предположить, что в исследованных клапанах имеет место выраженная картина воспаления, возможно, аутоиммунного генеза, близкая к картине при рассеянном склерозе (см. рис. 8) [10]. Одной из возможных версий интерпретации происхождения миелиноподобных структур могут оказаться изменения ми-елиновых волокон эфферентных нейронов, которые присутствуют в клапанах аорты [11]. Однако наиболее вероятным объяснением их происхождения в межуточной ткани аортальных полулуний является образование их вследствие перекисного окисления липидов мембран, в том числе митохондрий, усиливающегося под воздействием разных агентов. Высвобождающиеся при этом фосфолипиды (дезагрегация и реагрегация мембраны) и образуют различные миелиноподобные структуры. Подобные структуры появляются также при скручивании удлиненных цитоплазматических отростков [12]. Высокая активность перекисного окисления ли-пидов мембран в свою очередь может способствовать повреждению структуры фиброблас-тов, способствуя развитию их функциональной неполноценности. Как следствие этого имеет место нарушение стромы аортальных полулуний в виде дезорганизации коллагеновых фибрилл и (или) их отсутствие в отдельных участках.
Рис. 8. Биоптат головного мозга пациента Р.С., 58 лет. Миелиновые волокна без осевого цилиндра (ак-сонопатия) в очаге рассеянного склероза 4-го типа. Репринт с работы А.А. Чикурова, 2011 [10]. Трансмиссионная электронная микроскопия. (S 25 000).
Существующая также альтернативная версия образования внеклеточно расположенных миелиноподобных структур в межуточной ткани как результат экзоцитоза ауто- и гетерофагосом из макрофагов и полинуклеарных фагоцитов [13,14] применительно к аортальным полулуни-ям представляется нам наименее вероятной.
ВЫВОДЫ
1. Морфофункциональная картина изменений межуточной ткани аортальных полулуний характеризуется признаками активного воспалительного процесса.
2. Наличие миелиноподобных образований в аортальных полулуниях вероятнее всего указывает на высокую активность процесса перекисно-го окисления липидов.
3. Большая часть фибробластов аортальных полулуний имеет различную степень выраженности морфофункционального напряжения, которая вследствие накопления в них большого количества фаголизосом может привести к дегенерации двумя различными путями — по «светлому» или «темному» типам.
4. Вблизи фибробластов, имеющих признаки деструкции, структура коллагена носит характер выраженной дезинтеграции с начальными участками кальцификации волокон.
ЛИТЕРАТУРА
1. Егоров И.В. Сенильный аортальный стеноз: век изучения. Современная ревматология. 2007; 1: 20-25.
2. Towler D.A. Molecular and cellular aspects of calcific aortic valve disease. Circulation Research. 2013; 113 (2): 198-208.
3. Miller J.D., Chu Y., Brooks R.M., Richenbacher W.E., Pena-Silva R., Heistad D.D. Dysregulation of antioxidant mechanisms contributes to increased oxidative stress in calcific aortic valvular stenosis in humans. J. Am. Coll. Cardiol. 2008; 52 (10): 843-850.
4. Byon C.H., Javed A., Dai Q., Kappes J.C., Clemens T.L., Darley-Usmar V.M., McDonald J.M., Chen Y. Oxidative stress induces vascular calcification through modulation of the osteogenic transcription factor Runx2 by AKT signaling. J. Biol. Chem. 2008; 283 (22): 15319-15327.
5. Lai C.F., Shao J.S., Behrmann A., Krchma K., Cheng S.L., Towler D.A. TNFR1-activated reactive oxidative species signals up-regulate osteogenic Msx2 programs in aortic my-ofibroblasts. Endocrinology. 2012; 153 (8): 3897-3910.
6. Mohler E.R., Gannon F., Reynolds C., Zimmerman R., Keane M.G., Kaplan F.S. Bone formation and inflammation in cardiac valves. Circulation. 2001; 103 (11): 1522-1528.
7. Lee Y.S., Chou Y.Y. Pathogenetic mechanism of senile calcific aortic stenosis: the role of apoptos. Chin. Med. J. (Engl.). 1998; 111 (10): 934-939.
8. Миронов А.А., Комиссарчик Я.Ю., Миронов В.А. Методы электронной микроскопии в биологии и медицине. СПб.: Наука; 1994: 400.
9. Barascuk N., Skjot-Arkil H., Register Th. C., Larsen L., Inger B., Christiansen C., Karsdal M.A. Human macrophage foam cells degrade atherosclerotic plaques through cathepsin K mediated processes. BMC Cardiovascular Disorders. 2010; 10: 19-27.
10. Чикуров А.А. Варианты течения и типы очагов рассеянного склероза (клинико-патоморфологическое исследование). Автореф. дис. ... канд. мед. наук. СПб.: ВМедА; 2011: 26. Доступно по: http://www.vmeda.org/ docfiles/CikurovAA. avtoreferat .doc.
11. De Biasi S., Vitellaro-Zuccarello L. Intrinsic innervation of porcine semilunar heart valves. Anat. Embryol (Berl). 1982; 165 (1): 71-79.
12. Струков А.И., Серов В.В. Патологическая анатомия: учебник. М.: Литтерра; 2010: 848.
13. Fader C.M., Sбnchez D., Fur^n M., Colombo M.I. Induction of autophagy promotes fusion of multivesicular bodies with autophagic vacuoles in k562 cells. Traffic. 2008; 9 (2): 230-250.
14. Thurberg B.L., Wasserstein M.P., Schiano Th., O'Brien F., Richards S., Cox G.F., McGovern M.M. Liver and skin histopathology in adults with acid sphingomyelinase deficiency (Niemann-Pick disease type B). Am. J. Surg. Pathol. 2012; 36 (8): 1234-1246.
Поступила 06.09.2015 Принята к опубликованию 15.07.2016
REFERENCES
1. Egorov I.V. Senile aortic stenosis: age of the study. Modern rheumatology. 2007; 1: 20-25. (In Russ.)
2. Towler D.A. Molecular and cellular aspects of calcific aortic valve disease. Circulation Research. 2013; 113 (2): 198-208.
3. Miller J.D., Chu Y., Brooks R.M., Richenbacher W.E., Pena-Silva R., Heistad D.D. Dysregulation of antioxidant mechanisms contributes to increased oxidative stress in calcific aortic valvular stenosis in humans. J. Am. Coll. Cardiol. 2008; 52 (10): 843-850.
4. Byon C.H., Javed A., Dai Q., Kappes J.C., Clemens T.L., Darley-Usmar V.M., McDonald J.M., Chen Y. Oxidative stress induces vascular calcification through modulation of the osteogenic transcription factor Runx2 by AKT signaling. J. Biol. Chem. 2008; 283 (22): 15319-15327.
5. Lai C.F., Shao J.S., Behrmann A., Krchma K., Cheng S.L., Towler D.A. TNFR1-activated reactive oxidative species signals up-regulate osteogenic Msx2 programs in aortic myofibroblasts. Endocrinology. 2012; 153 (8): 3897-3910.
6. Mohler E.R., Gannon F., Reynolds C., Zimmerman R., Keane M.G., Kaplan F.S. Bone formation and inflammation in cardiac valves. Circulation. 2001; 103 (11): 1522-1528.
7. Lee Y.S., Chou Y.Y. Pathogenetic mechanism of senile calcific aortic stenosis: the role.
8. Mironov A.A., Komissarchik Ya.Yu. Methods of electron microscopy in biology and medicine. St. Petersburg: Science; 1994: 400. (In Russ.)
9. Barascuk N., Skjot-Arkil H., Register Th. C., Larsen L., Inger B., Christiansen C., Karsdal M.A. Human macro-
phage foam cells degrade atherosclerotic plaques through cathepsin K mediated processes. BMC Cardiovascular Disorders. 2010; 10: 19-27.
10. Chicur A.A. Current versions and types of centers of multiple sclerosis (clinico-pathological examination. Author. Dis. ... cand. med. sciences. St. Petersburg: MMA; 2011: 26. (In Russ.) Available on: http://www.vmeda.org/ docfiles/CikurovAA.avtoreferat.doc.
11. De Biasi S., Vitellaro-Zuccarello L. Intrinsic innervation of porcine semilunar heart valves. Anat. Embryol (Berl.). 1982; 165 (1): 71-79.
12. Strukov A.I., Serov V.V. Pathological anatomy: a textbook. M.: Litterra; 2010: 848. (In Russ.)
13. Fader C.M., SSnchez D., FurlSn M., Colombo M.I. Induction of autophagy promotes fusion of multivesicular bodies with autophagic vacuoles in k562 cells. Traffic. 2008; 9 (2): 230-250.
14. Thurberg B.L., Wasserstein M.P., Schiano Th., O'Brien F., Richards S., Cox G.F., McGovern M.M. Liver and skin histopathology in adults with acid sphingomyelinase deficiency (Niemann-Pick disease type B). Am. J. Surg. Pathol. 2012; 36 (8): 1234-1246.
Received 06.09.2015 Accepted 15.07.2016
Сведения об авторах
Гуляев Николай Иванович — к.м.н., доцент кафедры госпитальной терапии Военно-медицинской академии, Санкт-Петербург. Тел.: +7 (911) 902-74-17. E-mail: nig27@mail.ru.
Онищенко Людмила Семеновна — к.б.н., младший научный сотрудник научно-исследовательского центра Военно-медицинской академии, Санкт-Петербург. Тел.: +7 (981) 838-90-08. E-mail: ludonis1947@yandex.ru.
Костина Ольга Валерьевна — младший научный сотрудник научно-исследовательского центра Военно-медицинской академии, Санкт-Петербург. Тел.: +7 (904) 553-18-91. E-mail: olga.kostina@list.ru.
Коровин Александр Евгеньевич — д.м.н., старший научный сотрудник научно-исследовательского центра Военно-медицинской академии, Санкт-Петербург. Тел.: +7 (904) 603-51-92. E-mail: korsyrik@mail.ru.
Олексюк Игорь Богданович — к.м.н., доцент, начальник отделения Первой клиники хирургии (усовершенствования врачей) Военно-медицинской академии, Санкт-Петербург. Тел.: +7 (905) 204-89-49. E-mail: ig_oleksjuk@mail.ru.
Скигин Илья Олегович — к.м.н., начальник кардиохирургического отделения Городской многопрофильной больницы № 2, Санкт-Петербург. Тел.: +7 (921) 941-30-71. E-mail: skighin@mail.ru.
About the authors
Gulyaev N.I. — PhD, Assistant Professor of Department of Department of Hospital Therapy, Military Medical Academy, St. Petersburg. Tel.: +7 (911) 902-74-17. E-mail: nig27@mail.ru.
Onishchenko L.S. — PhD, senior fellow at the research laboratory (electron microscopy, and histology) Research Department (biomedical research) Research Center of the Military Medical Academy, St. Petersburg. Tel.: +7 (981) 838-90-08. E-mail: ludonis1947@yandex.ru.
Kostina O.V. — PhD, junior fellow at the research laboratory (electron microscopy, and histology) Research Department (biomedical research) Research Center of the Military Medical Academy, St. Petersburg. Tel.: +7 (904) 553-18-91. E-mail: olga.kostina@list.ru
Korovin A.E. — MD, PhD, senior fellow at the research laboratory (Military Field Therapy) research department (Experimental Medicine) Research Center of the Military Medical Academy, St. Petersburg. Tel.: +7 (904) 603-51-92. E-mail: korsyrik@mail.ru.
Oleksiuk I.B. — Head of unit of the First Surgery Clinic (Postgraduate Studies) Military Medical Academy, St. Petersburg. Tel.: +7 (905) 204-89-49. E-mail: ig_oleksjuk@mail.ru.
Skigin I.O. - MD, chief neurosurgery department of Clinical Hospital N 2, St. Petersburg. Tel.: +7 (921) 941-30-71. E-mail: skighin@mail.ru.
