CC BY
13
МОРФОЛОГИЯ. ПАТОЛОГИЯ
УДК: 616.929:616.83
УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В НЕЙРОНАХ ГОЛОВНОГО МОЗГА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ВОСПРОИЗВЕДЕНИИ ЛИХОРАДКИ ЗАПАДНОГО НИЛА
В. Б. Писарев, А. М. Бутенко, А. В. Смирнов, Н. В. Хуторецкая, А. Я. Почепцов,
М. В. Шмидт, В. А. Глухов
Кафедра патологической анатомии ГОУ ВПО ВолГМУ, Отдел обшей и экспериментальной патологии ГУ ВНЦ РАМН и АВО, ГУ НИИ вирусологии РАМН им. Д. И. Ивановского
Аннотация: в эксперименте на 12 белых мышах, внутрибрюшинно зараженых лихорадкой Западного Нила (ЛЗН), определены ультраструктурные изменения нейронов головного мозга. При этом обнаружены ультраструктурные повреждения нейронов, соответствующие стадийности инфекционного процесса более выраженые в вентральных отделах продолговатого мозга по сравнению с гипоталамусом.
Ключевые слова: лихорадка Западного Нила, ультраструктурные изменения, головной мозг, продолговатый мозг, гипоталамус.
В последние годы происходит глобализация экосистемы вируса Западного Нила (ВЗН), передающегося насекомыми и вызывающего инфекционный процесс в организме человека, лихорадку Западного Нила (ЛЗН), важнейшим проявлением которой является менингоэнцефалит [11]. В 1999-2002 гг. в г. Волгограде и Волгоградской области была зарегистрирована крупная вспышка ЛЗН [2]. Наибольшую долю клинических вариантов течения в структуре заболеваемости ЛЗН составили 76 % случаев с поражением ЦНС, кото-
рые проявлялись параличами, парезами, приводили к инвалидизации и летальным исходам [1-3].
При энцефалите Западного Нила на светооп-тическом уровне отмечены обратимые и необратимые изменения в продолговатом мозге и других отделах ствола головного мозга [6-9]. При использовании электронной микроскопии в ядрах нейронов различных отделов головного мозга обнаружены конденсация и маргинация гетеро-хроматина с формированием крупных агрегатов электронно-плотного гранулированного материа-
БЮЛЛЕТЕНЬ ВОЛГОГРАДСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РАМН
1 1-2008
ла, т. е. отмечены ультраструктурные признаки апоптоза [4, 14]. В миелиновых нервных волокнах обнаружены участки разволокнения ламелл с очаговой деструкцией, набухание и лизис крист в митохондриях. Электронная плотность аксо-плазмы была снижена, в отдельных осевых цилиндрах отмечено образование светлых крупных вакуолей [11]. Показаны ультраструктурные изменения элементов гемато-энцефалического барьера, которые были более выражены в астроцитах и эндотелии кровеносных капилляров на уровне продолговатого мозга [5]. Однако сравнительная характеристика ультраструктурных изменений в нейронах различных отделов головного мозга при экспериментальном воспроизведении ВЗН остается малоизученной.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Выявить ультраструктурные изменения нейронов головного мозга при экспериментальном воспроизведении ЛЗН.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Моделирование ЛЗН производилось в лаборатории арбовирусных инфекций (зав. лаб. проф. А. М. Бутенко) ГУ НИИ вирусологии РАМН им. Д. И. Ивановского (директор, академик РАМН Д. К. Львов). В работе использовали астраханский штамм (Астр 901), тождественный ВЗН африканской группы в разведении 10-3 • 0,3 мл.
Белые мыши-самцы (12 штук) в возрасте 30 суток были заражены ВЗН внутрибрюшинно. Животных под эфирным наркозом забивали на 2-е сутки (1-я группа, инкубационный период), на 6-е сутки (2-я группа животных с выраженной клинической симптоматикой, период разгара заболевания). Контролем служили 6 белых мышей-самцов, содержавшихся в стандартных условиях вивария. Эвтаназию производили под эфирным наркозом в соответствии с "Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных".
Фиксацию кусочков головного мозга размером 1 мм3 производили в течение 12 ч в 4 %-м растворе параформа на 0,1М какодилатном буфере с последующей постфиксацией в течение
2 часов в 1 %-м растворе тетраокиси осмия на 0,1М какодилатном буфере (рН = 7,4) при температуре +4 оС [10]. После промывки в нескольких порциях раствора какодилатного буфера материал подвергали дегидратации в спиртах возрастающей концентрации и заливали в смесь эпо-на и аралдита.
Ультратонкие срезы толщиной 50-90 нм получали на ультрамикротоме ЬКБ-8800 и монтировали на медные сетки. После контрастирования в 2,5 %-м растворе уранилацетата на 50°-м этаноле в течение 40 минут и 0,3 %-м растворе цитрата свинца в течение 20 минут срезы изучались в электронном микроскопе Тев1а ББ-500 при ускоряющем напряжении 60 кВ. Фотодокументирование производили с использованием фотопластинок "Для ядерных исследований". Электронные микрофотограммы изготавливали на фотографической черно-белой бумаге "Унибром 160 БП".
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
При электронно-микроскопическом исследовании дорсальных отделов (область ядра одиночного пути) продолговатого мозга мышей 1-й группы обнаружено преобладание мультиполярных нейронов с малыми и средними размерами перика-рионов. Ядра нейронов характеризовались наличием большого количества эухроматина. Небольшие скопления гетерохроматина обнаруживались в виде скоплений со стороны внутренней мембраны ядерной оболочки. Ядрышко, как правило, имело средние размеры, локализовалось в центральной части ядра. Цитоплазма перикарионов нейронов характеризовалась наличием значительного количества цистерн гранулярной эндо-плазматической сети. В вентральных отделах продолговатого мозга (область вентролатерально-го ретикулярного ядра) перикарионы большинства нейронов имели средние размеры. В ядрах отмечено преобладание эухроматина. В цитоплазме периферических отделов перикарионов обнаружено умеренное расширение цистерн гранулярной эндоплазматической сети.
В промежуточном мозге (дорсомедиальные отделы гипоталамуса) отмечено умеренное набухание митохондрий, расширение цистерн гранулярной эндоплазматической сети (ГЭПС). Наблюдалась очаговая вакуолизация периферических отделов перикарионов нейронов с образованием множества мелких мембранных везикул с содержимым низкой электронной плотности. В ядрах отмечено преобладание эухроматина. Ядрышко правильной округлой формы расположено в центральной части ядра.
При ультраструктурном исследовании дорсальных отделов продолговатого мозга мышей 2-й группы (забитых в период разгара на 6-е сутки заболевания) обнаружены изменения митохондрий различной выраженности. Степень повреждения данных органелл варьировала как в различных нейронах, так и в пределах одной клетки. Как правило, имело место набухание митохондрий с очаговым разрушением крист. Наряду с этим в цитоплазме встречались так называемые "юные" формы митохондрий: мелкие, с повышенной электронной плотностью матрикса. Большинство цистерн ГЭПС были умеренно расширены, количество их уменьшено. Отмечено появление в цитоплазме крупных вакуолей, образующихся из элементов эндоплазматической сети, а также мембранных комплексов в виде миелиноподоб-ных телец.
В вентральных отделах продолговатого мозга обнаружены аналогичные изменения митохондрий. В средней и периферической зонах цитоплазмы перикарионов нейронов помимо крупных вакуолей с материалом низкой электронной плотности обнаруживались мелкие округлые вакуоли, располагающиеся небольшими группами. Отмечено наличие в отдельных пери-карионах множество миелиноподобных телец, образованных осмиофильными ламеллярными структурами (см. рис.).
БЮЛЛЕТЕНЬ ВОЛГОГРАДСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РАМН
Рис. Ультраструктура нейрона вентрального отдела продолговатого мозга мыши при моделировании энцефалита, вызванного внутрибрюшинным введением вируса Западного Нила, 2-я группа. Электронная микрофотограмма. Ув. х 10000
В дорсомедиальных отделах гипоталамуса выявлен ряд неспецифических ультраструктурных изменений в перикарионах нейронов в виде вакуолизации и умеренного набухания митохондрий с частичным лизисом крист. В цитоплазме обнаружено большее количество расширенных цистерн ГЭПС, увеличена их протяженность. Форма отдельных цистерн стала дугообразной с образованием гигантских вакуолей. Однако в целом вакуолизация цитоплазмы нейронов носила менее выраженный характер, чем на уровне продолговатого мозга. В ядрах некоторых нейронов выявлены глубокие инвагинации кариолеммы без расширения перинуклеарного пространства. В отдельных нейронах отмечена маргинация гетеро-хроматина.
Обнаруженные ранее на светооптическом уровне в инкубационном периоде ЛЗН в нейронах коры и ствола головного мозга признаки слабо выраженной гидропической дистрофии и наличие незначительного перицеллюлярного отёка [1, 2] подтверждаются при электронно-микроскопическом исследовании гипоталамуса и продолговатого мозга. Выявление помимо умеренной вакуолизации цитоплазмы перикарионов ультраструктурных признаков повреждения митохондрий свидетельствует о нарушении энергетического обмена в нейронах.
В перикарионах нейронов продолговатого мозга на 6-е сутки эксперимента обнаружено более выраженное по сравнению с гипоталамусом нарастание ультраструктурных признаков дистрофических изменений, особенно в вентральной части. Отмеченная вакуолизация и набухание митохондрий в сочетании с выраженным расширением цистерн ГЭПС в перикарионах нейронов гипоталамуса свидетельствует о прогрессивном нарастании ультраструктурных признаков повреждения органелл в этот период заболевания, а также о появлении ультраструктурных изменений в ядрах нейронов. Полученные нами результаты можно объяснить индуцирующим нейротропным влиянием ВЗН, способствующего повреждению и гибели нейронов в различных отделах головного мозга [9, 11], а также цитотоксическим воздействием
1-20081
иммунной системы [1, 13]. Несмотря на важность изучения патологических изменений в различных отделах ЦНС при ЛЗН, механизмы, обуславливающие поражение нейронов при западнониль-ском энцефалите и других арбовирусных инфекциях остаются в значительной степени неизвестными. Установлено, что при ВЗН каспаза-3 зависимый апоптоз вносит значительный вклад в патогенез летального энцефалита [12], при максимальном повышении активности каспазы-3 в гомогенатах коры полушарий конечного мозга и мозжечка мышей с 6-х по 10-е сутки опыта. В наших исследованиях продемонстрировано преобладание в стволе головного мозга и гипоталамусе нейронов с ультраструктурными признаками обратимых повреждений, нарастающих к 6-м суткам моделирования ЛЗН, что косвенно подтверждается данными о наличии в этот период выраженных ультраструктурных признаков повреждения эндотелия кровеносных капилляров и астроцитов в стволе головного мозга [4].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, при экспериментальном моделировании ЛЗН (штамм 901) путем внутри-брюшинного заражения мышей обнаружены ультраструктурные повреждения нейронов, соответствующие стадийности инфекционного процесса и более выраженные в вентральных отделах продолговатого мозга по сравнению с гипоталамусом. Обнаруженные морфологические изменения свидетельствуют о нарастающих нарушениях водно-электролитного и энергетического видов обмена в нервной ткани, по-видимому, индуцированных ВЗН.
Исследование выполнено при финансовой поддержке гранта ВолГМУ.
ЛИТЕРАТУРА
1. Григорьева Н. В. Патоморфология органов и систем при лихорадке западного Нила (клинико-экспериментальное исследование): автореф. дисс. ... д-ра мед. наук. - Волгоград, 2005. - 42 с.
2. Львов Д. К., Писарев В. Б., Петров В. А. и др. Лихорадка Западного Нила: по материалам вспышек в Волгоградской области в 1999-2002 гг. - Волгоград, 2004. - 104 с.
3. Писарев В. Б., Григорьева Н. В., Петров В. А. и др. // Арх. патологии. - 2004, № 5. - С. 15-18.
4. Писарев В. Б., Смирнов А. В., Почепцов А. Я. и др. // Бюлл. ВНЦ РАМН и АВО. - 2006. - № 3. -С. 11-13.
5. Шмидт М. В., Писарев В. Б., Смирнов А. В. и др. // Арх. патологии. - 2006. - Т. 68, № 4. -С. 25-27.
6. Cantile C., Di Guardo G., Eleni C., et al. // Equine Vet. - 2000. - № 32. - Р. 31-35.
7. Crichlow R., Bailey J., Gardner C. // The Journal of the American Board of Family Practice. - 2004. -№ 17. - Р. 470-472.
8. Del Piero F, Wilkins P. A., Dubovi E. J., et al. // Vet. Pathol. - 2001. - № 38. - Р. 451-456.
9. Edward B., Hayes M. D., OLeary D. R. // Pediatrics. - 2004, Vol. 113, №. 5. - Р.1375-1381.
10. Guarner J., Shieh W J., Hunter S., et al. // Hum. Pathol. - 2004, № 35. - Р. 983-990.
БЮЛЛЕТЕНЬ ВОЛГОГРАДСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РАМН
I 1-2008
11. Keith J., Nicolle M., Tugaleva E., et al. // Can. J. Neurol. Sci. - 2007. - Vol. 34, № 1. - P. 92-98.
12. Kleinschmidt-DeMasters B. K, Marder B. A., Levi M. E., et al. // Arch. Neurol. - 2004. - № 61. -P. 1210-1220.
13. Samuel M. A., Morrey J. D., Diamond M. S. // Journal of Virology. - 2007. - Vol. 81, № 6. - P. 26142623.
14. Shrestha B., Gottlieb D., Diamond M. S. // J. Virol. - 2003. - Vol. 77, № 24. - P. 13203-13213.
