CC BY
62
лабораторные и экспериментальные исследования
УДК: 616-006.3.04+576.385.5]-092.9
ультраструктурные аспекты Биологии злокачественного роста саркомы С-45
К.в. двадненко, С.А. гусев, г.М. федоренко, д.г. Матишов
южный научный центр Российской академии наук, г. Ростов-на-дону 344006, г. Ростов-на-дону, пр. Чехова, 41, e-mail: dvadnenko@ssc-ras.ru
Проведено комплексное морфологическое исследование солидной опухоли саркомы С-45, трансплантированной под кожу спины беспородным крысам-самцам. На основании данных электронно-микроскопического исследования выделены два типа клеток саркомы С-45, отличающихся разной степени дифференцированности. Получены данные о кинетике роста опухоли, пролиферативной активности и ультраструктурной организации образующих её клеточных элементов. Исследованы особенности формирования микроциркуляторного русла опухоли. Выявлены морфологические особенности строения капилляров в центральных и периферических участках саркомы 45 крыс.
Ключевые слова: саркома С-45, электронная микроскопия, ультраструктура опухолевой клетки.
ULTRUSTRUCTURAL ASPECTS OF BIOLOGY OF SARCOMA S-45 MALIGNANT GROWTH K.V. Dvadnenko, S.A. Gusev, G.M Fedorenko, D.G. Matishov South Scientific Center of Russian Academy of Science, Rostov-na-Donu 41, Chekhovapr., 344006-Rostov-na-Donu, e-mail: dvadnenko@ssc-ras.ru
An integrated morphological research of solid sarcoma S-45 tumor transplanted to mongrel male rats under skin in the back was performed. An electron microscope study revealed two types of sarcoma S-45 cells varying in distinctness. Data on tumor growth kinetics, proliferative activity and ultrustructural composition of its cell components were obtained. Morphological properties of capillary structure in sarcoma central and peripheral areas in 45 rats were described.
Key words: sarcoma S-45, electron microscopy, tumor cell ultrastructure.
Эксперименты по моделированию опухолей in vivo с последующим гистологическим анализом операционного материала позволяют получить новые данные о многих морфологических характеристиках опухолевых клеток, а также о состоянии их микроокружения [1]. Оценка степени атипии, способности к инвазии и ме-тастазированию, пролиферативной активности клеточных элементов, особенностей кровоснабжения опухоли имеют важнейшее значение для понимания процессов роста и формирования злокачественных новообразований.
Целью исследования было проведение сравнительного морфологического анализа тканевой и субклеточной организации саркомы С-45 на различных стадиях её развития. Данная опухоль используется для проведения многих экспериментально-морфологических, биохимических и иммунологических исследований [4].
Материал и методы
Объектом исследования были беспородные крысы-самцы (n=20) весом 160-180 г, выращенные в ФГУ «РНИОН Росмедтехнологий». Животные содержались в стандартных условиях вивария при фиксированном световом режиме. Работу с животными проводили в соответствии с правилами «Европейской конвенции о защите животных, используемых в экспериментах» (Директива 86/609/ЕЕС). Штамм саркомы С-45 получен в лаборатории комбинированной терапии опухолей Института экспериментальной диагностики и терапии РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Суспензию клеток саркомы С-45 вводили крысам в подкожную жировую клетчатку области спины в индивидуальной дозе 0,5 мл (1х106 клеток).
Измерение линейных размеров опухоли проводили в трёх взаимно перпендикулярных
плоскостях, после чего определяли её объём по формуле
V = (а*вхс)хл/6. где а, в, с - линейные размеры опухоли в см,
V - объём опухоли.
Опухоли удаляли под эфирным наркозом через 8, 16, 23, 30 сут после трансплантации клеток С-45. Материал для светооптического исследования фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина. Серийные парафиновые срезы окрашивали гематоксилином-эозином и пикрофуксином по ван Гизону. Съёмку гистологических препаратов проводили на микроскопе Leica DM 4000 B с камерой Leica DFC 490 при помощи программного обеспечения Image Scope.
Материал для электронно-микроскопического исследования последовательно фиксировали в 2,5 % растворе глутаральдегида, 1 % OsO4 и после всех общепринятых этапов обработки заливали в Эпон-812. Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме Leica EM UC6, контрастировали цитратом свинца и просматривали в электронном микроскопе FEI Tecnai 12 Spirit при ускоряющем напряжении 80 кУ
Пролиферативную активность клеток саркомы С-45 оценивали путём подсчёта митотического индекса (МИ) - отношения числа фигур митотического деления на 1000 ядер (в %) не менее чем в 10 срезах.
Полученные данные обрабатывали статистическими методами с использованием пакета компьютерных программ «Microsoft Excel».
Результаты и обсуждение
Согласно результатам проведённых измерений, наиболее интенсивный рост опухоли происходил с 16-х по 30-е сут после трансплантации штамма С-45. К 16-м сут объём опухоли в абсолютных величинах достигал 0,56-0,75 см3, а на третьей неделе диапазон её роста колебался в пределах от 1,07 см3 до 36,5 см3 (рис. 1А). Средняя продолжительность жизни крыс после инокуляции штамма С-45 составляла 40 сут.
В первые две недели после трансплантации опухоли в ткани растущей саркомы отмечена достаточно высокая митотическая активность её клеточных элементов (рис. 1Б).
Анализ световых и электронно-оптических
снимков показал, что в ткани опухоли преобладает клеточный компонент. Полиморфные клетки имеют атипичные ядра и различный уровень дифференцированности. Между морфологически чётко различимыми округлыми (1-й тип) и веретеновидными (2-й тип) формами (рис. 1) существуют и промежуточные варианты. Ядра клеток 1-го типа содержат крупноглыбчатый, маргинированный хроматин, в ядрышках преобладает фибриллярный компонент. Немногочисленные органеллы представлены короткими, расширенными цистернами гранулярной эндоплазматической сети (грЭПС), отдельными митохондриями и свободными рибосомами (рис. 2А).
Клетки 2-го типа более дифференцированы, имеют ядра вытянутой формы с преобладанием диспергированного хроматина и 1-2 крупными
смЗ
40
30
20
10 5
0 1 !
8 сут 12 сут 16 сут 19 сут 23 сут 28 сут
Рис. 1А. Динамика роста саркомы С-45
8 сут 16 сут 23 сут 30 сут
Рис. 1Б. Уровень пролиферативной активности клеток саркомы С-45 в течение эксперимента
ядрышками в нуклеоплазме. В электронноплотном цитоплазматическом матриксе содержатся многочисленные свободные рибосомы, хорошо развитые элементы грЭПС, митохондрии, лизо-сомы, диктиосомы пластинчатого комплекса. Цистерны грЭПС часто дилатированы и заполнены мелкозернистым материалом. Пластинчатый комплекс состоит из 4-6 плотно упакованных цистерн, располагающихся в околоядерной зоне
Рис. 2А. Электронная микрофотография. Низкодифференцированная клетка опухоли 1-го типа с высоким ядерноцитоплазматическим отношением. Примечание: я - ядро, хр - хроматин, яш -ядрышко, л - лизосома, грЭПС - гранулярная эндоплазматическая сеть, м - митохондрия, эцм -экстрацел-люлярный матрикс. х9900
; и-
ШШт
шттшш
Рис. 2Б. Электронная микрофотография. Дифференцированная опухолевая клетка 2-го типа с хорошо развитыми органеллами биосинтеза в цитоплазме. Примечание: я - ядро, хр - хроматин, яш - ядрышко, л - лизосома, грЭПС -гранулярная эндоплаз-матическая сеть, м - митохондрия, эцм -экстрацеллюлярный матрикс. х8200
(рис. 2Б). Митохондрии полиморфны и иногда имеют признаки отёка. В мелкозернистом матриксе митохондрий хорошо различимы трубчатые, ламеллярные или везикулярные кристы, а также округлые электронно-плотные гранулы. Опухолевые клетки 2-го типа богаты включениями энергетических субстратов в виде розеток гликогена и липидных капель. Также в цитоплазме клеток хорошо развит аппарат внутриклеточного переваривания, представленный крупными вторичными лизосомами и остаточными тельцами. Часто встречаются вакуоли, осмиофильные гранулы и слоистые тельца. Клетки опухоли связаны между собой при помощи редких и примитивных десмосом, представляющих собой электронноплотные пластинки плазмолеммы соседних клеток.
Среди фигур митоза преобладают профазы и метафазы, реже встречаются ана- и телофазы. Нарушения митотического деления, такие как фрагментация хромосом, отставание хромосом в метакинезе и К-митоз, зарегистрированы во все сроки наблюдений. С 8-х по 30-е сут эксперимента в опухоли наблюдалось постепенное снижение показателей МИ. С 16-х сут развития в ткани опухоли обнаруживаются многочисленные миофибробласты, содержащие в цитоплазме толстые пучки актиновых филаментов, ориентированных параллельно длинной оси клетки.
Уже на 2-й нед после образования опухоли в ней появляются поля некроза и полости, заполненные опалесцирующей желтоватобурой жидкостью. На микроскопическом уровне наблюдаются проявления пикноза, кариорексиса, лизиса и вакуолизации клеток. Однако лейкоцитарно-лимфоцитарная инфильтрация в некротических очагах выражена незначительно.
При изучении микроциркуляторного русла опухоли нами обнаружено два типа капилляров, имеющих разную локализацию и характерные морфологические признаки. Капилляры, расположенные в глубине опухоли, практически лишены базальной мембраны и имеют неравномерный просвет. В обильной электронносветлой цитоплазме эндотелиоцитов содержатся рибосомы, овальные митохондрии с плотно упакованными кристами, отдельные цистерны грЭПС, крупные капли липидов (рис. 3А).
Рис. 3А. Электронная микрофотография. Ультраструктура
капилляров в центральных зонах опухоли. Примечание: эцм - экстрацеллюлярный матрикс, эк - эндотелиальная клетка, пк-просвет капилляра, я - ядро, лк - липидные капли, м - митохондрия, п - перициты, эр - эритроцит, кв - коллагеновые волокна. х20500
Отсутствие перицитов указывает на незрелость системы микроциркуляции [3]. Капилляры, имеющие субкапсулярную локализацию, как правило, окружены одним-двумя слоями перицитов. Эндотелиоциты имеют электронноплотную цитоплазму, бедную органеллами (рис. 3Б).
Заключение
Проведённый светооптический и электронномикроскопический анализ позволяет отнести саркому С-45 к дифференцированным опухолям мезенхимального происхождения. Данная опухоль характеризуется экспансивным ростом, полиморфизмом клеточного состава и умеренной васкуляризацией. Можно предполагать о наличии в ткани саркомы С-45 системы открытого кровообращения, поскольку эндотелио-циты часто не образуют замкнутых трубок, а форменные элементы присутствуют не только в просвете сосудов, но и среди опухолевых клеток. По мере развития опухоли проявляется тенденция к её неравномерному росту [2]. Наиболее выраженные индивидуальные отклонения
Рис. 3Б. Электронная микрофотография. Ультраструктура капилляров в субкапсулярных зонах опухоли. Примечание: эцм - экстрацеллюлярный матрикс, эк - эндотелиальная клетка, пк-просвет капилляра, я - ядро, лк - липидные капли, м - митохондрия, п - перициты, эр - эритроцит, кв - коллагеновые волокна. х6000
объёма опухоли наблюдаются у животных с 16-х по 30-е сут после трансплантации штамма С-45. Одним из наблюдавшихся нарушений нормальных морфогенетических реакций стало появление опухолевых клеток с ярко выраженным локомоторным фенотипом. Поскольку у 4 из 20 животных наблюдалось резкое замедление роста опухоли, данный факт необходимо учитывать при формировании групп животных в ходе выполнения экспериментальных работ.
ЛИТЕРАТУРА
1. Григорьева Е.В. Исследование альтеративных процессов в опухолевой ткани при химиотерапии // Морфолопя. 2009. Т. 3, № 4. С. 14-18.
2. Зинченко В.А., Орёл В.Э., Белов Ю.А., Дзятковская Н.Н. Нелинейная кинетика роста опухолей саркомы-45 и изменения пространственного хаоса формы злокачественных клеток после влияния механохимически активированного доксорубицина, очень высокочастотного облучения и их комбинированного действия // Биополимеры и клетка. 2005. Т. 21, № 1. С. 64-69.
3. Abramsson A., Berlin O., Papayan H. et al. Analysis of mural cell recruitment to tumor vessels // Circulation. 2002. Vol. 105 (1). Р 112-117.
4. Orel V.E., Dzyatkovskaya N.N., Romanov A.V., Kozarenko T.M. The effect of electromagnetic field and local inductive hyperthermia on nonlinear dynamics of the growtth of transplanted animal tumors // Exp. Oncol. 2007. Vol. 29 (2). P 156-158.
Поступила 21.10.10
