CC BY
7
Schultheiß, С. Next-Generation Sequencing of Т and В Cell Receptor Repertoires from COVID-19 Patients Showed Signatures Associated with Severity of Disease / C. Schultheiß, L. Paschold, D. Simnica [et al.]. - Text: electronic // Immunity. - 2020. - No. 53. - P. 442-455. - URL: https://doi. org/10.1016/j.immuni.2020.06.024
Осидак, JI. В. Коронавирусная инфекция : Этиология, эпидемиология, клинико-лабораторная характеристика, противовирусная терапия : пособие для врачей / Л. В. Осидак, А. Я. Мурадян, Н. Б. Румель, В. П. Дриневский. — Санкт-Петербург : Человек, 2007. — 64 с. - ISBN 5-93339-096-8. - Текст: непосредственный.
Пащенков, М. В. Иммунный ответ против эпидемических коронави-русов / М. В. Пащенков, М. Р. Хаитов. - Текст: непосредственный // Иммунология. - 2020. - Т. 41. - № 1. - С. 5-17.
Huang, С. Clinical features of patients infected with 2019 novel Coronavirus in Wuhan, China / C. Huang, Y. Wang, X. Li [et al.]. - Text: electronic // Lancet. - 2020. - No. 395. - P. 497-506. URL: https://doi.org/10.1016/ S0140-6736(20)30183-5
Channappanavar, R. Pathogenic human Coronavirus infections: causes and consequences of cytokine äfflm and immunopathology / R. Channappanavar, S. Perlman. -Text: electronic // Semin. Immunopathol. -2017. -No. 39(5). -P. 529-39. - URL: https://DOI 10.1007/s00281-017-0629-x Маянский. A. H. Клинические аспекты фагоцитоза / A. H. Маянский. О. И. Пикуза. -Казань : Магариф. 1993. -192с. -ISBN 5-7761-0163-8. -Текст: непосредственный.
УДК 591.87:591.463.2: [577.114/. 115:579.842.11]:599.323.4
Е. А. ПОПЛАВСКАЯ, Е. Н. ХИЛЬМАНОВИЧ, Д. Ю. ПОПЛАВСКИЙ, В. В. ДАНИЛЮК УЛЬТРАСТРУКТУРА КЛЕТОК СПЕРМАТОГЕННОГО ЭПИТЕЛИЯ СЕМЕННИКОВ КРЫС В РАННИЕ СРОКИ ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ЛИПОПОЛИСАХАРИДА ESCHERICHIA COLI
Гродненский государственный медицинский университет, Республика Беларусь
E. A. POPLAVSKAJA E. N. HILMANOVICH, D. JU. POPLAVSKIJ, V. V. DANILYUK ULTRASTRUCTURE OF CELLS OF SPERMATOGENIC EPITHELIUM OF RATS TESTIS IN THE EARLY PERIODS AFTER EXPOSURE OF LIPOPOLYSACCHARIDE ESCHERICHIA COLI
Grodno State Medical University, Republic of Belarus
Резюме. Нарушение репродуктивной функции у мужчин имеет не только медицинскую, но и социальную значимость. Известно, что нарушения в женском организме являются причиной невозможности иметь детей только в 40 % случаев, в остальных имеют место либо изменения со стороны мужской половой сферы, либо сочетанная патология. Интерес к мужской репродуктивной функции вызван появлением большого количества сообщений об увеличении случаев заболеваний мужской половой системы, о снижении количественных и качественных характеристик спермы, а также о значении лп'жской патологии в формировании бесплодия в браке. Целью работы явилось изучение влияния бактериального ЛПС Е. coli, введенного самцам крыс, на ультраструктуру клеток сперматогенного эпителия семенников крыс в ранние сроки после воздействия. Методика. Эксперимент проведен на 12 половозрелых самцах белых крыс. Самцам опытной группы вводили ЛПС Е. coli в дозе 50мкг/кгмассы внутрибрюшинно, однократно. Самцам контрольной группы - физиологический раствор в эквиобъемном количестве. Забор материала осуществляли на 3-й сутки после воздействия. Результаты. Анализультраструктуры теток сперматогенного эпителия показал, что введение бактериапьногоЛПСЕ. coli самцам крыс на 3-и сутки после воздействия приводит кулынраструктур-ным изменениям теток сперматогенного эпителия семенников опытных животных. Между тетками сперматогенного эпителия наблюдается появление широких вакуолеподобных пространств, часто достигающих значительных размеров. В сперматогониях регистрируется активация ядерного аппарата, повреждение митохондрий и умеренная гиперплазия лизосомального аппарата. В цитоплазме спермато-цитов - гипертрофия митохондрий с единичными кристами и смещение их к плазмолемме, появление многочисленных фа-
голизосом. Сперматиды отличаются меньшими размерами и смещенным на периферию ядром, а также наличием признаков дегенерации как со стороны ядра, так и со стороны цитоплазмы. Затючение. Введение бактериального ЛПС Е. coli самцам крыс в ранние сроки после воздействия вызывает развитие разнообразныхультраструюпурных изменений в клетках сперматогенного эпителия семенников опытных животных. Вышеуказанные изменения свидетельствуют о напряженном функционировании клеток, обеспечиваюгцем адаптационные изменения и их относительную устойчивость в условиях воздействия ЛПС.
Ключевые слова: семенник, бактериальный липополисахарид, сперматогенез.
Abstract. Reproductive dysfunction in men has not only medical but also social significance. It is known that disorders in the female body are the reason for the impossibility of having children only in 40 % of cases, in the rest there are either changes in the male genital area or combined pathology. The interest in male reproductive function is caused by the appearance of a large number of reports about, an increase in the incidence of diseases of the male reproductive system, a decrease in the quantitative and qualitative characteristics of sperm, as well as the importance of male pathology in the formation of infertility in marriage. Objective. Study of the influence of the bacterial lipopolysaccharide E. coli, administered to male rats, on the ultrastructure of the testis in the early periods after exposure. Methods. Male rats were injected LPS E. coli at a dose of 50 /ig/kg of mass intraperitoneally, once. Males of the control group were injected physiological solution. Material was taken for the 3th day after exposure. Results. An analysis of the ultrastructure of the cells of the sperm otogenic epithelium showed that, the introduction of bacterial LPS of E. coli to male rats on the 3rd day after exposure leads to ult.rast.ruct.ural
changes in the cells of the spermatogenic epithelium of the testes of experimental animals. Between the cells of the spermatogenic epithelium the appearance of wide vacuole-like spaces, often reaching significant sizes, is obsen'ed. In spermatogonia activation of the nuclear apparatus, damage to mitochondria, and moderate hyperplasia of the lysosomal apparatus are recorded. In the cytoplasm of spermatocytes - hypertrophy of mitochondria with single cristae and their displacement to the plasmolemma, the appearance ofnumerous phagolysosomes. Spermatids are smaller and the nucleus is displaced to the periphery, as well as the presence of signs of degeneration both from the side of the nucleus andfrom the side of the cytoplasm. Conclusion. The introduction of bacterial LPS of E. coli to male rats in the early periods after exposure causes the development of various ultrastructural changes in the cells of the spermatogenic epithelium of the testes of experimental animals. The above changes indicate intense functioning of cells, providing adaptive changes and their relative resistance to the effects of LPS.
Key words: tetfis, bacterial lipopolysaccharide, spermatogenesis.
В последнее время нарушение репродуктивной функции у мужчин приобрело особую медицинскую и социальную значимость. Известно, что нарушения в женском организме являются причиной невозможности иметь детей только в 40 % случаев, в остальных имеют место либо изменения со стороны мужской половой сферы, либо сочетанная патология [1—4]. Интерес к мужской репродуктивной функции вызван появлением большого количества сообщений об увеличении случаев заболеваний мужской половой системы, о снижении количественных и качественных характеристик спермы, а также о значении мужской патологии в формировании бесплодия в браке. Демографические показатели во многих странах мира свидетельствуют об увеличении числа мужчин с нарушенной фертильностью, составляющей в среднем 30-50 % от всех причин бесплодия браков [1, 5, 10].
Мужское бесплодие - состояние, которое является следствием ряда заболеваний и патологических воздействий на репродуктивную систему мужчины [5]. В настоящее время во всем мире прослеживается тенденция к снижению активности сперматогенной функции у мужчин, что отражает возрастающее воздействие на организм человека ряда факторов [6]. Причины этого состояния и структура до сих пор излагаются нечетко и противоречиво, несмотря на изученный внушительный перечень факторов, нарушающих сперматогенез. Нередки ситуации, когда идентифицировать конкретный специфический этиологический фактор нарушения фертильности не удается. Причина изменений параметров эякулята с изменением количества, подвижности и морфологии сперматозоидов в большинстве случаев остается неизвестной ввиду полиэтиологической природы заболевания и многофакторности патогенетических механизмов его развития. Актуальность изучения специфичности действия различных неблагоприятных факторов на сперматогенез продиктована и тем, что до сих пор нет четких разграничений между степенью
угнетения сперматогенеза под влиянием какого-либо фактора. Более того, нет единой модели угнетения мужской репродуктивной функции, объясняющей включение различных составляющих репродз ктивно-го аппарата в зависимости от направленности и степени действия неблагоприятного фактора [7]. Несмотря на многочисленные научные исследования последних лет, которые позволили нам погрузиться в проблему настолько глубоко, что мы стали говорить о качестве ДНК сперматозоидов, различных эпигенетических механизмах регуляции сперматогенеза, а также о других возможных факторах, которые могут оказывать влияние на данный процесс, мы все еще далеки от понимания истинных причин мужского бесплодия в каждом конкретном случае [3, 11].
Сперматогенез является одним из наиболее динамичных процессов в организме, что делает его крайне чувствительным к действию повреждающих агентов, включая и липополисахариды грамотрицательных микроорганизмов [9]. Бактериальные липополисахариды (ЛПС) - это постоянный структурный компонент клеточных мембран грамотрицательных бактерий, интерес к которым обусловлен не только их уникальной структурой и широким разнообразием вызываемых эффектов, но и тем, что организм человека постоянно контактирует с достаточно большим количеством этого токсина, обеспечивая поддержание гомеостаза, адаптацию организма к стрессовым воздействиям, способствуя предотвращению проникновения потенциально патогенной флоры в кровоток, стимулируя иммунитет и неспецифическую резистентность организма, при этом обладая выраженным токсическим эффектом [4, 8].
Ранее в наших работах представлены исследования по влиянию бактериальных ЛПС на структуру семенников крыс как в раннем, так и в отдаленном периоде после воздействия [9]. При этом представляет несомненный интерес исследование влияния липополисахаридов грамотрицательных бактерий на ультраструктуру клеток семенников крыс, что и явилось целью нашей работы.
Материалы и методы. Объектом исследования являлись половозрелые самцы беспородных белых крыс. Агентом воздействия - липополисахарид Escherichia coli (Е. coli) производства фирмы «Sigma», США. Эксперимент проведен с учетом «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». Все этапы исследования проводились с разрешения комиссии по биомедицинской этике учреждения образования «Гродненский государственный медицинский университет». В эксперименте было использовано 12 самцов беспородных белых крыс, массой 230 ± 30 граммов. Из самцов были сформированы одна опытная и одна контрольная группы. Самцам опытной группы вводили ЛПС Е. coli в дозе 50 мкг/кг массы внутри-брюшинно, однократно. Самцам контрольной группы вводили физиологический раствор в эквиобъемном количестве. Самцов экспериментальных групп на 3-й сутки после воздействия ЛПС Е. coli усыпляли пара-
ми эфира с последующей декаиитацией. Животных вскрывали и выделяли семенники. Часть семенника фиксировали в 1 % растворе четырехокиси осмия на ОД М буфере Миллонига, pH 7,4, при 4° С в течение 2 часов, образцы заливали в аралдит, готовили полутонкие срезы (400 им) и окрашивали метиленовым синим для электронно-микроскопического исследования. Электронно-микроскопические препараты изучали в электронном микроскопе JEM-1011 (JEOL, Япония) при увеличениях 5000-20 000 при ускоряющем напряжении 80 кВт. Для получения снимков использовался комплекс из цифровой камеры Olympus MegaView III (Olympus Soft Imaging Solutions, Германия).
Для предотвращения систематической ошибки измерений образцы семенников от сравниваемых контрольных и опытных животных обрабатывали параллельно в одинаковых условиях. Погрешность измерений составила менее 5 %. В результате морфометрических исследований получены количественные непрерывные данные. Их обрабатывали с помощью лицензионной компьютерной программы Statistica 6.0 для Windows (StatSoft, Inc., США, серийный номер 31415926535897) с применением описательной статистики. Для каждого показателя определяли значение медианы (Me) и ин-терквартильного диапазона (IQR). Сравнение групп по одному признаку проводили с помощью критерия Манна - Уитни для независимых выборок (Mann -Whitney U-test). Различия между группами считали статистически значимыми, если вероятность ошибочной оценки не превышала 5 % (р < 0,05).
Результаты и обсуждение. В извитых семенных канальцах контрольных животных присутствуют сперматогонии типа А (светлые) и типа Б (темные), однако преобладают сперматогонии типа А. Это клетки небольших размеров, круглой или овальной формы, со сферическим ядром и мелкозернистым, но доста-
точно плотно расположенным хроматином. Ядрышки располагаются преимущественно в центре. В цитоплазме хорошо развиты органеллы (рис. 1). Результаты электронно-микроскопического исследования воздействия бактериального ЛПС Е. coli, введенного самцам крыс, показали, что у опытных животных преимущественно встречаются сперматогонии типа А, в которых имеется округлое, высокой электронной плотности ядро с крупноглыбчатым хроматином, который может иметь различную локализацию (рис. 1). Ядрышки в ядре располагаются эксцентрично. Цитоплазма сперматогоний типа А бедна органеллами. В некоторых - встречаются лизосомы с электронноплотным содержимым, которые могут иметь различную локализацию и размеры. Также встречаются незначительные скопления митохондрий низкой электронной плотности, с разной степенью фрагментации и редукции крист и просветленным митохондриальным матриксом. Наблюдается появление широких вакуолеподобных пространств между клетками сперматогенного эпителия, достигающих значительных размеров (рис. 2).
Первичные сперматоциты встречаются реже, чем в контроле. Имеют овальную форму. Ядра округлые, крупные. Хроматин мелкозернистый, равномерно распределен в кариоплазме. Цитоплазма клеток отличается слабой электронной плотностью с небольшим количеством органелл (рис. 3). Митохондрии - с единичными кристами и просветленным матриксом (рис. 4).
В семенных канальцах как контрольных, так и опытных животных встречаются сперматиды на разных стадиях формирования (отличаются небольшими размерами и ядром, смещенным на периферию). Рядом с ядром хорошо развит комплекс Гольджи с вакуольными и межвезикулярными образованиями и цистернами. Митохондрии имеют в основном периферическое расположение. Их кристы в цитоплазме распределены
Рисунок 1 - Сперматогонии типа А и типа Б в извитом семенном канальце семенника контрольной крысы (А) и на 3-й сутки после воздействия ЛПС Е. coli (Б). Сперматогонии типа А (СгА), сперматогонии типа Б (СгБ), базалъная мембрана (БМ) Масштабный отрезок равен 2 мкм. Электронограмма. Ув. 8000
Рисунок 2 - Кру пноглыбчатый хроматин в сперматогониях типа А извитого семенного канальца семенника крысы на 3-й сутки после воздействия ЛПС Е. coli
Базалъная мембрана извитого канальца (БМ),
ядро сперматогонии (Я), ядрышко (Ядр), плазмолемма (Пл),
вакуолеподобные пространства (ВП).
Масштабный отрезок равен 5 мкм. Электронограмма.
Ув. 5000
Рисунок 4 - Фрагмент первичного сперматоцита извитого семенного канальца семенника у крысы на 3-й сутки после воздействия ЛПС Е. coli
Ядро первичного сперматоцита (Я), цитоплазма (Ц),
митохондрии (Мх). Митохондрии с единичными криста-
ми и просветленным матриксом.
Масштабный отрезок равен 2 мкм. Электронограмма. Ув. 15 ООО
неупорядоченно. Клетки бедны органеллами. Рядом с ядром хорошо развит комплекс Гольджи с вакуольными и межвезикулярными образованиями и цистернами. Митохондрии имеют в основном периферическое расположение. Их кристы в цитоплазме распределены неупорядоченно (рис. 5).
В канальцах много формирующихся спермиев, находящихся на различных этапах формирования, в том числе и дегенеративных. При всем при этом присутствуют и нормально формирующиеся спермин.
Заключение. Результаты проведенного электронно-микроскопического исследования семенников крыс позволили оценить изменения, происходящие в изучаемом органе в ответ на воздействие бактериального липополисахарида Е. coli. Введение бактериального липополисахарида Е. coli самцам крыс в дозе 50 мкг/ кг массы внутрибрюшинно, однократно в ранние сроки после воздействия (3-й сутки) вызывает развитие разнообразных ультраструктурных изменений в семенниках животных.
Рисунок 3 - Первичный сперматоцит извитого семенного канальца семенника у контрольной крысы и на 3-й сутки после воздействия ЛПС Е. coli
Ядро первичного сперматоцита (Я), ядрышко (Ядр), цитоплазма (Ц). Масштабный отрезок равен 2 мкм. Электронограмма. Ув. 8000
Рисунок 5 - Сперматиды извитого семенного канальца семенника у контрольной крысы (А) и у крысы на 3-й сутки после воздействия ЛПС Е. coli (Б) Масштабный отрезок равен 5 мкм. Электронограмма. Ув. 6000
В сперматогониях наблюдается активация ядерного аппарата, повреждение митохондрий и умеренная гиперплазия лизосомального аппарата. В цитоплазме первичных сперматоцитов - гипертрофия митохондрий и смещение их к плазмолемме, появление многочисленных фаголизосом. Вторичные серматоциты отличаются округлыми ядрами, гранулы хроматина в котором распределены неравномерно, ядрышки со слабовыра-женной электронной плотностью. Митохондрии в цитоплазме встречаются редко, смещены к цитолемме, с единичными кристами, при этом цитолемма имеет многочисленные поры. Сперматиды уменьшены в размерах и бедны органеллами. Среди них встречаются клетки с признаками дегенерации как со стороны ядра, так и со стороны цитоплазмы и органелл. Наблюдается появление широких вакуолеподобных пространств между клетками сперматогенного эпителия, часто достигающих значительных размеров.
Известно, что важную роль в обеспечении процессов сперматогенеза играют интерстициальные эндокриноциты, синтезирующие тестостерон, и су-стентоциты, обеспечивающие развитие клеток сперматогенного эпителия извитых семенных канальцев семенника [12]. Поскольку ранее в наших работах показаны структурные изменения в клетках эпите-лиосперматогенного слоя семенников крыс опытных животных, которые также сопровождались и нарушениями метаболизма [9], в настоящей работе имеет место подтверждение этих изменений и на ультраструктурном уровне. Вышеуказанные изменения свидетельствуют о напряженном функционировании клеток сперматогенного эпителия извитых семенных канальцев семенников, обеспечивающем адаптационные изменения и их относительную устойчивость в условиях воздействия ЛПС.
__Литература:_
1. Аполихин, О. И. Анализ уронефрологической заболеваемости в Российской Федерации по данным официальной статистики / О. И. Аполихин, А. В. Сивков, Д. А. Бешлиев [и др.]. - Текст : непосредственный//Экспериментальная и клиническая урология. - 2010. -№1. -С. 4-11.
2. Диагностика и лечение заболеваний половой сферы у мужчин / С. Б. Артифексов, Д. И. Рыжаков. -Н. Новгород : НГМА, 2003. - 236 с. -Текст : непосредственный.
3. Безруков, Е. А. Влияние факторов окружающей среды и образа жизни на репродуктивный потенциал мужчины / Е. А. Безруков, А. В. Проскура. - Текст : непосредственный // Проблемы репродукции. - 2016. -№ 5. - С. 133-140.
4. Бондаренко, В. М. Молекулярные аспекты повреждающего действия бактериальных липополисахаридов/В. М. Бондаренко,Е. В. Рябиченко, Л. Г. Веткова. - Текст : непосредственный // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2004. - № 3. - С. 98-105.
5. Божедомов, В. А. Мужской фактор бездетного брака - пути решения проблемы/В. А. Божедомов. - Текст : непосредственный//Урология. -2016. -№ 1 (Приложение 1). - С. 28-34.
6. О чем говорит спермограмма : методические рекомендации / Е. И. Карпов, А. М. Ананьин, Б. А. Ананьин. - Рязань, 2015. - 22 с. -Текст : непосредственный.
7. Логинов, П. В. Репродуктивная функция мужчин, подверженных воздействию неблагоприятных факторов / П. В. Логинов. - Текст : непосредственный // Фундаментальные исследования. - 2015. -№2-27. -С. 6043-6049. '
8. Никитин, А. И. Факторы среды и репродуктивная система человека / А. И. Никитин. - Текст ; непосредственный// Морфология. - 1998. -№6. -С. 7-16.
9. Поплавская, Е. А. Сравнительная характеристика структуры семенников крыс в ранние сроки после воздействия бактериальных липополи-сахаридовЕ. coli и S. marcescens/E. А. Поплавская, Д. Ю. Поплавский, Е. H. Хильманович. - Текст : непосредственный//Новостимедико-био-логических наук. - 2019. - Т. 19. - № 1. - С. 46-50.
10. Шевырин, А. А. Современный взгляд на лечение нарушений мужской фертильной функции/А. А. Шевырин. - Текст : непосредственный// РМЖ «Медицинское обозрение». - 2018. -№ 12. - С. 30-35.
11. Benchaib, M. Sperm DNA fragmentation decreases the pregnancy rate in an assisted reproductive technique / M. Benchaib, V. Braun, J. Lornage [et al.]. - Text : unmediated // Human Reproduction. - 2003. - Vol. 18, №5.-P. 1023-1028.
12. Johnson, L. Role of Sertoli cell number and function on regulation of spermatogenesis/L. Johnson,D. L. Jr Thompson,D. D. Varner. -Text : unmediated//Animal Reproduction Science. -2008. - Vol. 105, № 1/2. -P. 23-51.
