CC BY
35
УДК 616-092.12 : 612.6
СТРУКТУРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В СЕМЕННИКАХ КРЫС ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ БАКТЕРИАЛЬНОГО ЛИПОПОЛИСАХАРИДА E. COLI НА ТРЕТЬИ СУТКИ
ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ
Поплавская Е. Л., Лис Р. Е, Кравчук Р.И.
УО «Гродненский государственный медицинский университет», Гродно, Беларусь
Исследовалось влияние липополисахаридов грамотрицательных микроорганизмов на структурные изменения семенников крыс на 3-и сутки после воздействия. В процессе исследования установлено, что введение ЛПС Е. coli самцам крыс вызывает развитие патологических изменений в семенниках животных опытных групп, которые выражаются в появлении отёка межканальцевой стромы и уменьшении в ней числа интерстициальных эндокри-ноцитов и размеров их ядер. А также приводит к изменению количества и морфологии клеток сперматогенного эпителия (сустентоцитов и сперматоцитов), что подтверждается и на электронно-микроскопическом уровне.
Ключевые слова: липополисахариды, семенник, сперматогенез.
Введение
В настоящее время во многих странах мира, включая и нашу страну, наблюдается неблагоприятная демографическая ситуация. Анализ причин сложившейся ситуации показывает, что на формирование негативных процессов в демографии влияет сложный комплекс неблагоприятных факторов, в том числе и биологических - мужское и женское бесплодие, атакже возрастание числа невынашиваний беременности [7, 8]. Частота невынашивания беременности колеблется от 10 до 25% всех клинически диагностированных беременностей. Около 80% выкидышей происходит до 12 недель беременности. Полагают, что в статистику не входит большое количество очень ранних и субклинически протекающих беременностей [1,10].
В структуре невынашивания, особенно ранних потерь, одно из главных мест занимает неразвивающаяся беременность, частота которой в среднем составляет 18,9%. Ведущими причинами невынашивания беременности признаны генетические, эндокринные, иммунологические, а также инфекционные, составляющие 27%, возбудителями которых выступают как грамположительные, так и грамотрицательные микроорганизмы [3, 4].
Кроме жизнеспособных микробов эмбриотокси-ческое действие оказывают и их эндотоксины, представляющие собой липополисахариды. Известно, что бактериальные липополисахариды при воздействии на организм матери во время беременности вызывают нарушение дифференциации тканей внутренних органов и коры головного мозга у плодов, врожденные пороки развития, токсическое поражение внутренних органов, которые лежат в основе патологии постнатального онтогенеза [5]. При этом наблюдается прямой контакт их эндотоксинов с организмом матери. Все вышеприведённые факты ставят во главу угла в этиологии прерывания беременности или нарушений процессов антенатального развития только взаимоотношение организма матери и зародыша [2]. Согласно нашим исследованиям, прерывание беременности в доимплантационный период происходит и при воздействии липополисахаридов грамотрицательных бактерий на организм самцов перед спариванием с интактными самками. В данном случае прямое действие липополисахаридов на зародыш исключается, так как единственным посредником между организмом самки и самца является сперматозоид [6, 7]. Исходя из этого, можно предположить, что причиной репродуктивных потерь является нарушение сперматогенеза под воздействием
липополисахаридов грамотрицательных микроорганизмов, что приводит к гибели зародыша и, как следствие, прерыванию беременности на ранних сроках.
Сперматогенез - сложный многостадийный процесс роста, созревания и формирования сперматозоидов из незрелых половых клеток. Нормальное его протекание требует скоординированного влияния многочисленных факторов (генетических, клеточных, гормональных и других). Подобная сложность делает сперматогенез «легкой мишенью» для всякого рода негативных воздействий, в том числе и липополисахаридов.
В связи с вышеизложенным представляет несомненный интерес исследование влияния бактериальных ЛПС грамотрицательных бактерий на сперматогенез. Исходя из этого, в работе поставлена цель: изучить структурные изменения в семенниках крыс после воздействия бактериальных липополи-сахаридов грамотрицательных микроорганизмов.
Материалы и методы исследования
Объектом исследования являлись половозрелые самцы беспородных белых крыс. Агентом воздействия выбраны бактериальные липополисахариды Escherichia coli серотип 0111:B4 производство фирмы «Sigma», США.
В эксперименте было использовано 78 самцов беспородных белых крыс. Масса самцов составляла 200 - 250 г. Все животные содержались в стандартных условиях вивария с соблюдением требований, изложенных в Хельсинкской декларации о гуманном обращении с животными. Все этапы исследования проводились с разрешения комиссии по биомедицинской этике учреждения образования «Гродненский государственный медицинский университет».
Из самцов сформировали опытную и контрольную группы. Самцам опытной группы вводился ЛПС E. coli в дозе 50 мкг/кг массы внутрибрюшинно, однократно. Самцам контрольной группы вводился физиологический раствор в эквиобъёмном количестве. На 3-и сутки после воздействия самцов экспериментальных групп усыпляли парами эфира с последующей декапитацией. Животных вскрывали и выделяли семенники. Одну часть семенников фиксировали в жидкости Карнуа, готовили парафиновые срезы толщиной 5 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином. Вторую часть семенника фиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия на 0.1 М буфере Миллонига, рН 7.4, при 40С в течение 2 часов, образцы заливали в аралдит, готовили полутонкие срезы (400 нм) и окрашивали метиленовым синим для
электронно-микроскопического исследования. На окрашенных гематоксилином и эозином гистологических препаратах определяли диаметр перитубу-лярных гемокапилляров в межканальцевой строме, подсчитывали количество интерстициальных клеток в поле зрения и площадь их ядер, количество поддерживающих клеток в канальце и площадь их ядер и среднее количество первичных сперматоцитов. Электронно-микроскопические препараты изучали в электронном микроскопе JEM-1011 (JEOL, Япония) при увеличениях 5 000-20 000 при ускоряющем напряжении 80 кВт. Для получения снимков использовался комплекс из цифровой камеры Olympus MegaView III (Olympus Soft Imaging Solutions, Германия). Иллюстративный материал получали с помощью цифровой фотокамеры Leica DFC 320 в комплексе с микроскопом Axioscop 2 plus (Carl Zeiss, Германия).
Результаты и обсуждение В семенниках опытных животных наблюдается отечность межканальцевой стромы, а в ней значительное уменьшение числа интерстициальных эндокриноцитов. Последние отличаются полиморфизмом, располагаются преимущественно группами, имеют отростчатую форму. Цитоплазма клеток зачастую вакуолизирована и отличается неравномерно распределенной и разной по тинкториальным свойствам зернистостью. Экспериментально установлено, что количество интерстициальных эндокри-ноцитов в межканальцевой строме статитстически достоверно снижено по сравнению с контрольными животными на 13,85% (Z=2,40, p=0,01) (таблица 1). Площадь ядер, как показали данные морфо-метрии, уменьшена по сравнению с контрольными животными на 23,06% (Z=1,96, p=0,04) (таблица 1).
Таблица 1. - Количество интерстициальных эндо-криноцитов, сустентоцитов и размеры их ядер, спер-матоцитов и диаметр гемокапилляров семенников крыс экспериментальных животных на 3 сутки после воздействия ЛПС E. coli (Ме (Q1; Q2))
JW
Я
л *
£ У- Ь %
и J\k . л
-ч РШЩГ ^ 6N k f
- /
А
ar
Ч
Б
Рисунок 1. - Сустентоциты семенников крыс контрольной группы (А), и у крыс, на 3-и сутки после
воздействия ЛПС E. coli (Б). Вакуолизация цитоплазмы клеток в опытной группе. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. об. 100
Исследуемые параметры Контроль n = 6 Опыт n = 6
количество интерстициальных клеток 8,23 (8,07; 8,38) 7,09*| (6,48; 7,20)
площадь ядер интерстициальных клеток 23,76 (23,57; 24,65) 18,28*| (16,51; 19,41)
количество сустентоцитов 22,33 (20,91; 23,21) 16,58 (15,02; 17,05)
площадь ядер сустентоцитов 48,67 (46,22; 50,70) 40,32 *| (40,02; 41,03)
количество сперматоцитов 41,63 (40,74; 42,21) 30,58*| (29,02; 32,64)
диаметр гемокапилляров 10,76 (10,14; 11,71) 13,68*| (12,43; 14,86)
Примечания - * -р<0,05 при сравнении с контролем; статистически значимое повышение изучаемого параметра
Сустентоциты в канальцах контрольных групп выделяются отчётливо. Основания клеток лежат на базальной мембране между сперматогония-ми, верхушки обращены к просвету канальца. В опытных группах на светооптическом уровне в
сустентоцитах наблюдаются выраженные морфологические изменения, заключающиеся в вакуолизации цитоплазмы клеток, в отдельных участках канальца наблюдается гибель клеток (рисунок 1).
При сравнительном количественном анализе су-стентоцитов установлено снижение их количества и уменьшение площади их ядер на 3-и сутки после воздействия ЛПС E. coli по сравнению с контрольными показателями: количе-ство клеток уменьшилось на 25,65% (Z=2,61, p=0,006), площадь их ядер - на 17,15% (Z=2,12, p=0,03) (таблица 1, рисунок 1).
Сперматоциты, располагающиеся в боковых впя-чиваниях сустентоцитов - крупные, округлой или овальной формы, несколько удалены от базальной мембраны извитого канальца, образуя несколько ярусов. В их ядрах хорошо выражен рисунок гете-рохроматина (рисунок 2). Анализ количества спер-матоцитов на срезе канальца показал, что у самцов, получавших ЛПС E. coli, на 3-и сутки после введения происходит снижение среднего количества клеток по сравнению с таковым у контрольных животных (таблица 1, рисунок 2) на 26,54% (Z=2,40, p=0,01).
Перитубуллярные гемокапилляры расширены, в некоторых наблюдается гемостаз (рисунок 3). Их диаметр увеличивается на 3-и сутки после воздействия ЛПС на 27,13% (Z=-2,02, p=0,04) (табл. 1, рис. 3).
Б
Рисунок 2. - Сперматоциты в извитом канальце семенников у контрольным крыс (А) и у крыс, на 3-и сутки после однократного, внутрибрюшинного введения ЛПС E. coli (Б). Снижение количества сперматоцитов в канальце у крыс опытныш животныгх Окраска гематоксилином и эозином. Ув. об. 20
Рисунок 3. - Гемокапилляры в межканальцевой строме семенников крыс контрольной группы (А), и у крыс, на 3-и сутки после однократного, внутрибрюшинного введения ЛПС E. coli (Б). Расширение гемокапилляров. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. об. 40
Вышеуказанные изменения регистрировались и группе отмечается отечность межканальцевой стромы на электронно-микроскопическом уровне. В опытной и расширение кровеносных капилляров (рисунок 4).
Рисунок 4. - Кровеносный капилляр семенника контрольной группы (А) и на 3-и сутки после воздействия ЛПС E. coli (Б). Отёк межканальцевой стромы ирасширение кровеносного капилляра. Базальная мембрана эндотелиоцита (БМ), ядро эндотелиоцита (Я), эритроциты в просвете капилляра (Э). Масштабный отрезок равен 5 мкм. Электроно-
грамма. Ув. 6000
В интерстициальных эндокриноцитах выраженных патологических нарушений не наблюдается. Клетки располагаются группами или поодиночке. овальной формы, в цитоплазме присутствуют митохондрии с электронно-плотным матриксом. В ядрах выявляются от 1 до 3 ядрышек. При изучении оболочки извитого семенного канальца у опытных животных обращает на себя внимание отёчность базальной мембраны канальца (рисунок 5). Сустентоциты несколько удалены от базальной мембраны с единичными либо отсутствующими инвагинациями кариолеммы (рисунок 5,6). Хроматин мелкозернистый, равномерно распределенный в кариоплазме. Ядрышки с преобладанием гранулярного компонента, распределены неравномерно по кариоплазме ядра и смещены почти вплотную к ядерной оболочке либо отсутствуют (рисунок 6). В цитоплазме клеток в большом количестве обнаруживаются электронно-плотные довольно крупные скопления фаголизосом. Встречаются незначительные скопления митохондрий низкой электронной плотности, с разной степенью фрагментации и редукции крист и просветленным митохондриаль-ным матриксом. Цитоплазма бедна органеллами. Первичные сперматоциты встречаются реже, чем в контроле. Имеют овальную форму. Ядра округлые, крупные. Хроматин мелкозернистый, равномерно распределен в кариоплазме. Цитоплазма клеток отличается слабой электронной плотностью с небольшим количеством органелл (рисунок 5,6). Митохондрии с единичными кристами и просветленным матриксом.
Рисунок 5. - Эпителио-сперматогенный слой семенника крысы на 3-и сутки после воздействия ЛПСЕ. coli. Крупно-глыбчатый хроматин в сперматогониях типаА извитого
семенного канальца семенника Базальная мембрана извитогоканальца(БМ), сперматогония(Сг), сустентоцит (С), сперматоцит (Сц).
Масштабный отрезок равен 5 мкм.
Электронограмма. Ув. 5000
Литература
1. Баев, О.Р. Социально-медицинские аспекты репродуктивной функции у первородяшцх старше 30 лет / О.Р. Баев, В.С. Белоусова // Мать и дитя : материалы VI Российского форума, Москва, 12-15 октября 2004 / под ред. В.И. Кулакова. - М., 2004. -С. 560.
2. Беломестнов, С.Р. Качество гамет и особенности гормонального статуса мужчин из супружеских пар с неблагоприятным течением беременности /
Б
Рисунок 6- Сустентоциты извитого семенного канальца семенника контрольной крысы (А) и на 3-и сутки после воздействия ЛПС E. coli (Б)
Ядро (Я), ядрышко (Ядр), ядерная оболочка (ЯО), митохондрии (Мх). Масштабный отрезок равен 1 мкм.
Электронограмма. Ув. 10000
Вывод
Ввведение бактериального липополисахари-да Е. coli самцам крыс в дозе 50 мкг/кг массы вну-трибрюшинно, однократно, на 3-и сутки после воздействия, вызывает развитие патологических изменений в семенниках животных опытных групп, которые выражаются в появлении отёка межка-нальцевой стромы и уменьшении в ней числа ин-терстициальных эндокриноцитов и размеров их ядер, а также приводит к изменению количества и морфологии клеток сперматогенного эпителия (су-стентоцитов и сперматоцитов), что подтверждается и на электронно-микроскопическом уровне.
Literatura
1. Baev, O.R. Social'no-medicinskie aspekty' reproduktivnoj funkcii u pervorodyashhix starshe 30 let / O.R. Baev, V.S. Belousova // Mat' i ditya : materialy' VI Rossijskogo foruma, Moskva, 12-15 oktyabrya 2004 / pod red. V.I. Kulakova. - M., 2004. - S. 560.
2. Belomestnov, S.R. Kachestvo gamet i osobennosti gormonal'nogo statusa muzhchin iz supruzheskix par s neblagopriyatny'm techeniem beremennosti / S.R. Belomestnov, G.B. Mal'gina, V.I. Tokar' i dr.// Materialy' 4 Rossijskogo
С.Р. Беломестнов, Г.Б. Мальгина, В.И. Токарь и др.// Материалы 4 Российского форума «Мать и Дитя». М., 2004. С. 602-603.
3. Боб, Т.Д. Этиологические факторы неразвивающейся беременности / Т.Д. Боб // Бюл. мед. интернет-конф. - 2013. - Т. 3, № 3. - С. 660-661.
4. Доброхотова, Ю.Э. Неразвивающаяся беременность: аспекты этиологии. Возможности цитокинотерапии в программе реабилитации в раннем послеабортном периоде / Ю.Э. Доброхотова, Г.Т. Сухих, Р.И. Озерова // Рос. вестн. акушера-гинеколога. - 2006. - № 2. - С. 13-18.
5. Лис, Р.Е. Влияние бактериального липополи-сахарида продигиозана на антенатальный нейроге-нез коры больших полушарий плодов белых крыс / Р.Е. Лис, Ю.И. Бандажевский // Изв. АН БССР. Сер. биол. наук. - 1986. - № 4. - С. 76-79.
6. Лис Р.Е. Влияние бактериальных липополи-сахаридов E. coli и S. marcescens, введённых самцам крыс перед спариванием на развитие плодов / Р.Е. Лис, Е.А. Поплавская // Сборник статей «Актуальные проблемы медицины». - Гродно: ГрГМУ, 2010. - С. 17-21.
7. Поплавская, Е.А. Влияние бактериальных ли-пополисахаридов E. coli и S. marcescens, введённых самцам крыс перед спариванием на показатели пре- и постимплантационной гибели и развитие плодов / Е.А. Поплавская, Р.Е. Лис //Новости медико-биологических наук. News оf Вiomеdical Sciences. 2012. Т 6, № 4. - С.140-144.
8. Привалова, Н.И. Современные тенденции демографического развития Беларуси / Н.И. Привалова, Л.С. Станишевская // Наука и инновации. - 2014. -№ 2 (132). - С. 9-16.
9. Руководство по охране репродуктивного здоровья / В.И. Кулаков [и др.] ; под общ. ред. В.И. Кулакова - М. : Триада-Х, 2001. - 568 с.
10. Сидельникова, В.М. Привычная потеря беременности / В.М. Сидельникова. - М. : Триада-Х, 2005. - 303 с.
foruma «Mat' i Ditya». M., 2004. S. 602-603.
3. Bob, T.D. E'tiologicheskie faktory' nerazvivayushhejsya beremennosti / T.D. Bob // Byul. med. internet-konf. - 2013. -T. 3, № 3. - S. 660-661.
4. Dobroxotova, Yu.E'. Nerazvivayushhayasya beremennost': aspekty' e'tiologii. Vozmozhnosti citokinoterapii v programme reabilitacii v rannem posleabortnom periode / Yu.E'. Dobroxotova, G.T. Suxix, R.I. Ozerova // Ros. vestn. akushera-ginekologa. - 2006. - № 2. - S. 13-18.
5. Lis, R.E. Vliyanie bakterial'nogo lipopolisaxarida prodigiozana na antenatal'ny'j nejrogenez kory' bol'shix polusharij plodov bely'x kry's / R.E. Lis, Yu.I. Bandazhevskij // Izv. AN BSSR. Ser. biol. nauk. - 1986. - № 4. - S. 76-79.
6. Lis R.E. Vliyanie bakterial'ny'x lipopolisaxaridov E. coli i S. marcescens, vvedyonny'x samcam kry's pered sparivaniem na razvitie plodov / R.E. Lis, E.A. Poplavskaya // Sbornik statej «Aktual'ny'e problemy' mediciny'». - Grodno: GrGMU, 2010.
- S. 17-21.
7. Poplavskaya, E.A. Vliyanie bakterial'ny'x lipopolisaxaridov E. coli i S. marcescens, vvedyonny'x samcam kry's pered sparivaniem na pokazateli pre- i postimplantacionnoj gibeli i razvitie plodov / E.A. Poplavskaya, R.E. Lis //Novosti mediko-biologicheskix nauk. News of Viomedical Sciences. 2012. T 6, № 4. - S.140-144.
8. Privalova, N.I. Sovremenny'e tendencii demogra-ficheskogo razvitiya Belarusi / N.I. Privalova, L.S. Stanishevskaya // Nauka i innovacii. - 2014. - № 2 (132).
- S. 9-16.
9. Rukovodstvo po oxrane reproduktivnogo zdorov'ya / V.I. Kulakov [i dr.] ; pod obshh. red. V.I. Kulakova - M. : Triada-X, 2001. - 568 s.
10. Sidel'nikova, V.M. Privy'chnaya poterya beremennosti / V.M. Sidel'nikova. - M. : Triada-X, 2005. - 303 s.
STRUCTURAL CHANGES IN RAT TESTES EXPOSED TO BACTERIAL LIPOPOLYSACCHARIDE E.
COLI ON THE 3RD DAY AFTER EXPOSURE
Poplavskaya E.A, Lis R.E, Kravchuk R.I. Educational Establishment "Grodno State Medical University", Grodno, Belarus
The aim of the study was to evaluate structural changes in the testes of rats on the third day after exposure to the bacterial lipopolysaccharide gram-negative microorganism Escherichia coli.
Bacterial lipopolysaccharide Escherichia coli (serotype 0111: B4, manufactured by Sigma, USA) was administered to male rats at a dose of 50 mkg/kg intraperitoneally one time. Research methods included histological, morphometrical, electron microscopy.
In the experimental animals there were detected a decrease in the number of interstitial endocrine cells by 13.85% and a decrease in the area of their nuclei by 23.06%; a decrease in the number of sustentocytes by 25.65% and reduction of the area of their nuclei by 17.15%; a decrease in the number of spermatocytes by 26.54%. Electron microscopic examination revealed swollen basement membrane of the tubules and ultrastructural changes in sustentocytes and spermatocytes.
Single administration of E. coli bacterial lipopolysaccharide to male rats at a dose of 50 mg/kg i.p., causes on the 3rd day after exposure development of pathological changes in the testes of the animals, which results in a reduction of interstitial endocrinocytes; reduction in the amount of sustentocytes and spermatocytes while reducing the size of their nuclei; changes in the ultrastructure of spermatogenic epithelium - in the form of large numbers ofphagolysosomes in the cytoplasm of sustentocytes and reduction of cristae in mitochondria.
Key words: lipopolysaccharide, testis, spermatogenesis.
Адрес для корреспонденции: e-mail:[email protected] Поступила 13.05.2015
