CC BY
21
Проблемы особо опасных инфекций, вып. 99, 2009
УДК 616.981.452:576.8.097.21
С.В.Дентовская, М.Е.Платонов, Т.И.Комбарова, Г.М.Титарева, И.В.Бахтеева, Р.З.Шайхутдинова,
С.А.Иванов, А.П.Анисимов
УКОРОЧЕНИЕ КОРА ЛИПОПОЛИСАХАРИДА СНИЖАЕТ ВИРУЛЕНТНОСТЬ YERSINIA PESTIS
ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», Оболенск
Ранее с помощью сайт-направленного мутагенеза генов, отвечающих за биосинтез корового олигосахарида липополисахарида, получен изогенный набор штаммов Y. pestis, включающий штамм дикого типа 231 и его производные с делециями структурных генов wabD, waaL, waaQ, waaE и hldE. В этой работе показано, что постепенное укорочение корового олигосахарида сопровождается снижением вирулентности при подкожном способе заражения мышей и морских свинок.
Ключевые слова: чумной микроб, ЛПС, кор, вирулентность.
Липополисахарид (ЛПС) - основной фактор патогенности грамотрицательных бактерий. В ходе своей дивергенции с возбудителем псевдотуберкулеза чумной микроб утратил способность синтезировать
S-форму ЛПС [7], что необходимо для проявления способности протеазы Pla активировать плазмино-ген. O-боковые полисахаридные цепи, характерные для S-формы ЛПС, синтезируемой Yersinia pseudotuberculosis, ингибируют активаторную способность Pla [6], что коррелирует со значительно выросшей, по сравнению с Y. pseudotuberculosis, вирулентностью Y pestis при подкожном способе заражения животных [4]. В серии предварительных экспериментов мы определили гены, ответственные за синтез корового олигосахарида Y. pestis, сконструировали наборы изогенных мутантов, отличающихся по степени редуцированности кора, и установили, что постепенное укорочение олигосахарида сопровождалось повышением чувствительности бактерий возбудителя чумы к действию факторов врожденного иммунитета
(комплементу сыворотки и катионным пептидам) [5] и утратой активатором плазминогена фибринолити-ческой и плазмокоагулазной активностей [2]. Целью настоящего исследования была оценка влияния степени укорочения корового олигосахарида на вирулентность Т pestis при подкожном заражении мышей и морских свинок.
Материалы и методы
Бактериальные штаммы и условия культивирования. Использованные в работе штаммы Т pestis представлены в таблице. Бактерии выращивали на питательной среде на основе сердечно-мозговой вытяжки (ВН1), pH 7,2. ВН1 агар с 5 % сахарозы использовали для селекции двойных рекомбинантов Т pestis, полученных с помощью гибридных плазмид на основе суицидного вектора рСУ0442 [3]. В случае необходимости в питательные среды добавляли антибиотики: ампициллин - 100 мкг/мл, канамицин -
Вирулентность экспериментальных штаммов возбудителя чумы при подкожном заражении лабораторных животных
Мыши Морские свинки
Штаммы Y. pestis Форма олигосахарида кора * LD50, КОЕ ** средние сроки жизни, сут ld50, кое средние сроки жизни, сут
231
231Д wabD
231Д waaL
231Д waaß
231Д waaE
231ДШЕ
Gal/DD-Hep-Hep Glc Ко
GlcNAc—Hep-Hep-Kdo-LA DD-Hep-Hep Glc Ko
GlcNAc -- -Hep- Hep-Kdo-LA Gal/DD-Hep-Hep Glc Ko
GIcNAc—Hep-Hep-Kdo-LA
GIcN Ас - He p-H ep-Kdo-LA Kdo-LA
2(1-4)
8(1-32)
13 (2-50)
5(1-16)
32
(8-126)
2,0-105
(5,0-104-7,9-105)
4,7±1,2
4,2±0,7
4,5±0,8
4,3±0,9
7,9±0,8
11,5±0,5
7 (2-27)
н/д ***
32
(8-126)
15
(4-58)
> 104 > 104
8,5±0,8
н/д ***
9,0±1,5
10,0±1,1
> 21
> 21
* Базовые структуры кора ЛПС и функции ферментов биосинтеза ЛПС Y. pestis дикого типа и мутантов, выращенных при 25 °C. Gal - p-D-галактоза; DD-Hep - D-глuцеро-a-D-манно-гептоза; GlcNAc - p-D-глюкозамин; Glc - p-D-глюкоза; Hep - ь-глицеро-а^-манно-гептоза; Kdo - 3 деокси-а^-манно-окт-2-улозоновая кислота; Ko - D-глuцеро-a-D-mало-окт-2-улозоновая кислота; LA - липид A. GlcNAc присутствует в нестехиометрическом количестве; остаток Ko частично заменен на остаток Kdo; глицин на остатке ld-HepI не показан.
** 95 % доверительный интервал представлен в круглых скобках.
*** Нет данных.
МИКРОБИОЛОГИЯ
40 мкг/мл, полимиксин В - 100 мкг/мл.
Мутагенез. Нокаутные мутанты получали с помощью конъюгативной передачи в клетки У. ре8ґі8 плазмид на основе суицидного вектора рСУВ442 [3]. Верификацию замены генов проводили с помощью полимеразой цепной реакции.
Оценку вирулентности проводили на мышах (18±2) г и морских свинках (260±20) г при подкожном введении десятикратных разведений (107 КОЕ-1 КОЕ и 104 КОЕ-101 КОЕ соответственно) 28-градусных культур У. ре8ІЇ8 в изотоническом растворе №С1 в объеме 0,1 мл на животное. Одной дозой заражали 5 мышей и 3 морские свинки. Наблюдение за зараженными животными проводили в течение 21 сут. Животных, погибших в ходе эксперимента или умерщвленных после его завершения, вскрывали и подвергали бактериологическому исследованию. Вычисление величин LD50 проводили по методу КагЬег в модификации И.П.Ашмарина и А.А.Во-робьева [1].
Результаты и обсуждение
Укорочение кора сопровождалось снижением вирулентности мутантов для лабораторных животных (таблица). Величина LD50 и средние сроки жизни мышей и морских свинок при заражении штаммами с мутациями по генам міаЬВ, м>ааЬ, waaQ (отвечающими за синтез галактозилтрансферазы, О-лигазы и гептозилтрансферазы III соответственно) были сопоставимы с результатами, полученными для исходного штамма 231. При этом для штамма ДwaaQ отсутствовала строгая корреляция между вирулентностью и устойчивостью к факторам врожденного иммунитета. Чувствительный к полимиксину В и сыворотке крови waaQ мутант [5] сохранял вирулентность на уровне исходного штамма 231. При заражении мышей дальнейшее укорочение кора сопровождалось достоверным увеличением LD50 и средней продолжительности жизни для мутанта waaE (нарушен синтез глюкозилтрансферазы). Мутант НМЕ (отсутствие продукции бифункциональной гептоза-7-фосфат-киназы / гептоза-1-фосфат-аденилилтрансферазы), сохранивший из структур кора только остатки Кдо, был наименее вирулентен. При заражении морских свинок оба мутанта (waaE и НМЕ не вызывали гибели животных в течение 21 сут.
Бактериологическое исследование селезенок всех животных, павших в ходе эксперимента, показало массивное обсеменение У. реиЫи. Из органов животных, выживших после заражения исходным штаммом 231 и его мутантами по генам wabD, waaL, waaQ (мыши и морские свинки) и waaE (мыши) на 22-е сутки после заражения выделить культуры чумного микроба не удалось. В то же время из селезенок обоих видов животных, зараженных штаммом 231ДhldE, и селезенок морских свинок, инфицированных культурой 231ДwaaE, на 22-е сутки после заражения удавалось стабильно высевать единичные
колонии возбудителя чумы.
Таким образом, укорочение кора «дикого типа» (9 моносахаридных остатков) до 5 моносахаридных остатков приводит к снижению вирулентности (при наблюдении за подкожно зараженными животными в течение 21 сут) для морских свинок не менее чем на 3 порядка, а до 3 моносахаридных остатков - к утрате вирулентности для обоих видов животных. Нельзя исключить, что при увеличении периода наблюдения за животными, из селезенок которых высевали Т pestis, в поздние сроки эксперимента могла бы произойти генерализация инфекции, ведущая к их гибели.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ
06-04-49280-а.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Медгиз; 1962. С. 85104.
2. Дентовская С.В., Платонов М.Е., Бахтеева И.В., Анисимов А.П. Наличие полной структуры кора липополиса-харида необходимо для активации плазминогена возбудителя чумы. Пробл. особо опасных инф. 2007; 1(93):49-51.
3. Donnenberg M.S., Kaper J.B. Construction of an eae deletion mutant of enteropathogenic Escherichia coli by using a positive-selection suicide vector. Infect. Immun. 1991; 59(12):4310—7.
4. Guinet F., Ave P., Jones L., Huerre M., Carniel E. Defective innate cell response and lymph node infiltration specify Yersinia pestis infection. PLoS ONE. 2008; 3(2):e1688
5. Knirel Y.A., Dentovskaya S.V., Bystrova O.V., Kocharova N.A., Senchenkova S.N., Shaikhutdinova R.Z. et al. Relationship of the lipopolysaccharide structure of Yersinia pestis to resistance to antimicrobial factors. Adv. Exp. Med. Biol. 2007; 603:88-96.
6. Kukkonen M., Suomalainen M., Kyllonen P., Lahteenmaki K., Lang H., Virkola R. et al. Lack of O-antigen is essential for plasminogen activation by Yersinia pestis and Salmonella enterica. Mol. Microbiol. 2004; 51(1):215-25.
7. Skurnik M., Peippo A., Ervela E. Characterization of the O-antigen gene clusters of Yersinia pseudotuberculosis and the cryptic O-antigen gene cluster of Yersinia pestis shows that the plague bacillus is most closely related to and has evolved from Y. pseudotuberculosis serotype O:1b. Mol. Microbiol. 2000; 37(2):316-30.
Об авторах:
Дентовская С.В., Платонов М.Е., Комбарова Т.И., Титарева Г.М., Бахтеева И.В., Шайхутдинова Р.З., Иванов С.А., Анисимов А.П. Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии. Оболенск. E-mail: dentovskaya@obolensk.org
S.V. Dentovskaya, M.E.Platonov, T.I.Kombarova, G.M.Titareva,
I.V.Bakhteeva, R.Z.Shaikhutdinova, S.A.Ivanov, A.P.Anisimov
Truncation of Lipopolysaccharide Core Decreases Yersinia pestis Virulence
State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk
The isogenic set of Yersinia pestis strains including wild-type strain 231 and its mutants with deletions of the structural genes, wabD, waaL, waaQ, waaE, and hldE, responsible for core oligosaccharide synthesis was generated using site directed mutagenesis. It was shown that gradual decrease of the core-oligosaccharide length was accompanied by reduction of mutants’ virulence in subcutaneously infected mice and guinea pigs.
Key words: plague agent, LPS, core, virulence.
Authors:
Dentovskaya S.V., Platonov M.E., Kombarova T.I., Titareva G.M., Bakhteeva I.V., Shaikhutdinova R.Z., Ivanov S.A., Anisimov A.P. State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology. Obolensk. E-mail: dentovskaya@obolensk.org
nociynHHa 16.09.08.
