CC BY
14
МИКРОБИОЛОГИЯ УДК 579.841.11.017.6
УГЛЕРОД И АЗОТ КАК РЕСУРСЫ, ОГРАНИЧИВАЮЩИЕ РОСТ МОНО- И СМЕШАННЫХ КУЛЬТУР ДИССОЦИАНТОВ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS AERUGINOSA
П.В. Фурсова, Е.С. Милько, А.П. Левич
(кафедры биофизики, микробиологии, общей экологии; e-mail: fursova@biophys.msu.ru)
В работе продолжено исследование проблемы определения ресурсов, ограничивающих развитие культур диссоциантов бактерий Pseudomonas aeruginosa. В предыщущей публикации (Фурсова и др., 2004а) быши показаны теоретические возможности прогнозирования лимитирующих веществ на основе вариационной модели потребления и роста для экологических сообществ (Левич, 1980; Левич и др., 1997; Levich, 2000). Эксперименты с добавками по выявлению ограничивающих ресурсов в большинстве случаев подтвердили модельные расчеты. Однако новые данные об особенностях метаболизма диссоциантов P. aeruginosa привели к необходимости пересмотра полученных результатов.
Материалы и методы
Моно- и смешанные культуры R-, S- и M-дис-социантов бактерий штамма Pseudomonas aeruginosa К-2 культивировали без пополнения запаса ресурсов на средах с различным начальным содержанием глюкозы, нитратов и фосфатов. Всего бышо проведено около 200 экспериментов.
Бактерии культивировали в пробирках на 50 мл с 10 мл среды на качалке (180 об/мин) при температуре 28° до достижения стационарной стадии роста (табл. 1—3). В качестве посевного материала использовали односуточные культуры диссоциан-
тов псевдомонад, выращенных на плотной среде, содержащей мясо-пептонный бульон и сусло в от-
Таблица 2
Состав сред по углероду, азоту и фосфору в начале опыта для моно- и смешанных культур (мг/мл)
(Фурсова и др., 2004а)
Номер среды Углерод Азот Фосфор
1 0,4 0,035 0,01
2 1,62 0,14 0,04
3 0,4 0,015 0,01
4 1,6 0,06 0,04
5 0,12 0,035 0,01
6 0,48 0,14 0,04
7 0,12 0,015 0,01
8 0,48 0,06 0,04
9 0,78 0,1 0,01
10 3,24 0,4 0,04
11 1,6 0,2 0,01
12 6 0,8 0,04
13 1,2 0,035 0,01
14 4,8 0,14 0,04
Таблица 3
Состав сред по углероду, азоту и фосфору в начале опыта для моно- и смешанных культур на средах с заданными условиями лимитирования (мг/мл)
(Фурсова и др., 2007)
Таблица 1
Состав сред по углероду, азоту и фосфору в начале опыта для монокультур (мг/мл)
(Фурсова и др., 2004а)
Номер среды R-диссоциант S- и M- диссоцианты
углерод азот фосфор углерод азот фосфор
1 0,78 0,4 0,028 0,78 0,4 0,028
2 3,18 0,1 0,028 3,18 0,1 0,028
3 3,18 0,4 0,007 3,18 0,4 0,007
4 0,282 0,1 0,008 0,282 0,1 0,008
5 1,6 0,03 0,008 0,78 0,03 0,008
6 1,6 0,1 0,002 0,78 0,1 0,002
Номер среды Углерод Азот Фосфор
1 0,9 0,05 0,008
2 0,76 0,165 0,02
3 2,4 0,04 0,02
4 1,6 0,04 0,006
5 1,6 0,08 0,006
6 4,8 0,25 0,006
7 0,76 0,04 0,006
ношении 1 : 1 (БСА). Бактерии со скошенного агара переносили петлей в пробирку с физиологическим раствором. Плотность инокулятов каждого из диссоциантов во всех опытах выравнивали по нефелометру или по стандарту мутности до содержания клеток 109 (для смешанных культур — 107) в 1 мл. Посевной материал вносили в количестве 3% объема. Рост бактерий оценивали нефелометри-чески по плотности культуры. Соотношение диссо-циантов в популяции определяли по морфологии колоний рассевом на БСА.
Для измерения pH среды использовали микропотенциометр Checker фирмы "HANNA Instruments". Глюкозу определяли с помощью трифенил-тетразолия хлорида (Химия углеводов, 1967), азот — с сульфофеноловым реактивом (Поляков, 1950), фосфор — методом Пануша (Малый практикум по биохимии, 1979). В более поздних экспериментах использовали экспресс-методы определения веществ: индикаторные полоски для полуколичественного определения глюкозы в крови "Диаглюк" (диапазон определяемых концентраций составляет 0,0—1000 мг% (0,0—55,5 ммоль/л)); фотометрический фосфат-тест фирмы "Merck" (возможно определение концентраций в пределах от 0,010 до 5,00 мг/л); аналитические тест-полоски для определения содержания нитратов фирмы "Merck" (диапазон определяемых концентраций составляет 10—25—50—100—500 мг/л).
Методика проведения экспериментов с добавками по определению лимитирующих ресурсов была усовершенствована. В момент предполагаемого достижения стационарной стадии культуру разделяли на семь пробирок. В шесть из них вносили добавки (глюкоза, нитрат или фосфат, их парные комбинации и все три вещества), одну оставляли без изменений (контроль). Количество добавляемых веществ равнялось их первоначальному содержанию в среде. Культуру оставляли расти еще 12 ч, затем проводили измерение оптической плотности. Если добавление компонента питания в среду приводило к возобновлению деления клеток, то этот ресурс (или их комбинация) считали лимитирующим. В случае если внесение веществ не приводило к росту культуры, считали, что эти факторы не ограничивали развития сообщества. По сравнению с ранее проводившимися опытами (Фурсова и др., 2004а) было увеличено время выдержки культуры на среде с добавками, что позволило исключить влияние лагфазы. Кроме того, внесение комбинаций ресурсов, в отличие от добавки только отдельных компонентов питания, дало возможность зафиксировать совместное ограничение роста бактерий несколькими веществами.
Согласно результатам исследования математической модели потребления и роста (Левич и др., 1994; Фурсова, 2003), пространство первоначальных запасов ресурсов распадается на области, в кото-
рых лимитирующей является одна из возможных комбинаций потребляемых веществ (включая каждое в отдельности). Границы этих областей рассчитываются исходя из экспериментально определяемых потребностей организмов в ресурсах среды (Фурсова и др., 2004б).
Результаты и обсуждение
В цитируемой работе Фурсовой с соавт. (2004а) при анализе результатов экспериментов с добавками предполагалось, что основными ресурсами, которые могут ограничивать рост моно- и смешанных культур диссоциантов бактерий P. aeruginosa являются углерод, азот и фосфор. Было показано, что для опытных сред данного этапа исследования (табл. 1, 2) задающие их векторы ресурсов принадлежат стратам с однофакторным лимитированием. Экспериментально ограничение роста культуры веществом, предсказанным моделью, подтвердилось в 75% анализируемых опытов.
Далее провели серию экспериментов с заданными условиями лимитирования. Семь сред (табл. 3) были выбраны так, чтобы они были ограниченными по разным ресурсам: сбалансированная среда (№ 1), в которой содержание каждого ресурса в среднем пропорционально соответствующим потребностям всех диссоциантов (на этой среде выращивали три монокультуры); среда, которая является лимитированной по углероду для всех возможных комбинаций моно- и смешанных культур (№ 2); среда, лимитированная по азоту для моно- (№ 3) и смешанных (№ 4) культур; среда, лимитированная по фосфору для всех возможных комбинаций моно- и смешанных культур (№ 5); для монокультур и смеси трех диссоциантов (№ 6). Состав среды № 7 является сбалансированным для монокультуры R-диссоцианта (содержание ресурсов пропорционально потребностям этого диссоцианта) и ограниченным по фосфору для смешанных культур и монокультур S- и M-диссоциантов.
Анализ данных, полученных в этой серии экспериментов, дал результаты, свидетельствующие о возможном неоднократном использовании фосфора диссоциантами P. aeruginosa (Фурсова и др., 2007).
Принятие гипотезы об обращении фосфора в процессе роста культуры приводит к необходимости пересмотреть результаты анализа проведенных опытов. Будем считать, что реально ограничивать рост диссоциантов P. aeruginosa могут лишь углерод и азот, а все остальные вещества, необходимые для роста, в том числе и фосфор, содержатся в средах в достатке. В этом случае границы областей лимитирования задают два луча, исходящих из начала координат, и положительные полуоси декартовой плоскости (рис. 1) (Левич и др., 1994). Для монокультур эти лучи совпадают. Вид страти-
Реакция на добавки в монокультурах
(Фурсова, Левич, 2007). Пояснения см.
Таблица 4 (в %)
Рис. 1. Стратификация пространства двух потребляемых ресурсов. В области I лимитируют оба фактора, в II- L1, в III- L2
фикации для смешанной культуры трех диссоци-антов P. aeruginosa представлен на рис. 2 (для парных смесей рисунки выглядят аналогично).
Согласно такому разбиению пространства ресурсов для всех сред, которые были ограничены по углероду или азоту, лимитирующий фактор остался тем же (среды № 1, 2, 4, 5 в табл. 1; все, кроме сред № 11, 12 в табл. 2; среды № 1—4 в табл. 3). Среды № 3, 6 из табл. 1, № 11, 12 из табл. 2, первоначально ограниченные по фосфору, в соответствии с новыми условиями стали лимитированными по углероду. А условия культивирования на средах № 5, 6 и 7 табл. 3 задают лимитирование совместно углеродом и азотом.
Результаты опытов с добавками сведены в табл. 4 и 5. За 100% принята оптическая плотность культуры без добавок (цифра 1 в обозначении вносимых ресурсов означает дополнительное присутствие фосфора). Жирным шрифтом выделены показатели, свидетельствующие о возобновлении роста в результате внесения питательного вещества, предсказанного моделью как лимитирующего. Для анализа оказался пригодным 71 эксперимент (37 с монокультурами и 34 со смешанными). В 59 из них произошло возобновление роста после внесения ресурса, предсказываемого моделью как лимитирующего. Таким образом, в 83% случаев теоретические и опытные данные совпадают.
Необходимо отметить, что введенные на основе предложений работы Фурсовой с соавт. (2004а) уточнения в методику эксперимента (см. раздел "Материалы и методы") позволили значительно увеличить количество опытов, результаты которых
Рис. 2. Стратификация пространства двух ресурсов для смеси R-, S- и M-диссоциантов P. aeruginosa
Номер опыта Лимитирующий ресурс по модели Добавка R S M
1 C C 121 220 110
N 91 102 96
2 N C 101
N 131
3 C C 117
N 119
4 C C 220 140 217
N 97 80 74
5 C C 227
N 73
6 N C 93
N 93
7 C C 94 62 100
N 95 100 68
8 N C 95 100 90
N 143 112 100
9 C C 122 160
N 100 90
10 C C 212 97
N 162 66
11 C C 129 129 143
N 86 100 86
12 C C 131 101 119
N 76 68 81
13 C C 112
N 91
14 С С 246 171 184
N 103 76 92
CN
C1
N1
CN1 195 140 163
15 C С 213 213 222
N 104 100 110
CN 204 178 208
C1 223 209 212
N1 100 120 120
CN1 223 219 194
16 CN С 105
N 105
CN 86
в тексте
Окончание табл. 4
Номер опыта Лимитирующий ресурс по модели Добавка R S M
C1 104
N1 82
CN1 168
17 CN С 135 149 178
N 91 102 104
CN 214 202 216
C1 135 153 158
N1 100 104 92
CN1 207 196 218
Таблица 5
Добавки в смешанных культурах (в %)
(Фурсова, Левич, 2007). Пояснения см. в тексте
Номер опыта Лимитирующий ресурс по модели Добавка RS RM SM RSM
1 C C 82 89 87
N 59 84 98
2 N C 92 96 104 96
N 104 104 116 128
3 C C 142 160 160 150
N 75 100 90 71
4 C C 121
N 79
5 C C 120 120 113
N 100 93 75
6 C C 103 143
N 81 102
7 C C 103 109 129
N 88 81 91
8 С С 220 200 194 254
N 98 94 98 114
CN 202 198 214 237
C1 204 227 276 254
N1 110 114 94 116
CN1 212 227 270 237
Окончание табл. 5
Номер опыта Лимитирующий ресурс по модели Добавка RS RM SM RSM
9 С С 233
N 102
CN 246
C1 200
N1
CN1 173
10 C С 222
N 100
CN 222
C1 256
N1 113
CN1 220
11 CN С 102 99 77 126
N 116 81 87 93
CN 116 157 107 137
C1 111 104 103 86
N1 96 68 91 89
CN1 113 157 125 200
12 CN С 100 108 116 142
N 90 92 110 102
CN 104 125 127 205
C1 90 98 112 142
N1 92 92 102 98
CN1 170 163 163 193
пригодны для анализа с точки зрения вариационной модели.
Учет особенностей метаболизма диссоциантов бактерий P. aeruginosa в модельном подходе, а также усовершенствование методик позволили более точно описать результаты эксперимента. Ранее предсказания модели подтверждались в 75% опытов.
* * *
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты № 05-04-49238 и № 05-06-80062).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Левич А. П . 1980. Структура экологических сообществ. М.
Левич А.П., Алексеев В.Л., Никулин В.А. 1994. Математические аспекты вариационного моделирования в экологии сообществ // Математическое моделирование. 6. № 5. 55—76.
Левич А.П., Максимов В.Н., Булгаков Н.Г. 1997. Теоретическая и экспериментальная экология фитопланктона. Управление структурой и функциями сообществ. М.
Малый практикум по биохимии. 1979 / Под ред. В.В. Юркевича. М.
Поляков Г. 1950. Пособие по гидрохимии для рыбоводов. М.
Фурсова П.В. 2003. Алгоритмы расчетов в вариационной модели экологического сообщества // Математическое моделирование. 15. № 5. 115—128.
Фурсова П.В., Левич А.П. 2007. Количественные закономерности развития сообщества диссоци-антов Pseudomonas aeruginosa // Изв. РАН. Сер. биол. № 1. 1—10.
Фурсова П.В., Милько Е.С., Ильиных И.А., Левич А.П. 2004а. Выявление компонентов питания, ограничивающих рост моно- и смешанных культур диссоциантов бактерий Pseudomonas aerugi-nosa // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. № 1. 19—23.
Фурсова П.В., Милько Е.С., Ильиных И.А., Максимов В.Н., Левич А.П. 2004б. Определение потребностей диссоциантов Pseudomonas aeruginosa в углероде, азоте и фосфоре // Микробиология. 73. № 1. 45—50.
Фурсова П.В., Милько Е.С., Левич А.П. 2008. Культивирование диссоциантов Pseudomonas aeru-ginosa в условиях заданного лимитирования // Микробиология. 77. № 2. 226—231.
Химия углеводов. 1967 / Под ред. Н.К. Кочеткова и др. М.
Lev ich A.P. 2000. Variational modelling theorems and algocoenoses functioning principles // Ecological Modelling. 131. 207—227.
Поступила в редакцию 26.12.06
CARBON AND NITROGEN AS LIMITING RESOURCES OF MONO- AND MIXED PSEUDOMONAS AERUGINOSA DISSOCIANTS CULTURES GROWTH
P.V. Fursova, E.S. Mil'ko, A.P. Levich
New experiments for revealing the limiting resources of growth of mono- and mixed Pseudomonas aeruginosa dissociants cultures were carried out. The results were analyzed on the base of variational model of consumption and growth. This analyze took into account new data about particular feature of dissociants metabolism. In 83% of cases the theoretical calculation were confirmed by experimental results.
