CC BY
30
УДК: 619:616-076:578.832.1
Музика Д.В., к.вет.н., старший науковий ствробггник © Нацюналъний науковий центр «1нститут експерименталъно'И клШчног ветеринарногмедицини», м. Хартв
УДОСКОНАЛЕННЯ В1ТЧИЗНЯНИХ ЗАСОБ1В СПЕЦИФ1ЧН01 Д1АГНОСТИКИ ГРИПУ ПТИЦ1 В РЕАКЦ11 ЗАТРИМКИ ГЕМАГЛЮТИНАЦ11
У статт1 представлет результаты розробки, апробацп та вдосконалення втчизняних тест-систем для серолог1чног д1агностики грипу птищ в реакцп затримки гемаглютинацИ у стъсъкогосподарсъких / диких птах1в. Запропоновано додатково ввести до складу бюпрепарат1в нов/ шактивоват антигени, виготовлет на основ\ втчизняних штам1в тиск нтозами ст вгрусгв грипу тдтитв ГОШ, ГОШ, Ш5Ш, Ш6Ш, ят гзолъоват в/д диких водоплавних / тиск нтозами птах1в.
Ключое1 слова: грип птиц1, реакц1я затримки гемаглютинацИ, антитыа, дию та сглъсъкогосподарсъкг птахи.
Вступ. Важливим елементом у систем! контролю грипу птищ е лабораторна д1агностика захворювання. На сьогодшшнш день основним методом серолопчно! д1агностики грипу е реакщя затримки гемаглютинацп (РЗГА) [4]. Мжнародне етзоотичне бюро рекомендуе використовувати цей метод для виявлення специф1чних антитш у птищ при проведенш серолопчних дослщжень, для визначення р1вня специф1чних антитш та напруженост1 ¿муштету у птищ теля застосування шактивованих вакцин, кр1м того вш е основним методом серолопчно! вдентифшацп гемаглютинуючих в1рус1в [3]. Як вщомо, в1руси грипу мають високу м1нливкть, в наслщок чого, в1руси, яю мають, нав1ть, один тип тиск нтозами вщр1зняються один вщ одного [1]. Тому для коректно! д1агностики захворювання потр1бно використовувати нов1 ешзоотично актуальш штами вирус1в грипу. Починаючи з 2006 року в Референс-лабораторп з грипу та ньюкаслсько! хвороби ННЦ «1ЕКВМ» розроблено та випробувано декшька д1агностичних тест-систем в РЗГА для д1агностики грипу («Ав1ФлуТест ГОШ», «Тест-система для виявлення антитш до в1русу грипу А шдтишв Н1-Н14»).
Нашою головною метою було вдосконалити вже розроблеш в1тчизняш тест-системи для серолопчно! д1агностики грипу в РЗГА шляхом оновлення новими виробничими штамами в1русу грипу птищ.
Матер1али 1 методи. Дослщження проводили у Референс-лаборатори з грипу та ньюкаслсько! хвороби вщдшу вивчення хвороб птищ ННЦ «1нститут експериментально! \ клмчно! ветеринарно! медицини». Для розробки та виготовлення тест-системи «Ав1ФлуТест H5N1» використано виробничий штам А/курка/Сиваш/02/05 H5N1. Адаптащя та клонування ешзоотичного в1русу
© Музика Д.В., 2013
161
тиск нтозами сп грипу птищ для отримання виробничого штаму проводили за методикою, розробленою в ННЦ «ШКВМ». Для розробки «Тест-системи для виявлення антитш до в1русу грипу птищ А шдтишв Н1 - Н14» використали еталонш штами в1русу грипу А: А/свиня/Айова/15/30 (НШ1), А/Сингапур/1/57 (Н2Ш), А/качка/Укра1на/б3 (юш),
А/качка/Чехословаччина/56 (Н4Кб), А/крячок/Швденна Африка/б1 (Н5Ш), А/шдик/Масачу сетс/б5 (НбШ), А/курка/Рос1я/87 (Н7Ш), А/шдик/Онтарю/б7 (Н8Ш), А/шдик/Вкконсин/бб (Н9Ш), А/курка/Шмеччина/Ш9 (Н10Ш), А/качка/ Англ ¿я/5 б (Н1Шб), А/качка/Альберта/б0/70 (н12Ю), А/мартин/Астрахань/1421/79 (Н13Ш), А/мартин/Астрахань/227/84 (н14ш). Дослщження з еталонними штамами в1русу грипу А проводила м.н.с. Майорова К.Ф.
Також у дослщженнях використовували нов1 штами в1русу грипу птищ, що були видшеш вщ диких птах1в в ННЦ «1ЕКВМ» протягом 2010-2011 роюв: А/чирянка/Дж/4-17-11/2010 (Н5Ш), А/крижень/А-Н/23 -15 - 02/11 (Н7№), А/мартин звичайний/ Утлюк/2-2-08/11(Н1б№), А/крижень/Новомихайл1вка/2-23-12/10 (Н15Ш).
Накопичення бюмаси в1русу проводили на СПФ - курячих ембрюнах. Пщб1р оптимальних режим1в культивування, концентрування, шактиваци в1русно! сировини та конструювання тест-системи здшснювали за методами, розробленими колективом автор1в ННЦ «1ЕКВМ» з урахуванням рекомендацш МЕБ I ВООЗ [2, 4, 5]. Контроль якост1 тест-систем проводили згщно з вимогами МЕБта БАО [4, 5].
Результати дослщжень. На початку ешзооти тиск нтозами ст1 грипу птищ Н5Ш в Укратш в АР Крим в 2005-200б роках одшею з проблем була вщсутшсть в1тчизняних д1агностичних тест-систем для швидко! д1агностики цього захворювання. У зв'язку з цим нами у коротю термши була розроблена тест-система для серолопчно! д1агностики грипу птищ пщтипу Н5 в реакцп затримки гемаглютинаци. Головне завдання при цьому - виб1р та отримання виробничого штаму в1русу. Для цього проведено дослщження бюлопчних властивостей ешзоотичного ¿золяту в1русу тиск нтозами ст1 грипу птищ А/курка/Сиваш/02/05 Н5Ш, який було видшено вщ хворих та загиблих кур ей в АР Крим. Встановлено, що вш е тиск нтозами ст для курячих ембрюшв та викликае 1х швидку загибель через 24-48 годин теля шфжування. Недостатшм був титр гемаглютишшв - 1:32 - 1:б4 та низьким вихщ в1русно! сировини. Шляхом селективного клонування на СПФ-курячих ембрюнах, пщбору умов культивування ми отримали виробничий штам в1русу А/курка/Сиваш/02/05 Н5Ш, який забезпечував отримання яюсно! в1русно! сировини з високим титром гемаглютишшв - 1:1024 - 1:2048. За результатами цих наукових дослщжень виробничий штам депоновано в Державному науково-контрольному шститут1 бютехнологи та штам1в мжрооргашзм1в за № 383 та на нього отримано патент Украши на корисну модель № 20245 «Штам в1русу грипу А/курка/Сиваш/02/05 (Н5Ш) для виготовлення бюпрепараив проти пташиного грипу». Шсля отримання виробничого штаму були розроблеш
1б2
основы! технолопчш елементи д1агностично! тест-системи, а саме: niflöip шактиванту та регламенту шактиваци, як1 б забезпечували повну шактиващю шфекцшних властивостей Bipycy та суттево не впливали на його тиск нтозами, регламент визначення повноти шактиваци Bipycy, niflöip стабшзуючого середовища для тривалого збер1гання антигешв, схема отримання специф1чних гшер1мунних сироваток. Все це дозволило в коротю термши створити, випробувати та провести апробащю в1тчизняно! д1агностично! тест-системи для серолопчно! д1агностики тиск нтозами CTi грипу птиц! «Ав1ФлуТест H5N1» (ТУ У24.4-00497087-052:2006). Ця тест-система за результатами державних випробувань була зареестрована в Укра1ш у 2007 рощ (РП 2743-14-0301-07). Протягом 2007 - 2012 роюв «Ав1ФлуТест H5N1» усшшно використовувалася державними лаборатор1ями ветеринарно! медицини та науково-дослщними установами для серолопчного мошторингу грипу птищ, що викликаеться в1русами грипу з пщтипом гемаглютинши Н5.
Протягом цього ж часу в Референс-лабораторп з грипу птищ та ньюкаслсько! хвороби вщдшу вивчення хвороб птищ ННЦ «IEKBM» проводилась активна мошторингова та пошукова робота щодо видшення шших Bipyciß грипу птищ з гемаглютиншам Н5. Це було обумовлено декшькома причинами. По-перше, згщно з рекомендащями МЕБ, у д1агностищ грипу необхщно використовувати антигени, виготовлеш з сучасних актуальних штам1в Bipyciß грипу, що пов'язано з високою м1нливктю та здатшстю до мутаци цього збудника. По-друге, при вибор1 виробничих штам1в бажано перевагу надавати штамам Bipyciß грипу з низькою патогеншстю. У 2010 рощ широкомасштабш мошторингов1 дослщження основного природного резервуару Bipyciß грипу - диких maxie дозволили видшити Bipyc грипу птищ пщтипу H5N2 А/чирянка/Дж/4-17-11/2010. За результатами cepii досладв встановлено, що цей Bipyc е тиск нтозами ст BipycoM грипу, який не викликае захворювання у сприйнятливо! птищ Hi при штравенозному, Hi при штраназальному шфшуванш. Репродукщя Bipycy в оргашзм1 птищ е дуже низькою, видшення збудника в навколишне середовище не встановлено. Це було пщтверджено i негативними результатами дослщжень контактних нешфжованих курчат, як1 були пщсаджеш до курчат шфжованих штраназально. У той же час Bipyc при шфжуванш птищ викликав ¿мунну вщповщь у курчат. При ¿мушзацп курчат шактивованим антигеном цього Bipycy в cyMimi з масляним ад'ювантом через 7-14 д1б теля одноразового введения р1вень специф1чних антитш становив 1:32 - 1:64. Bei щ даш дозволили нам вважати штам Bipycy грипу А/чирянка/Дж/4-17-11/10 H5N2 перспективним штамом-кандидатом до виробничих штам1в, як основний, або додатковий виробничий штам для виробництва д1агностичних тест-систем. Наявшсть у цього Bipycy шшого пщтипу нейрамшщази е додатковим аргументом для можливого його подальшого використання у д1агностичних цшях, тому що, за рекомендащями МЕБ, у pa3i виявлення антитш до Bipycy грипу в РЗГА обов'язково необхщно провести додатков1 дослщження з використанням антигену того ж самого пщтипу гемаглютинши, але з шшим
163
тдтипом нейрамшщази для виключення можливих перехрестних реакцп. У даному випадку, в зв'язку з тим, що основним виробничим штамом Bipycy е H5N1 необхщно мати актуальний штам Bipycy грипу пщтипу Н5, але з шшим пщтипом нейрамшщази. У колекци штам1в ННЦ «IEKBM» збер1гаеться шший виробничий штам Bipycy тиск нтозами CTi грипу птищ H5N3 А/крячок/Швденна Африка/61, який використовуеться при виробництв1 тест-системи для виявлення антитш до Bipycy грипу А шдтишв Н1-Н14. Головним недолгом цього Bipycy е його антигенш вщмшност1 вщ сучасних штам1в Bipycy Н5, що циркулюють в тепершнш час. Штам, отриманий вщ диких птах1в в 2010 рощ е бшьш епАзоотично актуальним. Описан! вище дослщження дозволили нам внести певш змши у регламент виготовлення тест-систем, що пщвищило ix специф1чшсть. На штам Bipycy тиск нтозами CTi грипу птищ А/чирянка/Дж/4-17-11/10 H5N2 отримано ршення про видачу декларацшного патенту (№ заявки u 201210776).
Також в арсенал! засоб1в специф1чно! д1агностики грипу птищ, що розроблеш у вщдЫ вивчення хвороб птищ ННЦ «IEKBM», е «Тест-системи для виявлення антитш до Bipycy грипу птищ А пщтипу Н1-Н14». Для розробки цього д1агностикуму було використано еталонш штами Bipycy грипу А пщтишв з Н1 до Н14, яю були отримаш Референс-лаборатор1ею з грипу птищ та ньюкаслсько! хвороби вщдшу вивчення хвороб птищ ННЦ «IEKBM» з 1нституту в1русологи ти. Д.1. 1вановського (Росшська Федеращя). Необхщно зазначити, що на сьогодшшнш день за антигенними властивостями двох поверхневих гл1копроте!шв щентифковано 16 пщтишв за гемаглютиншам та 9 за нейрамшщазою, а за деякими даними видшяють один новий пщтип Bipycy грипу за тиск нтозами - Н17 та нейрамшщазою - N10. Цей Bipyc було ¿зольовано вщ нових хазя!в - вщ кажашв [6]. Ураховуючи тиск нтозами факти, ми запропонували вдосконалити цю тест-систему за рахунок оновлення шактивованих антигешв пщтипу Bipycy Н7 та шляхом додавання нових антигешв з пщтипами гемаглютишшв Н15, Н16.
Необхщшсть оновлення виробничого штаму Bipycy грипу Н7 полягае в тому, що еталонний штам Bipycy А/курка/Рошя/87 (H7N7) був видшений в 1987 рощ та за антигенними властивостями вщр1зняеться вщ тих Bipyciß, що циркулюють тепер, та е також тиск нтозами ст. Ураховуючи особливе значения цього Bipycy для птах1вництва, ми запропонували додатково новий виробничий штам Bipycy грипу цього пщтипу - А/крижень/А-Н/23-15-02/11 (H7N3). Це новий, оригшальний в антигенному вщношенш
тиск нтозами ст Bipyc, перший Bipyc грипу птиц! А з тиск нтозами Н7, що було ¿зольовано вщ диких птах1в в Укра1ш у 2011 рощ з проб фeкaлiй клiнiчнo здорових крижшв (Anas platyrhynchos). Bipyc добре культивуеться в курячих ембрюнах 9-11-добового BiKy при iнфiкyвaннi в алантоюну порожнину з накопиченням гeмaглютинiнiв у Trnpi 1:64 - 1:256. Бioлoгiчнa актившсть 4,5 lg Е1Д50/0,2 мл та 4,66 lg ЕЛД50/0,2мл. Bipyc може викликати загибель вщ 25 до 100% курячих ембрюшв через 48-96 годин теля шф1кування.
164
Що стосуеться Bipyciß грипу пщтишв Н15 та Н16, то вони не входили до складу д1агностично! тест-системи до цього часу, у зв'язку з вщсутшстю втчизняних ¿золят1в. Хоча в1руси цих пщтишв не мають великого значения для птах1вництва, тому що на сьогодшшнш день не вщомо жодного випадку природного шф1кування та захворювання свшських птах1в, але для серолопчно! д1агностики, особливо серолопчно! щентифшаци нових ¿золят1в, дуже важливим е наявшсть специф1чних сироваток та антигешв до ycix ¿снуючих Bipyciß грипу. Протягом широкомасштабних мошторингових дослщжень диких птах1в в 2010 -2011 роках нами було ¿зольовано nepmi украшсью ¿золяти Bipycy грипу птищ пщтишв Н15 та Н16. Пкля цього були ретельно вивчеш бюлопчш властивосп цих Bipyciß, що дозволило нам запропонувати !х до включения до складу д1агностично! тест-системи та використовувати щ Bipycn для виробництва нових шактивованих антигешв.
Штам Bipycy грипу А/мартин звичайний/Утлюк/2-2-08/11 (H16N3) за результатами секвенування дуже близький за генетичними властивостями до Bipycy грипу птищ А/мартин звичайний/Монгол1я/1756/2006, але по cyTi являе собою новий, оригшальний в антигенному вщношенш Bipyc. KpiM того, це перший Bipyc цього пщтипу, який було ¿зольовано в Укра1ш та Схщнш Сврош у cepnHi 2011 рощ з клоакального змиву дорослого клмчно здорового мартина звичайного (Larus ridibundus). Bipyc культивуеться в курячих ембрюнах 9-11-добового BiKy при шф1куванш в алантоюну порожнину з накопиченням гемаглютишшв в титр! 1:128 -1: 512. При титруванш Bipycy на курячих ембрюнах шфекцшна актившсть його становить 6 lg Е1Д50/0,2мл, а летальний титр 6,33 lg ЕЛД50/0,2мл. Bipyc може викликати загибель до 25% курячих ембрюшв через 48-96 годин теля шфшування. Bipyc волод1е добрими антигенними властивостями. Так, ¿мушзащя курей 217 добового вшу шактивованим BipycoM грипу А/мартин звичайний/Утлюк/2-2-08/11 (H16N3) в cyMimi з ад'ювантом в доз1 1,0 см3 викликае утворення специф1чних антитш до Bipycy грипу Н16 через 30 д1б теля ¿мутзаци в титрах 1: 128 - 1:1024 в РЗГА. За результатами РЗГА та 1ФА nepmi антитша виявляються у 10-20% курей через 7 д1б.
BipycH грипу птищ пщтипу Н15 е достатньо рщюсними в1русами грипу, що були видшеш вщ диких водоплавних та тиск нтозами птах1в. Вперше щ в1руси були ¿зольоваш в перюд 1979-1983 роюв в Австрали вщ тиск нтозами птах1в р1зних вид1в ряду Сивкопод1бш. На сьогодшшнш день, за даними GeneBank ¿снуе тшьки 7 вщомих Bipyciß грипу цього пщтипу з наступними антигенними формулами H15N2, H15N4, H15N6, H15N8, H15N9. Останнш Bipyc грипу цього пщтипу A/teal/Chany/7119/2008 (H15N4) було ¿зольовано в Росшськш Федераци в 2008 рощ вщ чирянки мало! в Захщному Cn6ipy [7]. Штам А/крижень/Новомихайл1вка/2-23-12/10 е першим в1тчизняним BipycoM грипу птищ А з антигенною формулою H15N7. Необхщно зазначити, що це перший Bipyc цього пщтипу з такою антигенною формулою H15N7, яю до сьогодшшнього дня не були ¿зольоваш у CBiTi вщ диких птах1в, ¿зольований у 2010 рощ з проб фекалш дорослих клЫчно здорових крижшв (Anas
165
platyrhynchos). За результатами секвенування цей Bipyc е спорщненим з Евразшською генетичною л ¿шею BipyciB грипу птищ пщтипу Н15 та е спорщненим з новим росшським BipycoM 2008 року. Bipyc культивуеться в курячих ембрюнах 9-11-добового в1ку при шфшування в алантоюну порожнину з накопиченням гемаглютишшв в титр1 1:512 протягом 4-5д1б. При титруванш Bipycy иа курячих ембрюнах встановлено, що шфекцшний титр становить 6,5 lg Е1Д50/0,2 мл. Bipyc не викликае загибел1 курячих ембрюшв протягом 120 годин теля шфшування. Цей Bipyc волод1е добрими антигенними властивостями. Так, ¿мушзащя курей 217 добового вжу шактивованим BipycoM грипу А/крижень/Новомихайл1вка/2-23-12/10 (H15N7) в cyMimi з ад'ювантом у доз1 1,0 см3 викликае утворення специф1чних антитш до Bipycy грипу Н15 через 30 д1б теля ¿мушзацп в титрах 1: 64 - 1: 1024 в РЗГА. За результатами РЗГА та 1ФА nepmi антитша виявляються у 10-60% курей через 7 д1б.
Висновки:
1. Протягом 2007-2012 рок1в у вщдш вивчення хвороб птиц1 ННЦ «1ЕКВМ» розроблен1, апробован1 на практищ в1тчизнян1 тест-системи для виявлення антитш до Bipycy грипу птищ за допомогою РЗГА. Тест-системи «Ав1ФлуТест H5N1» та «Тетс-система для виявлення антитш до Bipycy грипу А пщтитв Н1-Н14 в РЗГА» пройшли державт випробування, зареестрован1 на TepHTopii Украши та використовуються у практиц1 лабораторш ветеринарно! медицини.
2. За результатами широкомасштабного ешзоотолопчного мон1торингу диких птах1в в 2010-2011 роках ¿зольовано Bipycn грипу птиц1 п1дтип1в H5N2, H7N3, H15N7, H16N3. Дослщження патогенност1, бюлопчних та молекулярно-генетичних властивостей показали перспектившсть ix використання як виробничих BipyciB для виготовлення дАагностичних тест-систем.
3. Для вдосконалення специф1чно1 серолопчно! д1агностики грипу в РЗГА запропоновано додатково ввести до складу зазначених тест-систем HOBi ¿нактивован1 в1руси пщтитв H5N2, H7N3, H15N7, H16N3.
Л1тература
1. Молекулярно-биологическая характеристика изолятов тиск н птичьего гриппа, выделенных на территории Российской Федерации и Автономной республике Крым [Текст] / А.В. Андриясов, [и ти.] // Материалы II Междунар. Вет. конгресса по птицеводству. - М., 2006. - С. 59-65.
2. WHO 2005. The Writing Committee of the World Health Organization. Avian influenza A (H5N1) infection in humans [Text] // N. Engl. J. Med. - 2005. -Vol. 353. - P. 1374-1385.
3. Lee C.W. Avian influenza virus: prospects for prevention and control by vaccination [Text] / C. W. Lee, D.L. Suarez // Anim. Health Res. Rev. - 2005. - Vol. 6. - P. 1-15.
4. OIE Manual for Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals [Electronic resourse]. - Access mode: http://www.oie.int.- Title of the screen.
5. Food and agriculture organization of the United Nations [Electronic resourse]. - Access mode: http:// www. Fao. Org.- Title of the screen.
166
6. A distinct lineage of influenza A virus from bats [Text] / S. Tong [at al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2012/ - Vol.109, № 11. - P. 4269-4274
7. Influenza A (H15N4) virus isolation in Western Siberia, Russia [Text] / M. V. Sivay [at al.] // J. Virol. - 2013. - Vol.87, N 6. - P. 3578-3582
Summary
The paper presents the results of the development, validation and improvement of the domestic system test for serological diagnosis of avian influenza in hemagglutination inhibition test at poultry and wild birds. It was prompted additionaly to enter new inactivated antigens produced and based on domestic strains of low pathogenic influenza virus subtypes H5N2, H7N3, H15N7, H16N3, which are isolated from wild waterfowl and shorebirds.
Key words: avian influenza, hemagglutination inhibition test, antibodies, wild birds and poultry.
Рецензент - д.б.н., професор Маслянко Р.П.
167
