CC BY
32
7.006 ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА. Сер. 3. Вып. 2
ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ
УДК 581.1.
Т. Е. Биюва, Е. И. Шарова
УЧАСТИЕ ПЕРОКСИДАЗНЫХ РЕАКЦИЙ В СНИЖЕНИИ РАСТЯЖИМОСТИ КЛЕТОЧНЫХ СТЕНОК ПРИ СТАРЕНИИ КОЛЕОПТИЛЕЙ КУКУРУЗЫ*
При старении растительных тканей, которое ускоряется у изолированных органов, снижается скорость роста растяжением. Растяжение осевых органов находится под контролем гормона ауксина. Стареющие ткани отвечают слабой ростовой реакцией на обработку ауксином [5], что может быть связано либо с нарушением механизмов восприятия гормона клетками, либо с повреждением механизмов, реализующих клеточный ответ на воспринятый гормон.
Известно, что ауксин вызывает подкисление матрикса клеточных стенок. Растяжимость клеточных стенок увеличивается и, вследствие этого, возрастает скорость роста [2, 4]. Действие ауксина на рост можно имитировать, поместив кусочки молодых осевых органов растения в кислый буферный раствор. Это явление было названо «кислым ростом» [11].
Ауксинзависимое подкисление матрикса клеточных стенок наблюдается и у стареющих тканей, значит при старении ткани не утрачивают способность воспринимать ауксин. Однако такие ткани не дают реакции «кислого роста» [5]. Следовательно, снижение скорости роста при старении растительной ткани связано с изменением способности клеточных стенок к растяжению.
Изменение растяжимости клеточных стенок можно исследовать в опытах с использованием клеточных стенок замороженных/оттаявших отрезков осевых органов [3, 12], которые помещают в установку, позволяющую регистрировать растяжимость, и растягивают под постоянной нагрузкой. Вначале отрезок растягивается очень быстро, однако уже через 10-15 мин скорость растяжения падает до низких значений. Такое медленное растяжение называется «creep» (крип), что означает вязкоэластическую ползучесть клеточных стенок. Нагрузка в этом случае аналогична тургорному давлению, постоянно растягивающему клеточную стенку. У замороженной/оттаявшей ткани в основном сохраняются ферменты апо-пласта, поэтому, действуя различными реагентами, можно оценивать их влияние непосредственно на механические свойства клеточной стенки. Данная модельная система позволяет имитировать in vitro процессы, влияющие на растяжимость и протекающие в жидкой части апопласта in vivo. Так, было показано, что в кислом буфере (рН 5,0) растяжимость (крип) клеточных стенок многократно повышалась [13].
Согласно литературным данным, во время роста растяжением в натянутой тургор-ным давлением клеточной стенке постоянно происходят эластические и пластические деформации [9, 10]. Эластические деформации приводят к обратимым изменениям размеров клеточных стенок, а пластические - к необратимым. Понятия «эластичность» и «пластич-
* Работа вы ,'лнена при поддержке РФФИ (грант № 05-04-49619)
© Т. Е. Билова, Е. И. Шарова. 2006
ность» в физиологии клеточной стенки обычно используются для обозначения способности клеточных стенок к обратимым и необратимым деформациям, соответственно [3]. Эластическая деформация аналогична деформации идеальной пружины, она может произойти, например, вследствие разрыва поперечных связей между полимерами клеточной стенки под действием тургора. Пластическая деформация может возникнуть в результате действия двух принципиально разных механизмов [3]: 1) разрыва полимеров клеточной стенки под действием гидролитических ферментов, 2) фиксации эластической деформации за счет образования поперечных связей между полимерами стенки.
Благодаря обратимым и необратимым деформациям, в каждый момет во время роста растяжением изменяются размеры клеточной стенки, другими словами, клеточная стенка проявляет реологические свойства, она «течет». По мнению Б. Cosgrove [7], это свойство сближает стенки растущих растительных клеток с вязкоэластическими жидкостями.
В настоящее время среди исследователей нет единого мнения по поводу того, какая именно часть растяжимости клеточной стенки (эластическая или пластическая) вносит основной вклад в рост растяжением. В работе [9] было показано, что процессы, лежащие в основе пластической растяжимости и одновременно способствующие ужесточению клеточной стенки, активны даже при полном прекращении роста растяжением. Поскольку не известно, как изменяются эластические и пластические свойства клеточных стенок при старении, можно предположить, что подобный процесс происходит и в стареющих нерасгущих тканях растений.
В литературе сейчас весьма горячо обсуждаются возможные механизмы, с помощью которых клетки способны изменять растяжимость своих клеточных стенок [3, 7, 9]. Согласно одной из гипотез, клеточную стенку ужесточают окислительно-восстановительные реакции, катализируемые пероксидазами апопласта. Пероксидазы апопласта, используя в качестве субстрата пероксид водорода, катализируют образование поперечных связей между фенольными остатками, входящими в состав гемицеллюлоз. Гемицеллюлозы первичных клеточных стенок второго типа, к которым относятся и клеточные стенки проростков кукурузы - объекта нашей работы - представляют собой разветвленные полисахариды, оплетающие микрофибриллы целлюлозы. Образование поперечных связей между ними снижает возможность скольжения микрофибрилл целлюлозы друг относительно друга, что приводит к снижению растяжимости (ужесточению) клеточных стенок [9, 12].
Таким образом, можно предположить, что контроль активности пероксидаз и содержания пероксида водорода в апопласте является одним из способов регуляции роста на клеточном уровне. Действие ЬЬОз на крип клеточных стенок было уже опробовано на замороженных/оттаявших колеоптилях. Пероксид водорода, внесенный в концентрации 2 ммоль/л, резко снижал растяжимость даже в кислом буфере (рН 5,0) [13]. Также было показано, что Н2СЬв подобной концентрации тормозил ауксинактивируемый рост [9].
Однако все еще слабо изученным остается вопрос о том, как изменяются при старении механические свойства клеточных стенок, под которыми мы, прежде всего, понимаем их эластичность, пластичность и способность к кислому крипу. Если действительно, изменяя содержание пероксида водорода, клетки способны контролировать растяжимость клеточных стенок и, как следствие, свой рост, то, как изменяются механические свойства их стенок при снижении или увеличении его количества в апопласте? И, наконец, в литературе нет данных об изменении содержания Н1О2 в апопласте растительных тканей при старении. Данные по изменению активности растворимых и ионносвязанных с полимерами клеточных стенок пероксидаз в апопласте стареющих тканей также немногочисленны. Недостаточная изученность растворимой части апопласта связана в основном с трудностями ее извлечения.
Цель нашей работы - изучить изменение механических свойств клеточных стенок при старении растительных тканей. Исходя из предположения о том, что определяющее
значение в этом процессе имеет пероксид водорода, было проведено исследование его действия в различных концентрациях на рост, а также эластичность, пластичность и крип клеточных стенок у свежесрезанных и стареющих колеоптилей. Выделив апопластный раствор, определили в нем активность различных пероксидаз апопласта и содержание Н2СЬ.
Объект и методы исследования. В работе использовали отрезки колеоптилей кукурузы (сорт НАРТ-150). Проростки кукурузы выращивали при 27 °С в темном термостате в течение 5 суток. В работе использовали 10-миллиметровые отрезки, свежесрезанные из верхней части (на 4 мм ниже верхушки) колеоптилей. Лист из полости колеоптилей удаляли. Эти отрезки сравнивали со стареющими отрезками, которые после нарезания из 4-суточных проростков в течение 20-24 ч находились в темном термостате (27 °С), в вертикальном положении во влажной камере, залитые на 1/3 высоты буферной средой рН 6,0 (1 ммоль/л КН2Р04 с 0,5%-ной сахарозой).
При изучении влияния экзогенной перекиси водорода и каталазы на скорость роста изолированных колеоптилей опытные и контрольные отрезки группами по 10 штук помещали в буферную инкубационную сред)- рН 6,0 (КН2Р04 1 ммоль/л, цитрат 1 ммоль/л). Предварительно у отрезков при помощи пинцета удаляли кутинизированный эпидермис. Удаление этого слоя способствует лучшему проникновению раствора к клеткам колеоптилей. После 4-часового периода прединкубации отрезки помещали на 3 ч в инкубационный раствор (рН 5,0) с каталазой (100 U/мл) или с Н202 с различными концентрациями. Измерение длины регистрировали при увеличении в 17 раз, используя микрофот 5П01.
Эластическую растянутость клеточных стенок опытных и контрольных колеоптилей определяли после замораживали при -30 °С и последующего оттаивания отрезков. Отрезки теряли тургор и сокращались в длине. За эластичность клеточных стенок исследуемых колеоптилей принимали сокращение длины колеоптилей после оттаивания, выраженное в процентах от их размеров перед замораживанием.
Исследование вязкоэластической растяжимости клеточных стенок изолированных опытных и контрольных колеоптилей проводилось по методу «creep» [3]. Анализируемый отрезок колеоптиля. лишенный кутинизированного эпидермиса, замораживали при -30 "С. После размораживания отрезок промывали в буферном растворе рН 6,0 (CITCOONa 10 ммоль/л) и закрепляли в установке, позволяющей регистрировать крип. Отрезок растягивали под постоянной нагрузкой 20 г. Растяжение происходило с затухающей скоростью. Через 14-15 мин от начала растяжения (от момента приложения нагрузки), когда устанавливалась постоянная скорость растяжения (0,5-1 мкм/мин), среду, омывающую растягивающийся отрезок, заменяли более кислым раствором (рН 5,0). Влияние подкисления среды на крип клеточных стенок регистрировали в течение следующих 15 мин. В отдельных экспериментах исходный раствор с рН 6,0 заменяли средой (рН 5,0), содержащей 1 ммоль/л Н202 или каталазу (100 U/мл). Таким образом, исследовали влияние пероксида водорода и каталазы на способность клеточных стенок стареющих и свежесрезанных колеоптилей растягиваться в кислом буфере.
Для выделения апопластного раствора нарезали по ¡80-200 10-миллиметровых отрезков колеоптилей. Апопластный раствор получали методом вакуумной инфильтрации с последующим низкоскоростным центрифугированием [3]. При определении Н202 и активности растворимых пероксидаз апопласта отрезки инфильтровали в буферном растворе 10 ммоль/л CHjCOONa (рН 6,0). Тот же буфер, но с содержанием 0,3 моль/л NaCl использовали для извлечения пероксидаз, ионносвязанных с полимерами клеточных стенок. Инфильтрация в течение 5 мин проводилась при помощи водоструйного насоса. Отжатый (при центрифугировании 2000 g, 10 мин"! из колеоптилей апопластный раствор тестировали на цитоплазматическое загрязнение, определяя в нем активность глюкозо-6-фосфатде-гидрогеназы по стандартному методу [6], в реакционной смеси следующего состава: 2,0 мл глицинг-лицинового буфера рН 7,5 (80 ммоль/л) + 0,2 мл уксуснокислого магния (100 ммоль/л) + 0,1 мл НАДФ (15 ммоль/л) + 0,4 мл глюкозо-6-фосфата (40 ммоль/л) + 0,1 мл апопластного раствора. Прирост экс-тинкции в результате образования НАДФН - продукта реакции, измеряли при к = 340 нм. Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в апопласте относили к 1 г сырой массы колеоптилей и выражали в процентах от активности фермента в гомогенате.
Активность растворимых и ионносвязанных пероксидаз апопласта определяли по стандартному методу в реакции с гваяколом [1], в реакционной смеси: 0,1 мл апопластного раствора + 2,0 мл ацетатного буфера рН 5,0 (150 ммоль/л) + 0,6 мл гваякола (100 ммоль/л) + 0,3 мл Н202 (40 ммоль/л). Псроксидазную активность оценивали по скорости образования продукта реакции тетрагваякола (ко-
эффициент экстинкции е470 нм= 0,0266 (мкмоль/л)"' • см"', на линейном участке реакционной кривой (2-я мин реакции), относили к 1 г сырой массы колеоптилей и выражали в процентах от активности фермента в гомогенате.
Для определения содержания пероксида водорода в апопластном растворе использовали ферментативный метод определения Н202 в гомогенате растительных тканей [14] с некоторыми модификациями. В данном методе содержание Н202 оценивается по развитию реакции окисления фенолов пероксидазой хрена. Развитию реакции мешают присутствующие в апопластном растворе собственные пероксидазы и восстановители, такие как аскорбиновая кислота и фенолы. Для инактивации пе-роксидаз, апопластный раствор из тканей колеоптилей во время центрифугирования отжимали сразу в раствор хлорной кислоты. Для этого перед центрифугированием на дно центрифужной пробирки вносили каплю раствора хлорной кислоты (0,4 моль/л). Объем хлорной кислоты рассчитывали из предполагаемого объема отжимаемого раствора, так чтобы при смешивании сохранялось соотношение 1:1. Во время центрифугирования хлорная кислота не контактировала с тканями колеоптилей. После центрифугирования раствор, собранный со дна центрифужных пробирок, нейтрализовали КОН (4 н). Для очищения от аскорбиновой кислоты и фенолов, раствор объемом 0,4 мл пропускали через анионооб-менную колонку, заполненную смолой Эошех 1><1 (объем 2 мл, диаметр 5 мм). Содержание пероксида водорода определяли в каждом из первых 5 мл элюата по развитию ферментативной реакции в реакционной смеси следующего состава: 1 мл элюата + 0,4 мл раствора диметиламинобензойной кислоты (ЭМАВ) (12,5 ммоль/л) в калий-фосфатном буфере рН 6,5 (375 ммоль/л) + 0,08 мл З-мегил-2-бен-зотиазолин гидразона (МВТН) (10 ммоль/л) + 0,02 мл (14 и/мл) пероксидазы хрена. Прирост поглощения измеряли при >.- 590 нм. Специфичность реакции подтверждали, параллельно проводя реакцию с пробой, предварительно обработанной каталазой (47 и/мл). Каталаза разрушает Н?02, что приводит к снижению скорости развития реакции в такой пробе. Содержание пероксида водорода оценивали по разнице между значениями экстинкции в пробе без добавления каталазы и обработанной каталазой.
Результаты исследований и их обсуждение. Для того чтобы ускорить преждевременное старение, мы изолировали отрезки колеоптилей и для поддержания жизнеспособности помещали их, в вертикальном положении, в питательный раствор с сахарозой на 24 ч. Таким образом, через сутки мы получали стареющие сегменты (отрезки) колеоптилей, скорость роста которых почти в 3,5 раза снижалась по сравнению со скоростью роста сегментов свежевырезанных из колеоптилей кукурузы (рис. 1).
0.45
2 5
га
<о
о
о. 0.15 --
X
о. С
0.05 --
-0,05
0 Контроль 0,1 1 10
(каталаза, 100 и/мл)
Концентрация пероксида водорода в инкубационной среде, ммоль/л Рис. I. Влияние пероксида водорода на рост свежесрезанных и стареющих колеоптилей.
в Свежесрезанные колеоптили
...... Стареющие
колеоптили
По мнению многих исследователей, причины торможения роста растяжением при старении и дифференцировке растительных тканей, прежде всего, связаны с изменением механических свойств клеточных стенок [3, 7, 9]. И в этом нетрудно убедиться: после замораживания и последующего размораживания кусочек растительной ткани теряет тургор и сокращается в длину. Размер сокращения кусочка ткани зависит от того, насколько сильно были вытянуты клеточные стенки тургорным давлением, т. е. от эластической (обратимой) натянутости клеточных стенок. На рис. 2 видно, что при старении также значительно снижается эластичность клеточных стенок сегментов колеоптилей.
14
12
10
то с О
6 --
4 --
2 --
-f-
■к
Свежесрезанные колеоптили
h.„ Стареющие колеоптили
........
4-
-4—
0,1
1
0 Контроль (каталаза, 100 U/мл)
Концентрация пероксида водорода, ммоль/л
10
Рис. 2. Влияние пероксида водорода на эластическую растянутость клеточных стенок свежесрезанных и стареющих колеоптилей.
Согласно литературным данным, во время растяжения стенок растущих растительных клеток одновременно происходят процессы, размягчающие и ужесточающие клеточные стенки [9, 12]. Скорость процессов расслабления и ужесточения клеточных стенок одинакова во время роста растяжением, что подтверждается поддержанием эластической растянутости клеточной стенки на постоянном уровне (14-16% у молодых тканей) во время роста. Тот факт, что при старении колеоптилей снижается эластичность клеточных стенок можно объяснить с позиций Р. Schopfer и его сотрудников, которые в работе [9] высказывают предположение, что снижение эластичности клеточных стенок достигается за счет активизации процессов, приводящих к ужесточению клеточных стенок. Ужесточение первичной клеточной стенки может достигаться в окислительно-восстановительных реакциях катализируемых пероксидазами апопласта. В ходе таких реакций образуются поперечные связи между фенольными остатками главных несущих нагрузку полимеров клеточных схе-нок. Образовавшиеся поперечные связи будут препятствовать скольжению полимеров клеточной стенки друг относительно друга при росте растяжением и, следовательно, будут тем самым снижать эластическую растянутость ткани за счет увеличения пластической (необра-
тимой) длины растущей ткани. Поскольку такие окислительные реакции катализируются пероксидазами, их протекание зависит от наличия Н202 в апопласте.
Можно предположить, что снижение содержания пероксида водорода в апопласте уменьшит интенсивность протекания процессов, катализируемых пероксидазой и ужесточающих клеточную стенку, тех процессов, которые способствуют закреплению роста.
Фермент каталаза разрушает Н202. Проинкубировав отрезки стареющих и свежесрезанных колеоптилей в растворе с каталазой, можно снизить концентрацию пероксида водорода в апопласте. Каталаза - белок с большой молекулярной массой, и, скорее всего, из среды инкубации такой белок не сможет проникнуть через узкие поры клеточной стенки в апопласт отрезков. Поэтому в данной модельной системе использование каталазы не подразумевает полное удаление пероксида водорода из апопласта исследуемых объектов, а лишь снижение его содержания в матриксе клеточных стенок. Из рис. 1 видно, что инкубация отрезков в среде с каталазой (100 U/мл) снизила скорость роста в обоих исследуемых вариантах сегментов колеоптилей примерно на 50%, а на эластической растяжимости применение каталазы практически не отразилось (см. рис. 2).
Можно предположить, что внесение в инкубационную среду дополнительного количества пероксида водорода вызовет эффект «старения» свежесрезанных сегментов колеоптилей. Действительно, при инкубации свежесрезанных отрезков в растворах с содержанием Н202 0,1-10 ммоль/л их рост снижался до уровня регистрируемого у стареющих колеоптилей (см. рис. 1). Наибольшее торможение роста наблюдалось при использовании Н202 в концентрации 1 ммоль/л. При увеличении содержания пероксида водорода до 10 ммоль/л рост отрезков не только не прекратился, как можно было предположить, а наоборот, несколько увеличился по сравнению с применением Н202 (1 ммоль/л). Эластическая растянутость свежесрезанных отрезков после таких обработок также снижалась, но уровня стареющих не достигала, даже после обработок пероксидом водорода (10 ммоль/л) (см. рис. 2.). В работе Е. Sharova [13] также было обнаружено некоторое увеличение растяжимости клеточных стенок колеоптилей кукурузы при длительной инкубации их в среде с высоким содержанием Н202 (Ю ммоль/л и выше). Объяснить данный эффект можно с позиций гипотезы, предложенной S. Fry [8], согласно которой пероксид водорода в клеточной стенке может вызывать окислительные разрывы гемицеллюлоз и тем самым способствовать растяжимости и росту, если он принимает участие в реакции Фентона. Продуктом реакции Фен-тона, которая протекает в присутствии Н202, аскорбата и ионов меди или железа является гидроксил-радикал - один из самых сильных окислителей в живых клетках.
Рост стареющих сегментов, как и эластическая растянутость их клеточных стенок, снижались в присутствии пероксида водорода в инкубационной среде (см. рис. 1, 2), 10 ммоль/л Н202 вызывала даже сокращение отрезков.
Полученные результаты, таким образом, дают основание полагать, что действительно в процессе старения торможению роста способствуют реакции, происходящие с участием пероксида водорода. Для того чтобы оценить прямое действие Н202 на растяжимость клеточной стенки, мы использовали метод крипа (рис. 3). Замороженные/оттаявшие отрезки растягивали под постоянной нагрузкой. При этом скорость их растяжения вначале была очень высокой, но через несколько минут падала до низких значений - эту необратимую растяжимость, называемую крипом, мы анализировали, поскольку многие исследователи считают, что она отражает физиологическую растяжимость клеточных стенок в процессе роста [3, 7]. Скорость растяжения изолированных клеточных стенок в буферной среде с рН 6,0 не изменялась при старении. Однако существенные различия в изменении растяжимости между клеточными стенками исследуемых колеоптилей возникали при их подкисле-нии до рН 5,0. Скорость растяжения клеточных стенок свежесрезанных колеоптилей многократно увеличивалась, а при старении отрезков ускорение крипа при подкислении было выражено значительно слабее.
Свежесрезанные колеоптили
Стареющие колеоптили
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Время, мин
Рис. 3. «Creep» клеточных стенок свежесрезанных н стареющих колеоптилей.
В Каталаза
□ Контроль
■ Н202
L
Свежесрезанные колеоптили
Стареющие колеоптили
Рис 4. Влияние каталазы (100 и/мл) и пероксида водорода (1 ммоль/л) на растяжимость клеточных стенок свежесрезанных и стареющих колеоптилей в кислой среде.
Повышение скорости кислого крипа клеточных стенок, так же как и усиление скорости роста в кислой среде, согласно многим литературным данным, связано с активацией экспанси-нов - белков клеточной стенки, усиливающих растяжение клеточной стенки [7, 15]. Экспан-сины не обладают гидролитической активностью. Расслабляющее действие этих белков на клеточную стенку связано с тем, что они разрушают водородные связи только между гемицеллю-лозой (основным полимером, несущим нагрузку при растяжении) и микрофибриллами целлюлозы, тем самым, позволяя клеточной стенке тянуться, увеличивая ее пластичность [15]. При старении скорость крипа значительно снижается, вероятно, вследствие изменения способности клеточных стенок отвечать на подкисление. Одной из причин снижения растяжимости может быть активация процессов, образующих поперечные связи между гемицеллюлозами и ужесточающих клеточную стенку. С помощью каталазы, которую вносят вместе с кислым буфером, возможно несколько «обратить» старение и увеличить способность к растяжению клеточных стенок. Добавление на фоне подкисления 1 ммоль/л Н202 резко снижает способность к растяжению клеточных стенок как из стареющих, так и из свежесрезанных колеоптилей (рис. 4).
С помощью метода крипа нам удалось показать, что пероксид водорода действительно оказывает прямое влияние на растяжимость клеточной стенки, и может изменять
ее способность растягиваться при подкислении среды. Полученные результаты подтверждают участие Н202 в окислительных реакциях протекающих в апопласте, в результате которых изменяются механические свойства клеточных стенок.
Поскольку процессы ужесточения клеточной стенки при старении усиливаются, а первым признаком такого процесса является снижение эластической растянутости клеточных стенок (см. рис. 2), следовательно, можно ожидать, что и в апопласте стареющих колеопти-лей должны происходить изменения в отношении содержания пероксида водорода и активности растворимых и ионносвязанных с полисахаридами клеточных стенок пероксидаз.
Мы проанализировали изменение при старении концентрации Н202 и активности пероксидаз в апопластной жидкости, выделенной из колеоптилей методом инфильтрации с последующим центрифугированием. Извлекаемая жидкость не была загрязнена цитоплазмой, так как в ней практически не обнаруживалась активность глюкозо-6-фосфатдегидро-геназы - маркера цитоплазматического загрязнения (таблица). При инфильтрации буферным раствором с солью (ЫаС1 0,3 моль/л) извлекалось вдвое больше жидкости, что очевидно связано с осмотическим сжатием вакуолей и переходом воды в клеточную стенку. С солью извлекались пероксидазы, ионносвязанные с полимерами клеточных стенок.
Некоторые характеристики раствора, выделяемого из клеточных стенок колеоптилей кукурузы методом инфильтрации с последующим низкоскоростным центрифугированием
Условия выделения Активность глюко-6-фосфатдегидрогеназы Активность пероксидаз Объем извлекаемого раствора
% от гомогената
Инфильтрация 10 ммоль/л ацетатным буфером (рН 6,0) 0,03-0,05 2 6
Инфильтрация тем же буфером, содержащим 0,3 моль/л КаС1 0.03-0.05 15 14
Е590 —д— д [(без каталазы)-(с каталазой)]
Время, с
Рис. 5. Кинетика ферментативной реакции, использованной для определения содержания перекиси водорода в апопласте колеоптилей кукурузы.
Содержание Н202 в апопластном растворе определяли по развитию окраски в реакции окисления фенолов. Зависимость развития окраски от количества пероксида водорода в пробе подтверждали тем, что окраска не развивалась, если пробу предварительно обработать каталазой (рис. 5). Используя этот метод, мы показали, что при старении колеоптилей в апопласте в два раза возрастает количество Н202 (3,1±0,38 нмоль/г сырой массы, тогда как в контроле 1,5±0,17 нмоль/г сырой массы).
Участие перексида водорода в ужесточении клеточной стенки, объясняется тем, что Н202 является субстратом пероксидаз. Подтверждением этого может служить значительное увеличение активности пероксидаз у стареющих колеоптилей (рис. 6). Особенно сильно, более чем в три раза, возрастала активность пероксидаз, ионносвязанных с полимерами клеточных стенок.
20 -
15 -
10 -
о Q-Ф
т
□ Свежесрезанные колеоптили
Щ Стареющие колеоптили
В гомогенате Растворимые Ионносвязанные пероксидазы пероксидазы апопласта апопласта
Рис. б. Увеличение пероксидазной активности в гомогенате и в клеточных стенках при старении колеон-тилей кукурузы.
Таким образом, представленные результаты позволяют утверждать, что одной из причин снижения скорости роста растяжения при старении колеоптилей кукурузы является уменьшение растяжимости их клеточных стенок в результате окислительных процессов, катализируемых пероксидазами.
Статья рекомендована проф. С. С. Медведевым. Summary
Bilova Т. Е., Sharova Е. L The role of peroxidase reactions in reduction of cell wall extensibility in ageing maize coleoptiles.
Slowdown of elongation growth and auxin-mediated growth response observed in ageing maize coleoptiles are caused by de-creasing elastic and plastic cell wall extensibility. Hydrogen peroxide quantity and peroxidases activity increase in the apoplast of ageing coleoptiles.
Since cell wall elasticity in vitro decreases due to exogenous hydrogen peroxide in fresh cut coleoptiles, it is possible to assume that the reduction of cell wall extensibility is derived from the increasing of oxidative processes catalyzed by peroxidases. Reduction of cell wall extensibility is one of the causes of elongation growth velocity decreasing.
Литература
1. Ктиторова И. //., Скобелева О. В., Шарова Е. И., Ермаков Е. И. Перекись водорода как возможный посредник в снижении гидравлической проводимости корней пшеницы при солевом стрессе /7 Физиол. растений. 2002. Т. 49. С. 1-13. 2. Полевой В. В. Роль ауксина в системах регуляции у растений. Л., 1986. 3. Шарова Е. И. Клеточная стенка растений. СПб., 2004. 4. Шарова Е. И., Полевой В. В. Изучение взаимосвязи «кислого» и индуцируемого ауксином роста у отрезков колеоптилей кукурузы // Вестн. Ленингр. ун-та. Сер. биол. 1985. Вып. 4. С. 56-63. 5. Шарова Е. И., Полевой В. В. Изучение ростовой реакции свежесрезанных и стареющих отрезков колеоптилей кукурузы на ауксин
и кислый буфер// Вести. Ленингр. ун-та. Сер. биол. 1982. Вып. 3. С. 82-86. 6. Bestwick С. S., Brown /. R., Mansfield J. W. Localized changes in peroxidase activity accompany hydrogen peroxide generation during the development of a nonhost hypersensitive reaction in lettuce// Plant Physiol. 1998. Vol. 118. P. 1067-1078. 7. Cosgrove D. J. Enzymes and other agents that enhance cell wall extensibility // Ann. Rew. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1999. Vol. 50. P. 391-417. 8. Fry S. С Oxidative scission of plant cell wall polysaccharides by ascorbate-induced hyroxyl radicals // Biochem. J. 1998. Vol. 332. P. 507-515. 9. HohIM.. Greiner H., Schopfer P. The cryptic-growth response of maize coleoptiles and its relationship to H20:-dependent cell wall stiffening // Physiol. Plant. 1995. Vol.94. P. 491-498. 10. Peters W. S„ Farm M.S., Kopf J. Does growth correlate with turgor-induced elastic strain in stems? A re-evaluation of de Vries' classical experiments // Plant Physiol. 2001. Vol. 125. P. 2173-2179. 11 .RayleD.L, ClelandR. E. The acid growth theory of auxin-induced cell elongation is alive and well // Plant Physiol. 1992. Vol. 99. P. 1271-1274. 12. Schopfer P. Hydrogen peroxide-mediated cell-wall stiffening in vitro in maize coleoptiles // Planta. 1996. Vol. 199. P. 43-49. 13. Sharova E. I. Cell wall extensibility changes by hormonal and non-hormonal factors // Phytohormones in plant biotechnology and agriculture / Ed. by I. Machaikova, G. A. Romanov. Dordrecht, 2003. P. 185-191. 14. Veljovic-Jovanovic S., Noctor G., Foyer С. H. Are leaf hydrogen peroxide concentrations commonly overestimated? The potential influence of artefactual interference by tissue pheno-lics and ascorbate // Plant Physiol. Biochem. 2002. Vol. 40. P. 501 507. 15. Whitney S. E. C., Gidley M. J.. McQueen-Mason S. J. Probing expansin action using cellulose/hemicellulose composites // Plant J. 2000. Vol. 22, N4. P. 327-334.
Статья поступила в редакцию 1 декабря 2005 г.
