CC BY
91
Сер. 3. 2008. Вып. 3
ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ
УКД 581.1
И. С. Саматова, Е. И. Шарова, С. М. Щипарев, Т. А. Гавриленко, С. С. Медведев
ДИНАМИКА ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ И БИОХИМИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ МИКРОРАСТЕНИЙ ЕЖЕВИКИ ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ ХРАНЕНИИ IN VITRO*
Длительное поддержание коллекций генбанков в естественных условиях среды способствует накоплению в растениях заболеваний и вредителей, в результате чего происходит потеря образцов. Практическое решение проблемы состоит в сохранении коллекций в контролируемых условиях среды на основе использования современных технологий. В лаборатории биотехнологии ВНИИР им. Н. И. Вавилова в условиях in vitro поддерживается коллекция видов и сортов рода Rubus, составляющая 120 образцов. Для поддержания больших коллекций микрорастений необходимо разрабатывать эффективные и низкозатратные методы длительного in vitro хранения. Одним из подходов к решению данной проблемы является увеличение сроков беспересадочного хранения через замедление роста микрорастений при понижении температуры до +5 °С. Однако при хранении микрорастений в этих условиях низкая температура может действовать как стрессовый фактор для растения.
Ответы растения на стрессовые воздействия очень сложны, и в них вовлечено много метаболических путей. Концепция стресса разработана достаточно давно, однако проблема адаптации растительного организма к различным стрессовым факторам остается до конца не изученной. Температурное воздействие является для растений одним из самых критических факторов внешней среды. Низкие температуры, т. е. все температуры ниже оптимума для рассматриваемого вида, затрагивают функционирование физиологических процессов и могут привести к сильным повреждениям или даже к гибели растения [35]. В настоящее время становится ясным, что механизмы устойчивости могут быть объяснены только через целостный подход, объединяющий физиологические, морфологические и биохимические исследования.
Особый интерес представляет выяснение роли ферментных систем в приспособлении к неблагоприятным условиям среды. Во многих работах было показано участие некоторых ферментов окислительного метаболизма в адаптации к стрессовым условиям [28, 29]. В настоящее время известна роль пероксидаз в реакции растительного организма в ответ на стрессовые факторы, так как они являются ферментами, участвующими во многих адаптивных реакциях [28].
* Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 05-04-49619) и Bioversity International / Vavilov Genebank / LoA (грант № 07/053).
© И. С. Саматова, Е. И. Шарова, С. М. Щипарев, Т. А. Гавриленко, С. С. Медведев, 2008
Один из ранних ответов растений на стрессовое воздействие — синтез активных форм кислорода (АФК), в том числе и Н2О2. Синтезированная таким образом Н2О2 вовлечена как в локальные реакции (индукция антиоксидантной защиты), так и в поздние защитные реакции в ходе процесса, известного как систематическая приобретенная устойчивость [8-Ю, 22]. Способность приспосабливаться к окружающей среде является мерой пластичности растения и варьирует среди разных видов.
Цель настоящей работы — изучение физиологических и биохимических процессов при длительном хранении in vitro для разработки методов мониторинга и торможения старения микрорастений.
Материалы и методы исследования. Объектом исследования послужили микрорастения 5 сортов ежевики (Rubus eubatus): Whitfort Thornless (И-576516), Merton Thornless (И-581143), Silvan (H-57651Q), Bodega Bay (И-576483), Агавам из in vitro коллекции ВНИИР им. Н. Н. Вавилова.
Перед постановкой на длительное хранение было проведено размножение коллекционных микрорастений ежевики путем их черенкования в стерильных условиях. Из одного микрорастения получали до 1Q черенков (высотой 5-7 мм), содержащих часть стебля, узел и боковую почку, лист при этом удаляли. Затем черенки высаживали в стеклянные пробирки объемом 5Q мл на среду Мурасиге-Скуга (МС) [3Q] с добавлением цитокинина (бензиламинопурин, 1 мг/л).
Через 1Q-14 дней из почки микрочеренка образовывалось несколько боковых побегов, которые при достижении ими длины примерно 5 мм, отделяли и пересаживали на питательную среду МС, дополненную ауксином ИУК (Q,4 мг/л), для их дальнейшего роста и укоренения.
Когда через 3-4 недели полученные микрорастения достигали высоты 3Q-4Q мм, их обрезали у основания и пересаживали в стеклянные пробирки, содержащие по 1Q мл питательной среды МС с половинным составом макро- и микроэлементов. Примерно через 2 недели происходило укоренение побегов и развитие листового аппарата микрорастений. На всех этапах работы с микрорастениями использовали фотопериод длинного дня (16 ч освещения и 8 ч темноты) и температуру 2Q-23 “С на свету и 16-18 “С в темноте.
Для длительного хранения отбирали микрорастения, которые имели высоту 35-6Q мм, 8-15 листьев и хорошо сформированную корневую систему. Отобранные микрорастения в тех же пробирках переносили в условия длительного беспересадочного хранения (+5 “С, интенсивность освещения 5QQ-7QQ лк и фотопериод короткого дня — 8 ч освещения и 16 ч темноты).
Динамику изменения морфологических параметров пробирочных растений ежевики в процессе длительного хранения in vitro (+5 “С) анализировали через каждые 4 месяца по следующим морфологическим признакам: высота растений, количество корней, количество зеленых листьев, количество желтых листьев.
Контролем служили укорененные микрорастения ежевики, которые поддерживались при постоянной температуре +2Q “С. Всего для морфометрических измерений было использовано 2QQ-25Q растений из трех независимых пассажей.
Динамику изменения биохимических показателей сравнивали у контрольных растений и у микрорастений, хранящихся при температуре +5 “С. В каждом варианте опыта (контроль и микрорастения после 4, 8 и 12 месяцев хранения) листья in vitro растений взвешивали и фиксировали в жидком азоте; замороженную листовую ткань использовали для анализов. У контрольных микрорастений и у растений
4, 8 и 12 месяцев хранения анализировали следующие биохимические показатели: содержание пигментов (хлорофиллов a, b), свободного пролина, пероксида водорода, аскорбиновой кислоты, а также активность легкорастворимых и ионосвязанных пероксидаз. Полученные результаты рассчитывали на единицу сырой массы растений.
Содержание хлорофиллов а и b определяли фотометрическим методом [3]. Фиксированные в жидком азоте листья ежевики (1Q-3Q мг) гомогенизировали в фарфоровой ступке с 96 %о-ным этанолом, и гомогенат фильтровали с использованием стеклянного фильтра Шотта, мерных пробирок, колбы Бунзена и водоструйного насоса. Осадок в ступке и на фильтре промывали до обесцвечивания небольшими порциями этанола и им же доводили объем раствора в пробирке до 5 мл. Измерение концентрации спиртовых экстрактов хлорофиллов проводили на спектрофотометре (СФ-46; ЛОМО) при длине волны максимального поглощения хлорофиллов а и b (X = 618 нм и X = 664 нм соответственно). Для определения концентрации (С) пигментов в пробе использовали следующие формулы:
Схл.а = 9,9З • Е664 - Q,777 • Е618;
Схл.6 = 17,6 • Е618 - 2,81 • Е664; [1].
Схл.а+Ь = 7,12 ^ Е664 + 16,8 ^ Е618.
Концентрацию пигментов в тканях листьев ежевики рассчитывали в миллиграммах на 1 г сырой
массы.
Для определения содержания свободного пролина использовали модифицированную методику С. Л. Бутса [6]. Метод основан на взаимодействии свободного пролина с нингидриновым реактивом, образующим розово-красную окраску.
Навеску листовой ткани ежевики (^Q^QQ мг) гомогенизировали в 1Q мл З %-ного раствора сульфосалициловой кислоты. Гомогенат центрифугировали на настольной центрифуге при 9QQQ об./мин в течение 1Q мин. К 2 мл супернатанта в реакционной пробирке добавляли 2 мл нингидринового реактива и 2 мл ледяной уксусной кислоты. Пробирки закрывали пробкой с обратным холодильником и выдерживали 1 ч на кипящей водяной бане. Затем пробы охлаждали до комнатной температуры, прибавляли к ним по 4 мл толуола и тщательно перемешивали встряхиванием. Верхний слой толуола, содержащий окрашенный комплекс пролин-нингидрин, отделяли от водной фазы, и колориметрировали на ФЭК-56-М при 49Q нм в З-миллиметровых кюветах.
Содержание свободного пролина определяли по калибровочной кривой, построенной с использованием растворов пролина в диапазоне концентраций от 5Q до 15Q мкг/мл и выражали в микрограммах на 1 г сырой массы.
Для определения содержания пероксида водорода замороженные листья QQ^Q мг) растирали с кварцевым песком в 1 мл Q,4 М HClO4, с добавлением 1Q-2Q мг сорбента нерастворимых фенольных соединений поливинилполипирролидона. Экстракт отделяли центрифугированием (15 мин при 2QQQ g) и нейтрализовали добавлением Q^2 мл 1 N KOH. Квоту экстракта (Q,5 мл) наносили на колонку объемом 4 мл с анионообменной смолой (Dowex Cl-, 1x2, 5Q-1QQ mesh) и элюировали бидистиллированной водой. Спустив первые 2 мл элюата, собирали четыре порции по 1,5 мл, в которых определяли содержание Н2О2 по методу FOX [14, 19]. Этот метод основан на изменении окраски ксиленового оранжевого при окислении пероксидом водорода Fe2+ в Fe^ в растворе разбавленной серной кислоты. С Fe^ связывается краситель ксиленовый оранжевый, образуя комплекс с максимумом поглощения при 56Q нм. К пробе (1,5 мл) добавляли равный объем FOX-реагента. Интенсивность окрашивания измеряли через 45 мин при 56Q нм на СФ-46 (ЛОМО). Концентрацию Н2О2 в пробе рассчитывали по калибровочной кривой, построенной с использованием растворов Н2О2 (1Q-4Q мкМ) в хлорной кислоте, подверженных такой же, как проба, процедуре очистки на анионообменной колонке.
Активность легкорастворимых и ионосвязанных с клеточными стенками пероксидаз определяли по скорости окисления гваякола по стандартной методике [2З]. Всю процедуру экстракции пероксидаз проводили при Q...+4 “С. Замороженные в жидком азоте листья ежевики QQ^Q мг) растирали с кварцевым песком в 1,5 мл К-фосфат-цитратного буфера (1Q мМ, рН 6,Q) с добавлением 1Q-2Q мг сорбента фенольных соединений поливинилполипирролидона. Экстракт, содержащий растворимые, в основном вокуолярные пероксидазы, отделяли центрифугированием (1Q мин 2QQQ g) и очищали от мешающих определению пероксидазной активности низкомолекулярных соединений (смол, аскорбиновой кислоты) пропусканием через колонку сефадекса G-25. Для этого 1 мл экстракта наносили на колонку объемом 4 мл и проводили элюцию экстрагирующим буфером. Пероксидазы обнаружили во 2-м и З-м миллилитрах элюата.
Для выделения ионосвязанных с клеточными стенками пероксидаз осадок промывали в 5 мл экстрагирующего буфера, содержащего Q,2 % детергента тритона X-1QQ, очищая клеточные стенки от мембранных компонентов. Супернатант отделяли центрифугированием (1Q мин 2QQQ g) и отбрасывали. Затем осадок промывали в 5 мл экстрагирующего буфера при тех же условиях центрифугирования. Ионосвязанные пероксидазы экстрагировали из промытого осадка посредством 30-минутной инкубации в 1 мл 1 М NaCl, экстракт отделяли центрифугированием (1Q мин 4QQQ g).
Активность пероксидаз определяли в реакционной смеси объемом З мл, содержащей 1QQ мМ ацетатного буфера рН 5, 2Q мМ гваякола, 4 мМ пероксида водорода. Реакцию проводили при комнатной температуре. Пероксидазную активность оценивали по скорости образования продукта реакции тетрагваякола (є47онм = Q,Q266 мкМ^-см-1) на линейном участке реакционной кривой (2-я мин реакции) и рассчитывали на 1 г сырой массы, измеряя каждые Q,5 мин интенсивность окраски на СФ-46.
Содержание восстановленной аскорбиновой кислоты определяли методом, основанным на взаимодействии окисленной аскорбиновой кислоты с 2,4-динитрофенилгидразином (метод Roe и Kuether) [З1]. Замороженные листья ежевики (10-З0 мг) растирали с кварцевым песком в 2 мл 5 %-ной метафосфорной кислоты, затем центрифугировали 15 мин при 7000 g. Надосадочную жидкость отмеривали по 0,9 мл в две пробирки и в одну из них прибавляли по каплям 0,001 н. раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола (краска Тиль-манса) до появления слабо-розового окрашивания, устойчивого в течение З0 с. В обе пробирки добавляли по 0,З мл 2 %-ного раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 9 н. H2SO4, содержащего 0,25 % тиомочевины. Затем доводили объем до 1,5 мл бидистиллированной водой, кипятили 10 мин с обратным холодильником и охлаждали в ледяной бане. В каждую пробирку добавляли порциями 1,5 мл 85 %-ного раствора H2SO4, охлаждая в ледяной бане после каждой порции. Окрашенные растворы фотометрировали на спектрофотометре через 1 ч при 520 нм. Концентрацию восстановленной аскорбиновой кислоты определяли по разности экстинкции двух проб (±2,6-дихлорфенолиндофенола) с использованием калибровочной кривой, построенной для растворов с концентрацией аскорбиновой кислоты в диапазоне от 5 до 20 мг/л.
Биохимические анализы повторяли 10 раз. На рисунках и в таблицах приведены стандартные ошибки средних.
В работе применялись реактивы: Triton X-100 («Merch», Германия), гваякол, 2,6-дихлорфе-нолиндофенол («Fluka»); Sephadex G-25 («Uppsala», Швеция); Dowex mesh 50-100, D-сорбитол («Sigma», США), тиомочевина (квалификации ч.д.а.), ксиленовый оранжевый, метафосфорная кислота, ортофосфорная кислота, 2,4-динитрофенилгидразин (ч.) («Вектон», Россия), пероксид водорода, хлорная кислота (х.ч.) («Реактив», Россия), сульфосалициловая кислота (ч.д.а.), нингидрин (х.ч.), аскорбиновая кислота, натрий уксуснокислый, ледяная уксусная кислота, толуол, пролин, NaCl, H2SO4, (NH4)2SO4, KH2PO4, FeSO4x7H2O (х.ч.) и другие реактивы российского производства («Реактив»).
Результаты исследования и их обсуждение. На первом этапе работы анализировались рост и развитие пробирочных растений ежевики в условиях длительного хранения при температуре +5 °С и в контроле при +20 °С. На рис. 1 представлен рост растений ежевики
при разных температурах (+5 °С и +20 °С). Из рисунка видно, что в течение 12-месяцев хранения происходит увеличение высоты растений при температуре +5 °С от 41,4 ± 1,5 мм до 91,9 ± 4,0 мм, а при температуре +20 °С от 46,0 ± 1,8 мм до 102,9 ± 4,6 мм.
В течение этого периода хранения происходило увеличение количества корней при температуре +5 °С в среднем от 5 до 10 на микрорастение, а при температуре +20 °С в среднем от З до 2З (рис. 2). То есть количество сформировавшихся корней при температуре +20 °С было в 2-З раза больше, чем при температуре +5 °С.
На рис. З показано количество пробирочных растений, выживших после хранения 12 месяцев при температурах +20 °С и +5 °С. Из рис. З видно, что через 8 месяцев начинается гибель растений, находящихся при температуре +20 °С, а через 12 месяцев количество выживших в этих условиях растений составляет только 67 % от исходных. Иная картина наблюдалась в случае хранения растений при температуре +5 °С — после
12
Время, месяцы
Рис. 1. Рост микрорастений ежевики в процессе хранения при +5 °С и +20 °С
25
1 5 ° С
20 і 1 ю о ° С
Корни 05 \ \ \
/
5
0
8 12
Время,, месяцы
Рис. 2. Изменение количества корней микрорастений ежевики в процессе хранения при +5 °С и +20 °С
хранения 12 месяцев в этих условиях выживали до 98 % растений ежевики!
На рис. 4 представлена динамика формирования листьев микрорастениями ежевики (учитывали общее количество листьев на растение). Из рис. 4 видно, что при температуре +20 °С происходит постепенное повышение общего количества листьев в среднем от 7 до 36 на микрорастение. Аналогичная картина наблюдалась при хранении растений при температуре +5°С. Количество листьев при +5 °С увеличивалось в среднем от 11 до 23.
Однако более внимательный анализ сформировавшихся листьев показал, что в процессе хранения при температуре +20 °С количество зеленых листьев повышается только в течение первых 8 месяцев хранения: в среднем от 7 до 18 (рис. 5). Затем количество сформировавшихся зеленых листьев снижается в среднем до 14. При температуре +5 °С количество зеленых листьев практически не изменялось в течение всего хранения (12 месяцев) (см. рис. 5). В период хранения окраска листьев менялась. Наряду с зелеными появлялись и желтые листья. Количество желтых листьев у микрорастений, хранящихся при температуре +5 °С увеличивалось от 0 до 9 (рис. 6). То есть в процессе длительного хранения пробирочных растений, по-видимому, происходит разрушение хлорофиллов в формирующихся листьях ежевики. Еще более резкие изменения окраски листьев наблюдались в процессе хранения микрорастений при температуре +20 °С. Пожелтение листьев ежевики при этой температуре начиналось уже после 4 месяцев хранения, а в конце хранения (12 месяцев) количество пожелтевших листьев составляло в среднем 22 листа на микрорастение, сохраняемое при +20 °С (см. рис. 6). Таким образом, несмотря на то, что в процессе хранения растений ежевики происходит увеличение листовой поверхности, этот процесс не сопровождается возрастанием содержания хлорофилла.
S « Q к
то щ
й и
5 н
80
60
40 & 20
0
20 °С
4
а 5 °С
12
Время, месяцы
Рис. 3. Выживаемость микрорастений ежевики (%) в процессе длительного хранения in vitro при +5 °С и +20 °С
Время,, месяцы Рис. 4. Изменение общего количества листьев микрорастений ежевики в процессе хранения при +5 °С и +20 °С
я
.4
Н
с
К
Время,, месяцы
Рис. 5. Изменение количества зеленых листьев микрорастений ежевики в процессе хранения при +5 °С и +20 °С
я
.4
Н
с
я
ч
Рис. 6. Изменение количества желтых листьев микрорастений ежевики в процессе хранения при +5 °С и +20 °С
0 4 8 Время, месяцы
Рис. 7. Динамика содержания хлорофиллов в листьях микрорастений ежевики при длительном
хранении in vitro при +5 °С
На рис. 7 отражена динамика содержания хлорофиллов а и b в листьях ежевики в процессе длительного хранения при температуре +5 °С. Через 8 месяцев хранения растений содержание хлорофиллов снизилось от 2,9 до 2,0 мг/г сырой массы. Этот факт можно объяснить тем, что условия хранения растений ежевики в пробирках не зависимо от температуры являются стрессовыми. Такое стрессовое воздействие может приводить или к разрушению уже синтезированных молекул хлорофилла, или ингибировать процессы синтеза этого пигмента. Существенной разницы между содержанием хлорофиллов а и b в листьях верхнего и нижнего ярусов растений ежевики не наблюдалось (табл. 1)
Таблица 1
Сравнение содержания хлорофиллов а и Ь в листьях верхнего и нижнего ярусов растений ежевики (мг/г сырой массы)
Листья Содержание 0-й месяц (контроль) 4-й месяц хранения 8-й месяц хранения
Верхние хлорофиллов а 2,2±0,2 1,9±0,3 1,6±0,1
хлорофиллов Ь 0,6±0,1 0,5±0,1 0,5±0,1
хлорофиллов а и Ь 2,8±0,2 2,3±0,2 2,2±0,2
Нижние хлорофиллов а 2,5±0,3 1,9±0,2 1,5±0,2
хлорофиллов Ь 0,5±0,1 0,3±0,0 0,4±0,0
хлорофиллов а и Ь 2,9±0,3 2,2±0,2 1,8±0,3
Известно, что в стрессовых ситуациях в растениях в больших количествах образуются вещества, которые служат индикаторами неблагополучного состояния растений. Одним из таких веществ является пролин. В нормальных условиях содержание пролина в растениях очень низкое. Однако оно резко повышается при действии на растения различных стрессовых факторов [17]. Таковыми могут быть, кроме засухи, засоление и низкие температуры [2, 5]. Поэтому, чтобы определить, влияют ли условия хранения на растения как стрессовый фактор, анализировалось содержание свободного пролина в процессе хранения растений ежевики при температуре +5 °С. На рис. 8 показано, что на начальных этапах хранения содержание пролина значительно повышается от 0,9 до 1,7 мг/г, но затем
снижается до 0,6 мг/г. Повышение содержания свободного пролина в растениях ежевики при температуре +5 °С, по-видимому, является результатом ответной реакции растений ежевики на низкотемпературный стресс.
Дальнейшее снижение содержания пролина, которое наблюдается после 8 месяцев хранения, можно объяснить двумя причинами. Во-первых, после того, как растение приобретает устойчивость к низкотемпературному стрессу, пролин, вероятно, перестает интенсивно образовываться.
Во-вторых, при более длительном воздействии низких температур растения ежевики, возможно, не способны проявлять устойчивость к стрессовым воздействиям, и образование пролина прекращается. Это может быть связано с истощением питательной среды в пробирках выращиваемых растений и изменением газового состава. При стрессовых условиях пролин накапливается, только если ткань достаточно снабжается кислородом и располагает достаточным количеством субстрата [2].
Практически все стрессовые воздействия в растительных организмах сопровождаются генерацией активных форм кислорода (АФК) [4]. Поэтому в данной работе было проанализировано изменение динамики уровня пероксида водорода, аскорбиновой кислоты и активности пероксидаз в растениях ежевики в процессе длительного хранения.
Было показано, что в листьях растений, хранящихся длительное время при низкой температуре, уровень Н2О2 не меняется в течение первых 4 месяцев (1,3±0,1 мкМ/г сырой массы) и затем постепенно возрастает, достигая 3,8 ± 0,3 мкМ/г сырой массы через 12 месяцев хранения (рис. 9).
В литературе встречаются данные о том, что чувствительность к низкой температуре у растений также тканеспецифична, и эти различия в ответе могут быть частично связаны, с положением органа [20]. В проведенном исследовании было обнаружено, что уровень Н2О2 в листьях верхнего яруса выше, чем в листьях нижнего яруса, во всех сроках хранения. Эти различия выражены наиболее ярко через 8 месяцев хранения (табл. 2).
Известно, что стрессовые факторы могут индуцировать появление новых изоформ пероксидаз [28, 29]. В данной работе было показано, что активность пероксидаз в листьях ежевики резко повышается через 4-8 месяцев хранения (от 10-20 до 50,3 мкМ/(мин-г) сырой массы) и затем начинает снижаться, уменьшаясь до 30-35 мкМ/(мин-г) сырой массы
0 4 8 12
Время, месяцы
Рис.8 . Динамика содержания свободного пролина в микрорастениях ежевики при длительном хранении in vitro при +5 °С
4,5
0 4 8 12
Время,, месяцы
Рис. 9. Динамика содержания пероксида водорода в листьях микрорастений ежевики при длительном хранении in vitro при +5 °С
через 12 месяцев хранения (рис. 10). Вероятно, в начальный период хранения высокая активность перокси-даз способствовала поддержанию содержания Н2О2 на низком уровне. Отдельные измерения активности легкорастворимых и ионосвязанных пероксидаз показали, что легкорастворимые пероксидазы проявляют в 5-15 раз более низкую активность по сравнению с активностью ионосвязанных пероксидаз. Это означает, что основное количество пероксидаз, вероятно, связано с клеточными стенками. Также было отмечено, что активность фермента в листьях нижнего яруса вдвое выше, чем в листьях верхнего. Это объясняется тем, что активность пероксидаз повышается по мере диф-ференцировки клеток [18, 24].
Литературные данные и результаты нашей работы позволяют предположить, что активность пероксидаз в растениях ежевики повышается под воздействием пониженных температур, которые стимулируют адаптивный ответ организма на стресс. Понижение активности пероксидаз в листьях ежевики при более длительном хранении в условиях низких температур, возможно, связано с естественным старением растений. К тому же пероксидазы могут быстро инактивироваться при большой концентрации пероксида водорода [36]. Поэтому гваякол-пероксидазы, а также компоненты аскорбат-глутатионового пути, вероятно, не способны справляться длительное время с избыточным образованием Н2О2. В условиях стресса, который ослабляет синтез белков, например при низкой температуре, может наблюдаться уменьшение содержания фермента и его активности [15]. Необходим постоянный синтез белков, чтобы поддержать активность ферментов — в условиях, когда распад превосходит синтез и активность ферментов может уменьшиться [11].
Пероксидазы — это основные компоненты, утилизирующие Н2О2 в листьях. В литературе имеются данные, что между активностью фермента и концентрацией Н2О2 существует обратно пропорциональная зависимость [13]. Пероксидазы могут перерабатывать Н2О2, образующийся в фотосинтетической цепочке транспорта электронов. Но, возможно, что небольшое количество пероксидаз просто не может поддержать достаточно низкий уровень Н2О2 в листьях растений [29]. Вероятно, по этой причине происходит повышение уровня пероксида водорода в листьях микрорастений ежевики при длительном хранении.
Когда АФК накапливаются, они являются причиной пероксидации липидов, повреждения ДНК и денатурации белков [32] и, следовательно, потери целостности мембран. Пероксид водорода также взаимодействует с другими сигнальными системами, например, гормонами и вторичными посредниками как ионы Са2+ [32], что тоже объясняет влияние Н2О2 на ростовые процессы. В растениях пероксид водорода регулирует рост клеток растяжением, уменьшая растяжимость клеточных стенок за счет окислительных сшивок
Таблица 2
Динамика содержания пероксида водорода в листьях верхнего и нижнего ярусов растений ежевики (мкМ/г сырой массы)
Листья 0-й месяц (контроль) 4-й месяц 8-й месяц 12-й месяц
Верхние 1,5±0,3 1,5±0,1 3,1±0,6 3,4±0,4
Нижние 1,2±0,2 1,2±0,1 1,9±0,4 2,7±0,4
400 350 300 250 ' 200 150 100 50 0
0 4 8 12
Время, месяцы
Рис. 10. Динамика активности пероксидаз в листьях микрорастений ежевики при длительном хранении in vitro при +5 °С
гликопротеинов клеточной стенки и полисахаридов, которые образуются при участии пероксидаз [12, 16, 33]. Пероксид водорода резко снижает растяжимость клеточных стенок колеоптилей кукурузы in vitro [21]. Предполагается, что торможение растяжения клеточных стенок вызывается формированием в присутствии пероксида водорода водородных связей между полимерами клеточных стенок.
Пероксидазы клеточных стенок катализируют образование окислительных связей между остатками фенольных соединений в составе белков, гемицеллюлоз и пектинов клеточных стенок [25]. Для активности фермента и скорости роста характерна обратная корреляция. Например, в зоне растяжения листьев злаков увеличение активности пероксидаз стимулирует снижение скорости роста клеток [24]. В условиях низких температур рост микрорастений ежевики происходил медленно с самого начала хранения, в то время как рост контрольных растений, выращенных при +20 °С, осуществлялся интенсивней именно на первых этапах хранения. Причиной торможения роста растений ежевики при низких температурах может быть как высокая активность пероксидаз (см. рис. 1, 10), так и низкий уровень содержания пероксида водорода (см. рис. 1, 9). У многих растений активность пероксидаз постепенно увеличивается не только по мере роста, но и при дифференциров-ке клеток [18, 24]. Вполне вероятно, что изменения активности пероксидаз и содержания пероксида водорода при хранении растений ежевики в условиях низких температур также могли повлиять на замедление процесса образования новых листьев (см. рис. 4, 10).
Еще одним очень важным компонентом в ответных реакциях растений на различные стрессовые факторы является аскорбиновая кислота, которая присутствует в растениях в концентрациях от 300 мМ в хлоропластах стромы до 20 мМ в других тканях [26, 34]. Несмотря на такой широкий диапазон концентраций, количество аскорбиновой кислоты строго контролируется.
Результаты наших исследований показали, что содержание аскорбиновой кислоты в листьях ежевики к концу 8-го месяца хранения очень резко снижается: от 0,7 до 0,03 мг/г сырой массы (рис.11). В то же время отличий в ее содержании в листьях верхних и нижних ярусов растений не наблюдалось. Резкое снижение уровня аскорбиновой кислоты в листьях ежевики при хранении в условиях низких температур, вероятно, связано с повышением активности пероксидаз (см. рис.
7, 8). Еще одной возможной причиной
снижения содержания восстановленной аскорбиновой кислоты в листьях ежевики при длительном хранении может быть ее окисление в дегидроаскорбиновую кислоту [7].
Summary
Samatova I.S., Sharova E.I., Shchiparyev S.M., Gavrilenko T.A., Medvedev S.S. Dynamics of physiological and biochemical parameters in blackberry plants under long-term in vitro preservation.
Growth, development, and also dynamics of the content of chlorophylls, free proline, hydrogen peroxide, an ascorbic acid, and peroxidase activity of blackberry microplants have been investigated under a long-term in vitro preservation. It is established, that during storage at temperature +5°С the safety of microplants is higher,
0 4 8
Время,, мессяцы
Рис. 11. Динамика содержания восстановленной аскорбиновой кислоты в листьях микрорастений ежевики при длительном хранении in vitro при +5 °С
than at temperature 20°С. Conditions of a long-term in vitro preservation promoted decrease in the content of chlorophylls, an ascorbic acid during all preservation, increase of quantity proline and peroxidase activity at the beginning of preservation and a level of hydrogen peroxide at final stages of storage.
E-mail: [email protected]
Литература
1. Васильева В. Е. Количественное определение пигментов // Методы биохимического анализа растений. Л., 1978. C. 97-99.
2. Гёринг Х. Реакция растений на влияние вредных физиологических и химических факторов окружающей среды // Матер. IX конгресса эукарпия. 1981. С. 23-35.
3. Миллер М. С., Савицкая Н. Н. Практические занятия по физиологии растений. 1974. С. 140-144.
4. Минибаева Ф. В. Активные формы кислорода и ионная проницаемость плазмалеммы в растительных клетках при стрессе: Докт. дис. СПб., 2005. 365 с.
5. Aspinall D., Paleg L. G. Proline accumulation physiological aspects // Physiology and Biochemistry of Drought Resistance in Plants. Sydney, 1981. P. 205.
6. Butes S. L., Wilderen R. P., Teany I. D. Rapid determination of free praline for water-stress studies // Plant and Soil. 1973. Vol. 39. P. 205-207.
7. Chen Z., Yong T. E., Ling J., Chang S-C., Galie D. R. Increasing vitamin C content of plants through anhanced ascorbate recycling // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. Vol. 100. P. 3525-3530.
8. Delledonne M., Xia Y., Dixon R. A., Lamb C. Nitric oxide function as a signal in plant disease resistance // Nature. 1998. Vol. 394. P. 585-588.
9. Draper J. Salicylate, superoxide synthesis and cell suicide in plant defence // Trends in Plant Science. 1997. Vol. 2. P. 162-165.
10. Durner J., Shah J., Klessig D. F. Salicylic acid and disease resistance in plants // Trends in Plant Science. 1997. Vol. 2. P 266-274.
11. Feierabend J., Engel S. Photoinactivation of catalase in vitro and in leaves // Archives of biochemistry and biophysics. 1986. Vol. 251. P. 567-576.
12. Fry S. C. Cross-linking of matrix polymer sin the growing cell walls of Angiosperms // Annu. Rev. Plant Physiol. 1986. Vol. 37. P. 165-186.
13. Fry S. C., Willis S. C. M., Paterson A. E. J. Intraprotoplasmic and wall-localised formation of ara-binoxylan-bound diferulates and larger ferulate coupling-products in maixe cell-suspension cultures // Planta. 2000. Vol. 211. P. 679-692.
14. Gay C., Gebicki J. M. A critical evaluation of the effect of sorbitol on the ferric-xylenol orange hydroperoxide assay // Anal. Biochem. 2000. Vol. 284. P. 217-220.
15. Hertwig B., Streb P., Feierabend J. Light dependence of catalase synthesis and degradation in leaves and the influence of interfering stress conditions // Plant Physiology. 1992. Vol. 100. P. 1547-1553.
16. Hohl M., Greiner H., Schopfer P. The cryptic growth response of maize coleoptiles and its relationship to H2O2 -dependent cell-wall stiffening // Physiology. Plant. 1995. Vol. 94. P. 491-498.
17. Ivanova A. Proline accumulation // Reaction von Planzen auf stress situationen / Ed. by Z. Wiss Dresden. 1982. Vol. 31. P. 273-275.
18. Jackson P., Ricardo C. The changing peroxidase polymorphism in Lupinus albus during vegetative development // Aust. J. Plant Phisiol. 1998. Vol. 25. P 261-269.
19. JiangZ. Y., WoollardA. C. S., Wolff S. P. Hydrogen peroxide production during experimental protein glycation // FEBS. 1990. Vol. 268, N1. P. 69-71.
20. Larcher W. Ecophysiology and Stress Physiology of functional Groups // Physiological Plant Ecology. New York; Berlin; Heidelberg., 1995. P. 321-327.
21. Layma K., Lam T., Stone B. Covalent cross-links in the cell wall // Plant Physiol. 1994. Vol. 104. P. 315-320.
22. Levine A., Tenhaken R., Dixon R. A., Lamb C. J. H2O2 from the oxidative burst orchestrates the plant
hypersensitive response // Cell. 1994. Vol. 79. P. 583-593. 2 2
23. Lin C. C., Kao C. H. NaCl induced changes in ionically bound peroxidase activity in roots of rice seedlings // Plant and Soil. 1999. Vol. 216. P. 147-153.
24.MacAdam J., Nelson C., SharpR. Peroxidase activity in the leaf elongation zone of tall fescue. Spatial distribution of ionically bound peroxidase activity in genotypes differing in length of the elongation zone // Plant Phisiol. 1992. Vol. 99. P. 872-878.
25. Murata N., Los D. A. Membrane fluidity and temperature perception // Plant Physiology. 1997. Vol. 115. P. 875-879.
26. Pallanca J. E., Smirnoff N. The contral of ascorbic acid synthesis and turnover in pea seedlings // J. Exp. Bot. 2000. Vol. 51. P. 669-674.
27. Pastori G.M., Foyer C.H. Common components, networks, and pathways of cross tolerance to stress. The central role of «redox» and abscisic acid-material controls // Plant Physiology. 2002. Vol. 129. P. G7460-G7468.
28. Prasad T. K., Anderson M. D., Stewart C. R. Localization and characterization of peroxidases in the mitochondria of chilling-acclimated maize seedlings // Plant Phisiology. 1995. Vol. 108. P. 1597-1605.
29. Puntarulo S., Galleano M., Sanchez R. A., Boveris A. Superoxide anion and hydrogen peroxide metabolism in soybean embryonic axes during germination // Biochim. et Biophys. Acta. 1991. Vol. 1074. P. 277-283.
30. Reed B. M. The in vitro genebank of temperate fruit and nut crops at the National Clonal Germplasm Repository — Corvallis // Management of Field and in vitro Germplasm collection. Cali (Colombia), 1996. P. 132-135.
31. Roe J. H., Khuether C. A. Methods biochem. Anal. // J. Biol. Chem. 1948. Vol. 174. P. 201.
32. Scandalios J. G., GuanL., PolidorosA. N. Catalases in plants: gene structure, properties, regulation, and expration // Oxidative stress and the molecular biology of antioxidant defenses / Ed. by J. G. Scandalios New York, 1997. P. 343-406.
33. Schopfer P. Hydrogen peroxide-mediated cell-wall stiffening in vitro in maize coleoptiles // Planta. 1996. Vol. 199. P. 43-49.
34. Smirnoff N. Ascorbic acid: metabolism and function of a multifaceted molecule // Curr. Opin. Plant Biol. 2000. Vol. 3. P 229-235.
35. Steponkus P. L., Uemura M., Webb M. S. A contrast of the cryostability of the plasma membrane of winter rye and spring oat. Two species that widely differ in their freezing tolerance and plasma membrane lipid composition // Advances in Low Temperature Biology. JAI Press. 1993. P 211-312.
36. Zhang H., Wang J., Nikel U., Allen R. D., Gudman H. M. Cloning and expression of an Arabidopsis gene encoding putative peroxisomal ascorbate peroxidase // Plant Mol. Biol. 1997. Vol. 34. P. 967-971.
