CC BY
63
УДК 543.432:664-404
Цветометрическое количественное определение аминокислот и глицилглицина
в водных растворах
О.В. Байдичева
Воронежский государственный университет
В.В. Хрипушин, канд. хим. наук
Воронежская государственная технологическая академия
Л.В. Рудакова, канд. хим. наук
Воронежская государственная медицинская академия
О.Б. Рудаков, д-р. хим. наук
Воронежский государственный архитектурно-строительный университет
Современная биотехнология немыслима без точного и быстрого входного и выходного контроля качества продукции, контроля технологических процессов в режиме онлайн. Большие возможности для реализации мониторинга качества продукции на всех этапах производства представляют цифровые технологии, включающие в алгоритм тес-
Ключевые слова: аминокислоты, глицилглицин; водные растворы; цветометрия; цветометрическое количественное определение.
Цвет биотехнологической продукции - одна из важнейших характеристик, включаемых в перечень контролируемых показателей в ГОСТы, ТУ, ТИ и другие нормативные документы.
тирования получение информации о цветности или морфологии анализируемой продукции, автоматическую обработку полученного изображения, его архивацию в электронном виде, экспертизу с помощью искусственных нейронных сетей или других экспертных систем и выдачу протокола о результатах измерений.
В последнее время метод цвето-метрии - науки о способах измерения цвета и его количественном выражении - все шире применяют в контроле качества пищевой продукции [1-3]. Толчок для активного внедрения этого метода в аналитическую практику вызван прогрессом цифровых технологий.
Цвет биотехнологической продукции - одна из важнейших характеристик, включаемых в перечень кон-
Key words: amino acids; glycyl-glycine; water solutions; color-metry; color-metric quantitative definition.
тролируемых показателей в ГОСТы, ТУ, ТИ и другие нормативные документы. В пищевой химии и биотехнологии для контроля качества продукции или обнаружения важных компонентов часто используют цветные реакции. Интенсивность окраски при этом определяют визуально экспертным путем. В лучшем случае цвет анализируемого образца сопоставляют с цветом стандартного образца или стандартного набора или шкалы. Таким образом, цвет служит качественным или полуколичественным аналитическим сигналом при контроле кондиционности пищевой продукции.
Глицин, Р-аланин, а-изолейцин и глицилглицин, фенилаланин взяли в качестве объектов анализа в связи, так как эти гетерофункциональные соединения обладают определенной физиологической активностью, либо входят в состав растительных и животных белков, либо могут применяться в качестве биоактивных добавок. Например, Р-аланин является продуктом промежуточного обмена аминокислот и входит в состав азотистых экстрактивных веществ скелетной мускулатуры (карнозин и анзерин, коэнзим аланина), а также является составляющей пантотено-
вой кислоты (витамина В5). Изолей-цин - незаменимая аминокислота, необходимая для формирования гемоглобина, стабилизирует и регулирует сахар в крови [4-5].
Цветные реакции применяют при контроле продукции в аминокислотных производствах. Цель работы -установление возможности использования цвета как количественного аналитического сигнала при регистрации цифровым фотоаппаратом цветного изображения растворов аминокислот, прореагировавших с цветообразующим реактивом.
В настоящее время существует несколько систем представления цвета для компьютерной обработки (так называемые цветовые модели) [6].
В графических системах наиболее широко применяют трехцветную цветовую схему RGB (red-green-blue, красный-зеленый-синий). Цвет определяют как точку в трехмерном цветовом пространстве в координатах трех базовых цветовых компонентов по формуле:
F = rR + gG + ЪВ,
где F ~ цветность вещества; г, д, Ь~ соответственно, доля красной, зеленой и голубой окраски; R,G,В ~ орты векторов красного, зеленого и голубого цветов.
Для описания цвета одного пикселя используют три байта, что дает (28)3 различных цветов (примерно 16 млн). При переходе к скалярным величинам цвет F определяют триплетом из кодов цветовых компонентов (r, g, b). Система RGB является аддитивной, так как цвета представляются сложением основных цветов с черным цветом (0,0,0). Базисный белый цвет оценивают как CW = (255, 255, 255), модельный красный цвет - как CR= (255, 0, 0), зеленый -как CG = (0, 255, 0), синий - как CB= (0, 0, 255), желтый цвет - как CY = (255, 255, 0) и т. д.
Аминокислоты проявляют характерные свойства при взаимодействии с ионами металлов. Образование хелатных комплексов с Cu2+, окрашенных в синий цвет, лежит в основе многих методов определения аминокислот [7]. Эту же реакцию дают дипептиды и полипептиды.
Для получения окрашенного раствора с целью количественного определения исследуемых веществ как с помощью функций отклика RGB, так и фотоколориметрически использовали приведенную ниже методику.
Реактивы. Раствор хлорида меди (II), раствор фосфатного буфера (64,5 г Nа2НРO4 и 7,2 г NaOH в 1 л
воды), боратный буфер (57,21 г №2В407-10Н20 и 100 мл 1М HCl в 2 л воды), суспензия ортофосфата меди (II), индикатор - тимолфталеин.
Ход определения. В мерную колбу вместимостью 25 мл пипеткой вносили аликвоту раствора аминокислоты, добавляли 2-3 капли раствора тимолфталеина и по каплям раствор NаОH до появления голубой окраски. К полученному раствору приливали суспензию ортофосфата меди, содержимое колбы доводили до метки водой, перемешивали и фильтровали. Затем анализируемым раствором заполняли стеклянные кюветы фотоколориметра оптической толщиной 30 мм.
Определение цветности проводили в специально сконструированном боксе, позволявшем стандартизировать условия освещения. Задняя стенка бокса представляла собой белый экран. В качестве источника света использовали две галогенных лампы общей мощностью 70 Вт, дающих свет, близкий по спектру к естественному освещению. Изображение образца с помощью оборачивающего зеркала направляли вверх в объектив цифровой фотокамеры, находящейся в верхней крышке бокса.
В работе использовали растворы аминокислот и глицилглицина концентрацией от 0,4 до 2,0 г/л. Для регистрации цифрового изображения выбрали цифровую фотокамеру (ЦФК) Olympus SP-500UZ (Япония), имеющую возможности ручного изменения параметров съемки.
Для анализа цветности растворов был создан пакет программ в среде MathCAD 11, позволяющий автоматически рассчитывать средние значения кодов цветности в выбранной области. В нем предусмотрен режим градуировки, позволяющий по данным цифровых изображений строить градуировочные зависимости яркостей каналов R, G и B от концентрации окрашенных компонентов, а также выбрать диапазон градуировки. На основе данных градуировки программа рассчитывает концентрации анализируемого вещества и метрологические характеристики (рис. 1).
На параметры цветности определенное влияние оказывает строение аминокислоты. Градуировки для разных образцов имеют отличающиеся величины эмпирических коэффициентов, а для растворов фенила-ланина цветная реакция с ионами меди вообще дает лишь слабое синее окрашивание, слабо зависящее от концентрации. Для этой аминокислоты данная цветная реакция не
TECHNICAL SUPPLY OF INDUSTRY
0,5 1
а
2 С, г/л
0,5 1
в
1,5 2 С, г/л
С, г/л
С, Г/л
Рис. 1. Градуировочные графики зависимости компонент цветности от концентрации водных растворов: глицина (а); в-аланина (б); изолейцина (в); глицилглицина (г), где Н - красная, в -зеленая, В - синяя компонента
б
г
может быть использована в качестве количественного аналитического сигнала (по-видимому, фенильный радикал препятствует образованию стабильного хелатного комплекса).
В зависимости от цвета анализируемого раствора и результатов построения градуировочных графиков предпочтение отдается калибровке по синей (В), зеленой (в) или красной (Ю компоненте. В нашем случае для определения концентрации аминокислот с помощью цветных реакций с ионами Си2+ наиболее подходящей для градуировки является зеленая компонента (в). В табл.1 показаны градуировочные зависимости величины F зеленой компоненты цветности (в) концентрации от С для водных растворов аминокислот (диапазон линейности 0-2 г/л), п=4-6, Р=0,95.
Сопоставим метрологические параметры определений методом цве-тометрии и фотоколориметрии. Пробоподготовка для этих методов идентична, поэтому измерения проводили параллельно.
Полученный прозрачный фильтрат фотометрировали при 1=640 нм в кюветах толщиной 30 мм. Контролем служила дистиллированная вода. Определения проводили на приборе КФК-3. На рис. 2 показана зависимость оптической плотности
Таблица 1
Вещество Градуировочный график R
Глицин у=(237,2±3,9)-(69,6±3,3)С 0,9956
ß-аланин у=(240,0±1,3)-(18,3±1,1)С 0,9931
Изолейцин у=(251,3±5,5)-(51,5±4,5)С 0,9847
Глицилглицин у=(237,6±14,0)-(74,9±9,4)С 0,9847
Преимущества применения цветометрии на базе цифровых технологий: экономичность, возможность сохранить первичную информацию в электронном виде и контролировать концентрированные растворы анализируемых образцов.
от концентрации растворов глицина, в-аланина, изолейцина и глицилглицина, в табл. 2 - градуировочные зависимости оптической плотности растворов D от концентрации С аминокислот (диапазон линейности 0-1,8 г/л), п=4-6, Р=0,95. Из полученных зависимостей видно, что при концентрациях изученных веществ выше 1,2-1,6 г/л оптическая плотность растворов D>1, что ограничивает применение метода фотометрии.
Параллельные опыты по количественному определению аминокис-
Таблица 2
Вещество Градуировочный график R
Глицин y = (0,755±0,061)С 0,9893
ß-аланин y = (0,316±0,027)С 0,9829
Изолейцин y = (0,557±0,025)С 0,9941
Глицилглицин y =(0,879±0,162)С 0,9741
лот в водных растворах разными методиками показали хорошую воспроизводимость.
Сравнение результатов цветомет-рического и фотометрического методов анализа дает основание считать, что цветометрия позволяет анализировать растворы аминокислот в более широком интервале концентраций (шире линейные диапазоны), чем фотометрическая методика. Цветометрическая методика практически не уступает по точности фото-электроколориметрической.
Преимущества применения цвето-метрии на базе цифровых технологий: экономичность, возможность сохранить первичную информацию в электронном виде и контролировать концентрированные растворы анализируемых образцов.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 06-08-00448-а «Разработка методов диагностики качества продукции по параметрам цветности с применением цифровых технологий».
ЛИТЕРАТУРА
1. Применение сканера и компьютерных программ цифровой обработки изображений для количественного определения сорбированных веществ/Ю.Л. Шишкин [и др.]// Журн. аналит. химии. - 2004. - Т. 59. - № 2.
2. Иванов, В.М. Химическая цвето-метрия: возможности метода, области применения и перспективы/В.М. Иванов, О.В. Кузнецова//Успехи химии. - 2001. - Т. 70. - № 5.
3. Хрипушин, В.В. Определение цветности растительных масел с применением цифровой фотографии/ В.В. Хрипушин, О.В. Байдичева, Л.В. Рудакова, О.Б. Рудаков//Масложиро-вая промышленность. - 2007. - № 2.
4. Глущенко, Н.Н. Фармацевтическая химия/Н.Н. Глущенко, Т.В. Пле-тенева, В.А. Попков. - М.: Изд. центр «Академия», 2004.
5. Биологически активные добавки к пище. Полная энциклопедия/Сост. Н.А. Натарова. - СПБ: ИД «Весь», 2001.
6. Шапиро, Л. Компьютерное зрение: пер.с англ./Л. Шапиро, Дж. Стокман. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2006.
nHwefiecH&f Роллтон предлагает: лагман за пять минут
В продаже появились «быстрые» обеды с восточным вкусом: яичная лапша Лагман с бараниной.
Линейка продуктов Роллтон «По-домашнему» пополнилась новинкой. Это лагман - знаменитое восточное блюдо, давно полюбившееся россиянам.
Лагман особенно популярен в странах Средней Азии. Его основа — длинная тонкая лапша, которую делают вручную. В лагман кладут мясо (как правило, это баранина), овощи и различные специи. Лагман — универсальное блюдо. В качестве лапши с подливой и сложной начинкой его подают на второе, а если добавить в него побольше бульона, получается суп. Выбрать, к какой категории отнести лагман, затрудняются сами повара. Варьировать состав блюда можно бесконечно - лагман позволяет дать волю фантазии. Сколько поваров, столько и
секретов его приготовления. Восток, как известно, дело тонкое.
А лапша — вкусное! ^ециалисты компании Mareven Food Central, которой принадлежит торговая марка Роллтон, изучили множество рецептов лагмана и создали блюдо с неповторимым ярким вкусом, напоминающем об искусстве восточных кулинаров. Яичная лапша в сочетании с бульоном-приправой и ароматной заправкой с натуральными овощами — великолепный сытный обед, особенно аппетитный благодаря целому букету специй. Неповторимый вкус и аромат блюда Роллтон «По-домашнему» Лагман сохраняет упаковка с двойным защитным барьером.
Чтобы отведать традиционный лагман, нужно запастись терпением: его готовят не менее 5 ч. Но с продуктами Роллтон «По-домашнему» долго ждать не придется - обед готов в течение пяти минут!
